二重蛍光その場でハイブリダイゼーション

こんにちは。私はロチェスター大学のALヘルピングラボラトリーのポスドク研究員、JAです。今回は、単一細胞解像度で2つのMRN転写物を同時に検出するための、新鮮凍結脳切片におけるProcess Instituteハイブリッドダイジェスチョンについてご紹介します。この手法は、脳回路の解剖学的、機能的、分子的、および神経化学的な構成に関する解析など、神経科学分野における疑問の解決に役立ちます。

この手法は、AV脳のニューロンにおける遺伝子凝集に関する知見を提供できるだけでなく、齧歯類などの他の系や、さまざまな神経組織にも適用可能です。この手順を開始するには、十分な量のSDX G 50粉末を水で水和させ、RNAを溶解させます。

溶液を軽く混ぜ、室温で2〜5分間静置します。この工程により、Sedex G 50による沈殿後、市販のSedexパウダーに含まれるデキストロースからSDXビーズを分離させます。上清を除去し、この操作を3〜5回繰り返します。最終洗浄後、SX G 50溶液をTEバッファーに、バッファーとビーズの体積比1:1で再懸濁し、使用まで4°Cで保存します。

次に、カラムを準備します。オートクレーブ滅菌済みのグラスウールを滅菌済みの1 mLシリンジに入れ、プランジャーで圧縮して底部に密な層を作ります。その後、シリンジを15 mLファルコンチューブに入れます。

Beckman社のC 0 6 5 0固定角ローターを装着した遠心機を用い、1000 rotations per minuteで30秒間遠心し、カラムにSedex G 50溶液を満たします。遠心後、各カラムに200 microlitersのカラム洗浄バッファーを加え、1000 rotations per minuteで2分間遠心して洗浄します。

前と同様に行います。最後に、各カラムに200 µLのカラムブロッキングバッファーを加え、1000 rpmで2分間遠心分離します。カラムを平衡化させるため、この手順を4～5回繰り返します。

調製したカラムは、RIBAプローブのラベル化が完了し、本手順で示す二重蛍光in situハイブリダイゼーションまたはD-FISH法による精製準備が整うまで4 °Cで保存します。2種類のRNAプローブを調製し、一方はDigoxigenin（DIG）で、もう一方はビオチンでラベル化します。まずリボプローブラベル化溶液を調製し、ラベル化反応液を37 °Cのウォーターバスで2時間インキュベートして、プローブのラベル化を開始します。2時間のインキュベーション後、各ラベル化反応液に20 µg/µLのtRNAを1 µLと、カラムブロッキングバッファーを39 µL加えます。

次に、各カラムに50 µLのブロッキングバッファーを加え、2000 rpmで3分間遠心分離し、プローブ精製用のEDEX G 50カラムを準備します。カラムを平衡化させるため、この手順を2〜3回繰り返します。カラムの準備ができたら、カラムの底に新しいEEND orphチューブを設置します。

プローブ溶液をSedex G 50カラムに適用し、2000 rpmで3分間遠心分離します。精製された50 µLのRiboプローブ溶液を得るために、標識および精製されたriboプローブの品質と収量を評価します。クライオスタットを用いてハイブリダイゼーションに進む前に、2〜3枚の脳切片をCharge Super Frost Plusスライドに回収します。

切片の厚さは10～12 µmにする必要があります。スライドは使用まで-80 °Cで保存可能です。切片を、新しく調製した冷たい3%パラホルムアルデヒド溶液中で5分間インキュベートします。

その後、切片をPBSで2回軽くすすぎます。次に、70%、95%、100%のエタノール溶液による標準的なアルコール系列で、各溶液に2分間ずつ浸し、切片を脱水します。脱水後、調製したばかりのアセチル化溶液中で10分間インキュベートします。

その後、切片を2×SSPEで3回洗浄し、先ほど示した標準的なアルコール系列を用いて、アセチル化後にもう一度切片を脱水させます。次に、ribo probeを用いてハイブリダイゼーションを開始します。組織に十分な量のハイブリダイゼーション溶液を滴下し、スライドをカバーグラスで覆い、金属製スライドホルダーにセットします。

ホルダーを65 °Cに設定したミネラルオイルバスに浸し、一晩放置します。翌日、スライドホルダーをミネラルオイルバスから慎重に取り出し、クロロホルムで短時間すすいでスライド上の余分なオイルを除去します。

