Name: 神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学ぶ 器官型海馬スライス培養法を用いた神経損傷モデルの構築方法。生後7日齢ラット脳から海馬を分離し、膜インサート上で培養することで、NMDAや酸素・グルコース欠乏などの刺激に対する神経細胞死を定量的に評価できます。

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NINDS、米国心臓協会、老化研究のためのアメリカ連合、ダイムの月によって資金を供給

1。準備開始する前に、必要な手術器具、解剖や文化、メディア、および7日齢のラットまたはマウスの仔を組み立てる。プロトコルは、マウスやラットの準備のための同じです。 （ⅰ）材料および機器<ul><li>営業ハサミ（ストレート長さ6"、猫＃RS6818、Roboz、ゲイサーズバーグ、MD） </li><li> Microは、ハサミ、解剖（長さ4'"、猫＃RS5910を。Roboz、ゲイサーズバーグ、MDは） </li><li>炭素鋼デュモンピンセット（猫＃RS - 5045.Roboz、ゲイサーズバーグ、MD） </li><li>改質ガラス"転送"ピペット（削除されたパスツールピペットの下部とエッジのスムージング） </li><li> ACLARプラスチックフィルムが正方形で（ハネウェル、＃812071、ポッツビル、ペンシルバニア州）"× 2で"2にカット</li><li>の3でのスポンジ4（ケンドール、猫＃3157、マンスフィールド、マサチューセッツ州）カバー</li><li> 30ミリメートルMillicell膜インサート（0.4μmの、ミリポア、ベッドフォード、MA） </li><li>両刃のカミソリの刃を持つMcllwainのティッシュチョッパー（マッキルウェーン組織チョッパー、ビブラトーム社、セントルイス、MO） </li><li> CCDカメラと画像解析ソフトウェアとの倒立顕微鏡</li></ul> （ⅱ）解剖媒体（DM、pH7.3に1リットル） <table border="0"><tbody><tr><td>ハンクス平衡塩類</td><td> 1バイアル（95.2 g/1L）（シグマ：H2387） </td></tr><tr><td> NHCO 3（4.2 mM）を</td><td> 350mgを</td></tr><tr><td> HEPES（10mM）を</td><td> 2.83グラム</td></tr><tr><td>グルコース（33.3 mM）を</td><td> 6.0グラム</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） </td><td> 10mLの</td></tr><tr><td> BSA（0.3％） </td><td> 300mgの</td></tr><tr><td>し、MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 1.44グラム</td></tr></tbody></table> （ⅲ）培養培地（400 mL）に<table border="0"><tbody><tr><td> MEM（Invitrogen社11575〜032） </td><td> 200 mLの</td></tr><tr><td> ***ハンクのバランス塩（インビトロジェン24020〜117） </td><td> 100mLの</td></tr><tr><td>ウマ血清（Invitrogen社26050〜070） </td><td> 100mLの</td></tr><tr><td> HEPES緩衝液（1 M、インビトロジェン15630〜080） </td><td> 5 mLの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） </td><td> 4 mLの</td></tr><tr><td colspan="2"> ***培養液を加える前に、500mLのハンクのバランス塩に12.8グラムのブドウ糖を追加</td></tr></tbody></table> （IV）動物 7日齢ラットまたはマウスの出生後の仔、実験ごとに一般的には1リットル。 2。文化の日に<ol><li>すべての解剖ツールとACLARフィルムは開始前に30分間70％エタノールに浸漬する必要があります。解剖フード、ブレード、および組織のチョッパーの表面をエタノールで消毒する必要があります。 </li><li>ウェルあたり1mLの培養液を追加し、各ウェルのミリポア透過膜を挿入し、いくつかの（3-4）6ウェル組織培養プレートを準備します。場所、6ウェルのスライスを転送する準備が整うまで、37℃インキュベーターでプレート。 </li><li> DMと氷の上で場所を持ついくつかの（4-6）60 mmのプレートを準備します。 </li><li>急速にはさみで首を切ると70％ETOHに浸し、そして迅速に頭蓋骨のsaggital切開と脳を公開。慎重に冷たいDMですぐに脳と場所を削除します。二つの半球に分離して2-3秒のカバーのスポンジに各半球内側を下に置きます。 </li><li>そっとティッシュチョッパーでACLARフィルムの正方形と場所の上に半球を持ち上げ、配置、350μmのセクションでcoronally脳をカット。終了したら、そっと冷たいDMの区分け半球と水没してAlcarの正方形を取る。 </li><li>解剖顕微鏡を用いて、海馬切片を分離。ラットの場合は、尾側海馬への吻側またがる5つのセクションがあるはず、とマウスは3-4のセクションがあるはずです。 </li><li> 37℃組織培養インキュベーターから細胞膜を挿入した6ウェルプレートを取り出してください。ガラス転移のピペットを使用して透過性の膜の上に個別に海馬切片を移す。あまりにも多くのDMがメンブレン上に放出されている場合は、パスツールピペットでDM過剰を取り除く。それぞれの膜に5つの海馬スライスを置きます。条件ごとに少なくとも3ウェル、または15のスライスを許可する。 </li><li>毒性の実験を開始する前に12-14日のために5％CO加湿インキュベーター中37℃で培養プレートをインキュベートする。培養液は週に2回変更することができます。 </li></ol> 3。スライス培養における海馬神経損傷を誘発し、定量化<ol><li>培養中の12-14日後、培養培地に5μg/ mLのヨウ化プロピジウム（PI）を追加します。このステップでは、基底細胞死の可視化と定量化が可能になります。 </li><li>翌日、PIを定量化各海馬スライスのCA1サブリージョン（および/ ​​またはCA3や歯状必要に応じて）の蛍光と取得は、基底細胞の死を（時間と呼ばれる= 0時間、またはT 0）を表すPI蛍光測定値を意味する。画像取得と定量化のために、我々は、オープンラボのソフトウェア（即興、英国）を使用しますが、他の画像取得と解析ソフトウェアは、蛍光強度を定量化するために使用することができます。 </li><li>すぐにT 0 PI蛍光の画像取得の後、ご入金方法（我々は神経毒性2,5を誘導するために一時間に10μMNMDA、酸素-グルコース欠乏、またはLPSを使用している）ことによって神経損傷を誘発する。毒性刺激後、5μg/ mLのPIを含む新しい培地と培地を交換して一晩のスライスを維持する。 </li><li> 3日目に、PI 24における実験条件の蛍光、またはT 24を意味し定量化する。 </li><li>この画像取得後、直ちに培地を変更し、10μMNMDAと5μg/ mLのPIと最大の神経細胞死を達成するために一晩インキュベートするスライスを追加します。 </li><li> 4日目に、T maxとして定義されている最大の神経細胞死のPIの蛍光を、意味し定量化する。次のようにパーセントの細胞死を計算します（T 24 - T 0）/（T MAX - T 0）。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1（）海馬と、その後の実験的な傷害と画像取得の世代のためのタイムライン。 （B）basally海馬スライスの代表画像（T 0）、24時間、10μMNMDA（T 24）に1時間暴露後の、そして最大の神経傷害を得るためにNMDAさらに24時間または10μM（T max）の後に。

