Name: の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ大腸菌誘導性リジン脱炭酸酵素（LDC）活性測定の比色アッセイ法。L-リジン基質と酵素反応後、TNBS処理とトルエン抽出によりカダベリン生成物を分離し、340nm吸光度で定量します。酵素動態学研究に有用です。

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私たちは、私たち菌株、プラスミド、および必要なプロトコルを送信するための博士マイケルキャシェル（国立衛生研究所、ベセスダ、MA、米国）を感謝。我々はSpecraMaxプレートリーダーを使用するためにドクタージョングローバー（生化学部、トロント大学を）感謝。英国では、国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）大学院奨学金、疾病へのリンク膜タンパク質の構造生物学、およびトロントオープンフェローシップの大学における保健研究戦略的トレーニングプログラムのカナダの協会の受信者です。この作品は、カナダ衛生研究所（MOP - 67210）からWAHへの助成金によって支えられている。

1）試薬および器具<ol><li>最初に、以下の3つのソリューションを準備する：溶液1 mLの8ミリL -リジン、100 mMリン酸ナトリウム2で構成されている - （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）pH6.5で、ヌクレオチドが塩基0.2mMの、どちらか：グアノシン二リン酸（GDP）、グアノシン三リン酸（GTP）、グアノシン5' -二リン酸、3' -二リン酸（ppGppの）、または5' -三リン酸、3' -二リン酸（pppGpp）グアノシン、0.1mMのピリドキサール5' -リン酸（PLP）、および1mMβ-メルカプトエタノール/（β- ME）。 100mMの塩化ナトリウムMES pH6.5で、0.1mMのPLP、1mMのβ- ME、および50 nMのLdcIから成るソリューションBを1mL。スナイダーら 6 Kanjee らに説明したようにLdcIを精製した。14。 ソリューションBと同一だLdcIを含まない溶液Cの1mL。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて96穴ポリスチレンプレートの各ウェルに、1Mの炭酸ナトリウム（10.6 g/100 mL）に、アリコート50μLから成る反応停止液100 mLを準備する。プレートに水30μLを追加してから、カバーしています。水の体積の和が追加され、酵素反応の間に抽出されたサンプルの量が50μLに等しくなければならないことに注意してください。この場合、酵素反応の試料の20μLを削除されます。 </li><li>アルミホイルで4706μL水、ラップで5％の294μL（w / v）のTNBSの株式を希釈して10 mMのでTNBS溶液5mlを調製し、氷上に置きます。 </li><li>エッペンドルフのサーモスタットを平衡化するプラス37℃サーモスタットプラス6列の24個のウェルを持っている。回路図、図2を参照してください。 （列ごと）にテストされるヌクレオチドの同一性を示すラベル1.5mLのエッペンドルフチュー​​ブ：GTP（列）、GDP（列B）、ppGppの（列C）、pppGpp（列D）、無ヌクレオチド（カ​​ラムE ）、およびタンパク質サンプル（列F）。 </li><li>各代替行がヒントの4行の合計を与えて省略されているように、200μLのヒントのラックいくつかの箱。これは、酵素アッセイの間にサーモスタットプラスheatblockとマルチチャンネルのピペットを使用するために必要です。 </li><li> 42でデジタルHeatblock（VWR）を平衡℃に</li><li>冷却するために氷上で96ウェル2.0mLのポリプロピレン板を置きます。 </li></ol> 2）LdcIアッセイ<ol><li>エッペンドルフのサーモスタットの5つの列のそれぞれに1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに適切なヌクレオチドと溶液のアリコート50μL。 </li><li> F列の3本のチューブに溶液B 330μLを追加し、列Fの最後のチューブに溶液C（無タンパク質の制御）330μLを加える</li><li> 37ソリューションを平衡℃で5分間。ヒント：5分後、次に使用するマルチチャンネルピペットが干渉するのを防ぐために、加熱ブロックの中心にチューブのキャップを切断。 </li><li>列AEの各チューブに50から50μLVWRマルチチャンネルピペット、F列の管からの転送50μLを使用する。とすぐに最初のチューブが混ざっているようにタイマーを開始します。 </li><li> 2、4、6分でマルチチャンネルピペットを用いて試料の20μLを削除し、ワンストップソリューションに追加します。 </li><li>注：停止溶液中の試料をプラスチック覆いで覆われ、その後の処理のために-20℃で凍結することができます。プレートは、TNBSと反応させる前に室温で解凍してください。 </li></ol> 3）TNBSの反応と色の開発<ol><li> 6分間後、マルチチャンネルピペットと42℃でインキュベートCを使用して停止液に10mMのTNBS溶液50μLを追加。 TNBSは、リジンとカダベリンと反応するようなソリューションでは、暗い黄色/オレンジ色に変わります。 </li><li> 6分後、反応を遅らせるために氷の上でプレートを冷却する。 </li><li>氷上で冷却し、2 mLのディープウェルプレートでVWR 20〜200μLマルチチャンネルピペットと場所を使用してサンプル100μLを削除します。 fumehoodにアイスバケットを転送する。 </li><li>よくHandyStep（ブランド）リピートピペッターと12.5 mLのピペットチップ（Plastibrand）を使用して、それぞれにトルエン500μLを追加。 </li><li>キムワイプを使用して余分なトルエンを拭うと包装テープのストリップとプレートをカバーしています。良好なシールを得るためにしっかりと下に押してください。平らな蓋付き96ウェルプレートをカバーし、1分30秒間激しく振る。 </li><li> 5分のために解決するソリューションを残す。 TNP -リジンは、水溶性のまま、TNP -カダベリンは、（図1参照）、上部のトルエン相に入りました。 </li><li>読書のための96ウェルプレートに20〜200μLマルチチャンネルのピペットを用いてトルエン200μLを削除します。注意：削除する各サンプルが明確であり、下部水相のいずれかを持っていないことを確認してください。注：トルエンによるマルチチャンネルピペットへの損傷を防止するために使用するバリアヒント。 </li><li> SpectraMax 340プレートリーダーで340nmの吸光度を読み取る。 </li><li>石英板をクリーニングするには、水とトルエンを洗い落として、大規模で石英板を配置ドラフト内でガラス皿。 70％（v / v）の硝酸の午前7時03分混合物を100mLの上に注ぐ：95％（v / v）エタノールをし、第2のガラストレイを持つ石英プレートをカバーしています。警告：反応は非常に発熱し、時には爆発的に摩耗適切な保護であるとヒュームフードのサッシが低い6"レベルに設定されていることを確認冷却後、水で硝酸を洗い流し、その後95％エタノール。。 </li></ol> 4）代表者の結果 1）カダベリン標準曲線（図3） アッセイは、任意のL -リジンまたはLdcIなく説明するが、実行されたとカダベリンの代わりに種々の濃度は、経験的にアッセイの直線範囲を決定するために使用されていました。アッセイは、カダベリンの〜22ナノモル（図3）に対応する、0.25のOD 340まで線形であった。 LdcI 2）活性（図4） 単独でLdcIの活性は153.5（± 18.1）ナノモルカダベリン分-1μgのpH6.5のLdcI - 1と決定した。 LdcIの活動は、100μMのGTPまたはGDPの存在下で影響を受けることはありませんが強くpppGppとppGppの（図4）の存在下で（&gt; 10倍）抑制される。 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 LdcIの反応の模式図。CO 2及びカダベリンを生成するために、L -リジンの脱炭酸反応は、N、N' - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -カダベリン）とN、Nを生成するだけでなく、高pHでTNBSで次の反応を示されています'- bistrinitrophenyllysine（TNP -リジン）。ファンティエットら11に基づいて<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。エッペンドルフのサーモスタットのセットアップ。24 -ウェルエッペンドルフサーモスタットのサンプルのレイアウトは、アッセイの手順の説明（太字で示されている）とともに示されています。矢印は、プロトコルに従って反応液の転送を示している。 96ウェルプレートでのワンストップソリューションへの反応液の除去にも示されています。 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。カダベリン標準曲線。カダベリンのナノモルに対する340nmの吸光度のプロットが示されています。エラーバーは、少なくとも3つの独立した測定値の標準偏差を表しています。ベストフィットのラインも表示し、0.996のR2を持っています。 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 LdcIアッセイの結果。LdcIの活動の割合（ナノモルカダベリンのmin - 1μgの1 LdcIを生産）のプロットは、100μMのGTP、GDP、pppGpp、ppGppのと塩基の存在下での存在下で示されています。緊縮応答のヌクレオチド（P）ppGppのは著しく阻害LdcIの活動が可能です。エラーバーは、少なくとも6つの独立した測定値の標準偏差を表しています。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

