LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）は質量分析用大気圧イオン源です。イメージングモードでは、中赤外レーザーのプローブは組織切片またはバイオフィルム全体の分子の分布。この手法は、ネイティブの実験条件の下で実施、多様な生物分析研究のための新しいアプローチを提示。

生体組織やバイオフィルム上で遅延質量分析イメージング実験を行うために、堅牢な操作のために遅延セットアップが用意されています。次のステップは、サンプルをサンプルステージにマウントし、調査中のサンプルに必要な実験条件を特定することです。次に、横方向の遅延分子イメージング実験が開始され、必要なデータを使用して空間的な分子分布が得られます。

その結果、生体組織とバイオフィルムの分子構造が示されました。ジョージ・ワシントン大学バータス研究所のピーター・ネメス博士です。この遅延技術が、共焦点、光学、Maldiやsimsなどの質量分析イメージング法などの他の方法よりも優れている点は、大気圧条件下でサンプル分析を直接組織上で行うことができ、サンプル処理が不要であることです。

化学修飾剤を使用せずに化学的に事前に洗浄されたスライドガラスなど、目的の組織切片を平らな面に直接取り付けます。サンプルを取り付けたらすぐにアペルト冷却ステージに固定します 必要に応じて、低電力ファンを備えたヒートシンクを使用して、ペルトステージからの熱除去を容易にします。その後、湿度の高い環境で約1〜2時間長時間作業する場合は、組織表面に水や氷が結露していないか検査します。

組織上の水の結露は、怠惰な実験のイメージング性能に悪影響を及ぼします。必要に応じて、部屋の除湿機を使用するか、呼び出されたサンプルを乾燥窒素ガスなどの不活性ガスで満たされた環境チャンバーに置いて、結露を防ぎます。レーザーアブレーション、エレクトロスプレーイオン化、または怠惰な鉄源は、レーザーアブレーション、エレクトロスプレーイオン化、または怠惰な鉄源を使用して、中赤外線レーザー、略して中赤外線、および光ステアリングとフォーカシングのための一連の光学素子からなるイオン源を最適化するためのサンプル作業を維持するための条件を最適化した後。

このセットアップには、追加のサンプルホルダー、冷却コンポーネント、トランスレーションステージ、エレクトロスプレーシステムも含まれています。中赤外アブレーション中に排出された粒子状物質の一部は、エレクトロスプレーと合体して、サンプルの分子とイオンが播種された荷電滴を生成します。これらの液滴から放出されたイオンは、質量分析計によって分析および記録され、そのオリフィスがここに示されている。

遅延セットアップは、実験を開始する前に構成されます。イオン源を最適化するために選択したサンプルに対応するためには、実験パラメータの正確な調整が必要です。まず、サンプルを質量分析計のサンプリングコーンのオリフィスから15〜20ミリメートル下に配置します。

中赤外レーザーを2.94マイクロメートルの波長と10ヘルツの繰り返し率で操作します。レーザー出力をパルスエネルギーあたり約100マイクロジュールに減衰させます。金のミラーとレーザー波長で透明な集光レンズの組み合わせを使用して、レーザー光エネルギーをサンプルに結合します。

通常の入射では、中赤外B軸を質量分析計サンプリングコーンのオリフィスの5〜8ミリメートル前に配置します。フォーカシングレンズの位置とレーザーパルスエネルギーを調整して、フォーカルスポットの組織を目的の深さまで除去します。アブレーションされたボリュームの寸法。

イメージングアプリケーションのピクセルサイズを決定します。ナノススプレーエミッターを質量分析計の入口軸に沿って配置し、オリフィスに配置して、約10ミリメートルの先端距離を放出します。エレクトロスプレーの場合は、ポジティブイオンモード用の0.1%酢酸または0.1%酢酸アンモニウムを含む50%メタノール溶液を準備します。

マイナスイオンモード用。エレクトロスプレーの安定性は、イメージングを成功させるために重要です。溶剤の選択によっては、安定した噴霧を実現するためには、流量と噴霧電圧を調整する必要があります。