カバーガラスを取り除くため、スライドを2×SSPE溶液に5〜10分間浸します。カバーガラスを取り除いた後、スライドを新しい2×SSPE溶液に移し、室温で1時間保持します。このインキュベーションステップの開始時に、ハイブリダイゼーション時と同じ温度まで2×SSPE＋50%ホルムアミド溶液をあらかじめ温めておきます。1時間のインキュベーションが終了した後、次のステップへ進みます。

スライドをあらかじめ温めておいた2倍濃度のSSPE溶液に移し、1.5時間インキュベートします。このインキュベーションステップの開始時に、0.1倍濃度のSSPE溶液をハイブリダイゼーションステップと同じ温度まで予熱しておきます。スライドを予熱した0.1倍濃度のSSPE溶液に移して30分間インキュベートし、ハイブリダイゼーション後の洗浄を完了させます。

この洗浄を1回繰り返します。これで、脳切片はハイブリダイズしたriboプローブの検出および可視化の準備が整いました。TNTバッファーに0.3% hydrogen peroxideを加え、スライドをこの溶液中で10分間インキュベートします。その後、deco penを用いて、TNTバッファーで10分間ずつ3回スライドを洗浄します。

脳切片を含む領域の周囲にウェルを作成します。各スライドに150 microlitersのTNB bufferを加え、切片をこの溶液中で30分間インキュベートします。この工程の間、切片が乾燥しないように注意してください。

次に、ペルオキシダーゼ標識抗DIG抗体を含む150 µLのTT NB溶液を滴下し、スライドを湿室で2時間静置します。2時間のインキュベーション後、切片をTNTバッファーで10分間、3回洗浄します。その後、各スライドにAlexa 594標識T IDEワーキングソリューションを150 µLずつ滴下し、湿室で1時間静置します。

1時間後、切片をTNTバッファーで10分間ずつ3回洗浄します。その都度、0.3%過酸化水素を含むTNTバッファー溶液中で10〜30分間インキュベートしてください。過酸化水素溶液でのインキュベート時間はmRNAの量によって異なるため、D fishの前に検討する必要があります。

その後、TNTバッファーで10分間ずつ3回洗浄します。スライド1枚あたり150 µLのTMBバッファーを滴下し、湿潤箱の中で30分間保持します。スライドを傾けて、余分なTMB溶液を除去します。

ペルオキシダーゼ標識アニン抗体を含むTMB溶液を150 µL加え、スライドを加湿チャンバー内で2時間保存します。その後、TNT緩衝液で切片を10分間×3回洗浄します。毎回、Alexa 488標識マイト作動溶液を150 µLスライドに滴下し、切片を1時間インキュベートします。

次に、切片をTNTバッファーで10分間ずつ3回洗浄します。両方のリボプローブが抗体で標識されたので、切片を150 µLのホスト溶液中で2分間インキュベートします。その後、切片をTNTバッファーで5分間ずつ3回洗浄し、Vector ShieldまたはProlong Antifadeなどの蛍光対応の封入剤を切片に加えてカバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡下で観察します。

これらの代表的な写真マイクログラフは、ゼブラフィンチの脳切片（具体的には、哺乳類の聴覚皮質に相当する songbird analog である NCM 領域）を用いた D fish 実験によるものです。脳切片は 2 種類のプローブでハイブリダイゼーションされました。一つは抑制性ニューロンのサブポピュレーションのマーカーである par albumin に対するビオチン化リボプローブであり、もう一つは歌駆動ニューロンの信頼性の高いマーカーである活動依存性遺伝子 zinc に対する DIG 標識リボプローブです。これら 2 つの画像を重ね合わせることで、聴覚経験によって活性化される抑制性ニューロンの細胞集団が示されています。

矢印はparのリボプローブのみで標識された細胞を示しています。アルブミンの矢印は亜鉛のRIBAプローブのみで標識された代表的なニューロンを示しています。目的の両方の転写産物を共発現している細胞はアスタリスクでマークされています。この手順を行う際は、ベンチを清潔に保ち、ヌクレアーゼフリーの溶液、プラスチック製品、およびガラス器具を使用することが重要です。

このビデオを視聴することで、ラット脳における遺伝子の共調節を研究するために、新鮮凍結脳切片において単一細胞解像度で2種類のMA種を同時に検出する方法を十分に理解できたはずです。ビデオをご視聴いただきありがとうございました。実験の成功をお祈りします。