リジン脱炭酸酵素のアッセイでは、TNBSは、TNP -リジンとTNP -カダベリン付加体（図1）を形成するために、L -リジンとカダベリンの第一級アミンと反応させる。 TNP -カダベリンは、カルボン酸基を欠く、トルエン11に分割することができる間、TNP -リジン上にカルボン酸基の存在のために、この付加物は水に可溶のまま。このタイプのアッセイは、カルボン酸基の消失が反応中に発生するアミノ酸の他のタイプでより広く利用することができます。これは、ポリアミンアグマチン4を形成するためにポリアミンプトレシン7と誘導アルギニン脱炭酸酵素不透過によるL -アルギニンの脱炭酸を形成するために誘導オルニチン脱炭酸酵素SPEFによるL -オルニチンの脱炭酸の間に発生します。 ここで説明LdcIアッセイは、in vitroで精製されたタンパク質の活性の測定のための比較的高速な方法を提供する。このアッセイの主要な利点は次のとおりです。 実験では各測定の精度を向上させるごとに、私は）...

<table><tbody><tr><td>2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM ピリドキサール 5&amp;rsquo;-リン酸 (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9255</td><td></td></tr><tr><td>カダベリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D22606</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルポリスチレンプレート</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル石英プレート</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWRデジタルヒートブロック</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoStat Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 96ウェルポリプロピレンプレート</td><td>Axygen Scientific</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Handy Step リピートピペッター</td><td>Brand GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.5 mL リピートピペッターチップ</td><td>Brand GmbH</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 340PC プレートリーダー</td><td>SpectraMax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンdecarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

1と、信じられないほど、低いとpHが落ちることができる哺乳類の胃の通過を含む極端な酸応力に耐えることができるか- 大腸菌では、pH値（9 pHは5）の広い範囲で成長することができる腸内細菌です。 2 2 - pHを1として。酸性pHの生存、E.のような広い範囲を有効にするには大腸菌は、プロトン依存的に脱炭酸、その基質のアミノ酸はこのように内部のpHを上げることつの異なる誘導アミノ酸decarboxylasesを持っています。 decarboxylasesはグルタミン酸decarboxylasesガダとGadB 3、アルギニンデカルボキシラーゼ不透過4、リジン脱炭酸酵素LdcI 5、6、オルニチンデカルボキシラーゼSPEF 7を含める。これらの酵素のすべてが新鮮な基板2と引き換えに、外部媒体への脱炭酸の製品を削除する内側の膜基板-製品のアンチポーターと一緒にコファクター8および関数としてピリドキサール5&#39; - phospateを利用する。 LdcIの場合には、リジン-カダベリンアンチポーターはCADBと呼ばれています。最近、我々は、2.0 ÅにLdcIのX線結晶構造を決定し、そして我々はLdcI厳しいレスポンスレギュレーターのグアノシン5&#39; -二リン酸、3&#39; -二リン酸（ppGppの）14に結合した新規の低分子化合物を発見した。指数関数的に成長する細胞が栄養枯渇や他のストレス9の数字のいずれかが発生するときに緊縮応答が発生します。その結果、細胞が定常期の成長率は10〜急激な成長からのシフトで最高潮に達するシグナル伝達カスケードにつながるppGppのを作り出す。我々は、ppGppのはLdcI 14の特異的阻害剤であることが実証されている。ここでは、ファンティエットらによって開発されたアッセイから変更。11、我々はLdcIの活動とその活動上pppGpp / ppGppのの効果を決定するために使用されていることを、リジン脱炭酸酵素のアッセイを説明します。 LdcIの脱炭酸反応は、L -リジンのα-カルボキシ基を除去し、二酸化炭素とポリアミンカダベリン（1,5 -ジアミノペンタン）5を生成します。 L -リジンとカダベリンは、それぞれ、N、N&#39; - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -カダベリン）とN、N&#39; - bistrinitrophenyllysine（TNP -リジン）を生成するために、高pHで2,4,6 - trinitrobenzensulfonic酸（TNBS）と反応させることができます。 11。後者は（図1参照）ではない。前者はトルエンなどの有機溶媒に可溶であるとしてTNP -カダベリンは、TNP -リジンから分離することができる。アッセイの直線範囲は、経験的に精製カダベリンを用いて決定した。