反応性、遅延性、およびイメージングアプリケーションの場合、エレクトロスプレー溶液には反応物が含まれている場合があります。シリンジポンプを使用して、エレクトロスプレーエミッターを介してエレクトロスプレー溶液を毎分約300ナノリットルの流量で供給します。質量分析計のオリフィスが低電圧に保たれている場合、たとえば、接地に対して測定された約500ボルト未満の場合、高電圧、たとえば3000ボルトをエレクトロスプレーエミッターに直接印加するか、金属ユニオンを介してエレクトロスプレーを生成します。

遅延による最も効率的なイオン生成のためにコーンジェットスプレーモードでエレクトロスプレーソースを操作し、レーザービーム、エミッタ、オリフィス軸を光学顕微鏡で同じ平面に保ちながら、遅延セットアップの相対距離を慎重に調整して遅延イオン収量を最適化します。サンプル上のアブレーションクレーターの横方向の寸法を決定して、3次元遅延イメージング実験を行います。個々のパルスでアブレーションを行い、光学顕微鏡のZスタックモードなどを使用してボクセルの深さを決定します。

組織のマウント条件とイオン化源が最適化されましたので、イメージング実験における分子イメージングに進みます。組織サンプルは、レーザーの焦点面内を x 方向と y 方向に移動させ、ステップ サイズはアブレーション スポットの寸法以上です。空間分解能は、入射レーザービームの集束によって制限されます。

サンプル表面上の関心領域を選択し、対応する境界のXY座標を取得します。画像化される領域の各ピクセルで選択した滞留時間でサンプル表面をラスター化するためのグリッディングアルゴリズムを選択します。3つのXSトランスレーションステージと、所定のグリッドに従ってサンプルをインギングできるソフトウェアを使用します。

次に、イメージングに必要な合計時間を計算します。中赤外レーザー光源を適切な繰り返し速度で開始し、各ピクセルの滞留時間内に質量スペクトル内の選択したイオンに対して十分な信号対雑音比を生成します。遅延的な横方向のイメージング実験を行うには、エレクトロスプレーソースをオンにします。

イメージングに必要なフルタイムに十分なソリューションがあることを確認してください。次に、マススペクトルの取得、中赤外レーザーアブレーション、表面スキャンを同時に開始し、データを収集します。イメージングランが終了したら、表面を停止し、中赤外レーザーとデータ収集

レーザー光源を無効にし、高電圧をオフにし、シリンジポンプのスイッチを切り、質量分析計をスタンバイモードに設定します。また、PALT冷却電子機器の電源を切り、不活性ガスの流れを閉じます。使用する場合。

最後に、選択したMZ値のイオン強度信号を分析の絶対座標に対してプロットして、横方向または3D分子画像を取得します。これらは、ラットの脳の厚さ100マイクロメートルの冠状切片の横方向の遅延イメージングからの代表的な画像です。実験中は切片を凍結し、乾燥した窒素ガス環境に保管しました。

脳の解剖学的領域は、MZ 2 78 0.59の2つのマラリア原虫について得られた分子像と良好な相関を示しています。これは、ゼブラ植物の葉組織を周囲の環境で調べた3Dの分子イメージング実験です。これは、他の一次および二次代謝物の中で調査したものです。MZ 2 85 0.076 の ASCE は、上から 2 番目と 3 番目の層の黄色のセクターでイオン数が多いほど検出され、均一な分布を示しました。

他のものでは、この分布は光学像で見られる変動のパターンと一致していました。Hその開発後。この怠惰な技術は、分析化学やB化学の分野の研究者が、かなりの水分含有量を持つ組織やバイオフィルムの分子組成と空間構成を研究する道を開きました。

中赤外線レーザーと電気スプレー源での作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順では、常に標準のレーザー安全プロトコルに従い、すべての電気接続に適切なシールドを適用してください。