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

実験を複製するときに再現性と一貫性のある結果を確保するために実行するには、2つの重要なポイントがあります。最初に、実験前に12-14日のために海馬スライスの年齢を聞かせすることが重要です。スライスの分離により、大幅なミクログリアの応答がある、とミクログリアをin vitroで 3,6 で 10日目で発生安静分岐し状態に戻ると、しばらくの間有効なまま。第二に、PIの蛍光強度が負傷したセルの番号4に比例することを意味。シーケンシャル蛍光は、3つの時点で測定される：（i）T 0において、NMDAまたは自発的な神経細胞死の基礎レベルを測定するためにOGD刺激前、（ⅱ）T 24、または24時間後のNMDAまたはOGDまたはその他の刺激による刺激後、および（iii）T maxで、神経細胞死の最大量を生産する、10μMNMDAによる24時間一晩致死治療とスライスの最後の治療に続く。 /（T MAX - T 0） -パーセントの細胞死は、その後、式を（T ...

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

器官海馬スライス培養では、海馬の基本的なアーキテクチャとコンポジションが相対的に1を保存されている神経細胞傷害のメカニズムを調べるためにin vitro法です。器官培養系は、神経細胞のアストロサイトやミクログリアの効果の検査は可能ですが、ex vivoでの準備として、血流、または末梢炎症性細胞の動員の影響には対応していません。そのために、この培養法は、頻繁に海馬の錐体ニューロンに興奮毒性と低酸素障害を調べるために使われるだけでなく、炎症反応を調べるために使用されています。ここで我々は、出生後の齧歯類の脳から海馬スライス培養を生成する神経細胞傷害を誘発する有毒な刺激を投与し、海馬神経細胞死を測定すると定量化するための方法を説明します。

organoptypic海馬スライス培養モデルは、<em&gt; in vitroで</em&gt;モデルは、パラダイムの様々な神経損傷を調べるために使用。この記事では、スライス培養を生成し、神経損傷を定量化するための方法を説明します。