誘導性リジン脱炭酸酵素の活性は、基質のL -リジンとトルエンで、差動溶解度を持っている付加体を形成するために、2,4,6 - trinitrobenzensulfonic酸による製品のカダベリンを反応させることによって監視されます。

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coliは大腸菌の一種であり、広範囲のpH値（pH 5〜9）で増殖することが可能であり1、驚くべきことに、極限的な...

この手順の全体的な目的は、比色法を用いて、E. coli誘導性リシン脱炭酸酵素の活性を測定することです。まず、EORチューブ内で基質であるL lysineを酵素LDCIと反応させ、その後、3つの時点でサンプルを停止液に回収することでこれを達成します。手順の第2ステップでは、停止液中のサンプルを2,4,6-trinitrobezenesulfonic acid（TNBS）と反応させます。TNBSは基質の一次アミンと反応し、それぞれTMP lysineおよびTMP cadaverの生成物を形成します。本手順の第3ステップでは、TMPカダベリンをトルエンで抽出することにより、水溶性のTMPリシンから水不溶性のTMPカダベリンを分離します。最終ステップでは、トルエン相に含まれるTMPカダベリンの340ナノメートルにおける吸光度を測定します。これにより、最終的な結果を得ることができます。CHO LDCI活性は、厳格応答シグナル分子であるppGppおよびpppGppの存在によって調節されます。こんにちは、トロント大学生化学科のWali博士の研究室のHirです。本日は、E. coliの誘導性リシン脱炭酸酵素であるLDCIの活性を測定する手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、LDCIの新規制御因子および腸内細菌の酸ストレス応答経路への影響を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、記載されたプロトコルに従って必要な溶液をすべて準備します。次に、EINOR thermostat plusを37°Cで平衡化させます。このthermostat plusには、6列に配置された24個のウェルを持つヒートブロックが備わっています。各コラムで特定のヌクレオチドをテストします。まず、対応するヌクレオチドを明記して 0.5 milliliter のエッペンドルフチューブ 24 本にラベルを貼り、ヒートブロックにそれらのチューブをセットします。さらに、200 microliter チップのボックスを数個用意し、1行おきにチップを抜いて、合計4行のチップになるように配置します。これは、酵素アッセイ中にサーモスタット付きヒートブロックを用いてマルチチャンネルピペットを使用するために必要です。次に、デジタルヒートブロックを42 °Cに設定します。96ウェル2.0 mLポリプロピレンプレートを氷上に置き、冷却します。最後に、停止液を入れた96ウェルプレートを準備します。VWR社製の5～50 µLマルチチャンネルピペットを使用し、LDCIアッセイの各分注量にストップ溶液50 µLを加え、続いて水30 µLを加えます。適切なヌクレオチドを用いて調製した溶液A 50 µLを、対応するチューブに分注します。次に、ヒーティングブロックの列Fにある3本のチューブに、溶液B 330

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生物学

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