器官型海馬スライス培養は、...の基本的構造および組成を維持した状態で神経損傷のメカニズムを検討するためのインビトロ法である。

本手順の目的は、NMDA、興奮毒性、酸素またはグルコース欠乏、あるいはリポポリサッカライドやアミロイドβペプチドなどの炎症性刺激を含む、さまざまな刺激に対する神経損傷をモデル化するために使用できる、海馬のオルガノタイプスライス培養系を構築することです。まず、出生後の脳を摘出し、各半球をスライスして冠状断を作成します。次に、海馬領域を分離し、6ウェルプレート内のメンブレンインサート上で培養します。スライスの培養後、プロピジウムヨードで染色し、自発的な神経細胞死のレベルを算出します。最後に、スライスを神経毒剤で処理し、再染色して処理に対する毒性反応を測定します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いたプロピジウムヨード蛍光の定量化を通じて、実験条件における海馬のCA1、CA3、および歯状回領域におけるニューロン死の割合を示す結果を得ることができます。一次ニューロン培養のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、海馬の基本構造が比較的維持された標本において、ニューロン損傷のメカニズムを検討できる点にあります。そして3番目のタイプには運動が含まれます。解剖を開始する前に、ミクログリアとROYを保存します。それぞれにミリポア透過性膜を挿入してください。数枚の6ウェル組織培養プレートの各ウェルに、培養液を1 mLずつ加えます。プレートを37 °Cのインキュベーターで加温します。生後7日のラット仔仔の切断した頭部を70% ethanolに短時間浸します。消毒後、マイクロ解剖鋏を用いて頭蓋骨に正中切開を加え、脳を露出させます。ピンセットで速やかに脳を取り出し、氷上の60 millimeter解剖用培地が入ったディッシュに移します。ピンセットを使用して、脳を2つの半球に分離します。各半球の内側を下にして乾いたカバースポンジの上に2〜3秒間置き、余分な水分を取り除きます。脳をクリアフィルムの正方形の上に移動させ、組織チョッパーのプラットフォームに配置し、吻側から350 micronの間隔で冠状断にスライスします。続いて慎重に操作を行います。A clar squareをそっと持ち上げ、切片を氷冷した新鮮な解剖培地が入ったシャーレに浸します。解剖顕微鏡下で、大脳皮質の下方に位置し、線条体に隣接するC字型の構造である海馬を特定します。ピンセットを使用して、各冠状断面から海馬を分離します。本文に記載されているように改造したパストゥールピペットを用いて、海馬スライス5枚を各メンブレンに転送します。準備した温化した6ウェルプレートに挿入してください。メンブレン表面にある余分な培地を除去します。プレートを37°C、5% CO2条件下で12〜14日間インキュベートします。培養12〜14日後、付属テキストの詳細に従って培地を交換し、基底細胞死の可視化および定量化を行うため、5 µg/mLのプロピジウムイオダイド（略称：PI）を添加します。スライスを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で、CCDカメラに接続された倒立蛍光顕微鏡下にて一晩インキュベートします。このとき、40倍の倍率でスライスの画像をキャプチャします。T0（0時間）における細胞死の基底レベルに相当するPI蛍光をキャプチャします。その後、本実験で選択した手法を用いてスライスに神経損傷を誘発させます。ここで、切片を10 µM NMDAを含む新鮮な培地を用い、37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。神経毒性処理後、培地を5 µg/mL PIを含む新鮮な培養培地に交換します。スライスを37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートし、神経毒性処理後のPI蛍光画像を撮影します。この時点での平均蛍光測定値は、細胞死のレベルを表します。実験的損傷から24時間後（T 24 hours）、直ちに培地を、10 µM NMDAおよび5 µg/mLを含む新鮮な培養培地に交換します。スライスを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で一晩PI処理し、神経細胞死を最大化させます。この時点でのPI蛍光の最終画像セットを取得し、平均蛍光値を測定します。これが細胞死の最大レベル、すなわちTmaxとなります。付属テキストに記載されている通り、画像解析ソフトを用いて関心領域のPI蛍光を定量します。これは海馬のca one領域における基底神経細胞死のPI染色の代表的な画像です。こちらはPI染色された神経細胞死の代表的な画像です。10 µMのNMDAで1時間処理した24時間後、染色がより濃くなっており、細胞死の程度が高まっていることがわかります。この画像は、10 µMのNMDAで一晩インキュベートした後の最大のPI染色を示しています。このビデオを視聴することで、海馬の有機スライスを作製する方法と、神経損傷のレベルを測定する方法について十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。...

器官型海馬切片培養

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成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。...

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ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。...

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マウス脳の水平海馬スライス

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