Name: 心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶ、脱細胞化心膜組織からのマトリックスゲル作製法とラット心筋への注入技術。組織工学用スキャフォールドとしての多孔性繊維構造と血管細胞浸潤の評価方法を習得する。

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この研究は、助成金番号1 - DP2 - OD004309 - 01を介して、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラム、医学研究のためのNIHロードマップの一部が部分的にサポートされていました。 SBS - N。大学院研究フェローシップのためにNSFを感謝したいと思います。

<ol><li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel%3A+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li>
<li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li>
<li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li>
<li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival%2C+reduces+infarct+expansion%2C+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li>
<li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
</ol>

動物の使用：本研究ではすべての実験は、カリフォルニア州、サンディエゴおよび実験動物のケアの認定のためのアメリカ連合の大学の動物実験使用の委員会が公開されているガイドラインに準拠して行われた。

このメソッドは、心筋組織工学のための生物学的に誘導された、注射足場の世代を可能にする。これらのメソッドが最初に製造するため、心筋マトリックスゲルの in vivo試験で開発され、心膜マトリックスのゲルをここに提示されたが、このプロトコルは、組織が ​​適切に脱細胞することができます提供されて、どんな組織で使用するために適応させることができる。細胞化を行い、マトリックスのゲル中のDNAの存在は望ましくない免疫応答を引き起こす可能性があるので、前のこれらのメソッドの使用に確認する必要があります。そこに材料をdecellularizeするさまざまな方法があり、いくつかの良いレビューが主題3、4に書かれています。 マトリックスのゲルを調製する際に、それは残りの水分はフライス加工を妨げになるので、サンプルが完全に、凍結乾燥されていることが不可欠です。フライス加工時にも、ECMの粉の吸入を避けるために、常にフェイスマスクを着用する。最後に、マトリックスのゲルは、in vivo試験のために意図されている...

<table><tbody><tr><td>&lt;強力な&gt;試薬：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p6887-1G</td><td>凍結乾燥された </td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin-HRP</td><td>Thomas Scientific</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;強力な&gt;器具・装置：&lt;/strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiley ミニミル</td><td>Thomas Scientific</td><td>3383L10</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 凍結乾燥機</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;強力な&gt;手術用備品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベタディン</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-154-16</td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンガー液</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>003966</td><td></td></tr><tr><td>KYジェリー</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>28658</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン 2%</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>17767</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ブプレノルフィン</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液軟膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9860843</td><td></td></tr><tr><td>トリプル抗生物質軟膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>19082795</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>60307-120-25</td><td></td></tr><tr><td>耳鏡 </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>008699</td><td></td></tr><tr><td>止栓栓</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>006245</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl 縫合糸</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>J327H</td><td></td></tr><tr><td>5-0 プロリン縫合糸</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>s-1173</td><td></td></tr><tr><td>リバースカッティング（RC）針</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ止血鉗子 </td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>ラット歯用マイクロ鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11084-07</td><td></td></tr><tr><td>10番メス刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>10110-01</td><td></td></tr><tr><td>鈍端剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>鋭利な曲剪（きょくせん）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>大型鋸歯付き鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>PE160吸引チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>427430</td><td></td></tr><tr><td>クリッパー </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>21608</td><td></td></tr><tr><td>皮膚用ステープル/ステープラー </td><td>Ethicon Inc.</td><td>PRR35</td><td></td></tr><tr><td>&lt;強力な&gt;一般器具・消耗品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スターラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10倍PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1倍PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 mLシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mLシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用接着剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用ドレープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タオルクランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型手持ち式真空掃除機 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

このプロトコルは、心筋組織の工学的応用のための注射細胞外マトリックス（ECM）ゲルの調製のためのメソッドを提供します。簡単に言えば、脱細胞組織は、凍結粉砕、酵素的に消化し、生理的pHにもたらされる。凍結乾燥は、小さなミルで微粉末に粉砕することができる乾燥したECMで、その結果、組織からすべての水分を取り除きます。粉砕後、ECMの粉末を注射マトリックスを形成するために、ペプシンで消化する。 pH7.4に調整した後、液体マトリックス材料は、心筋内に注入することができます。前の特性評価試験の結果は、脱細胞心膜と心筋組織から生成行列のゲルは多様なタンパク質、ペプチドおよびグリコサミノグリカンを含むネイティブなECM成分を、保持することが示されている。組織工学のためのこの物質の使用を考えると、in vivoでの特性評価に特に有用であり、ここ、左心室に壁内注射を行う方法（LV）自由壁がで行列のゲルへのホストの応答を分析する手段として提示され小動物モデル。胸腔へのアクセスは、ダイヤフラムを介して得ていると注射は少しLV自由壁の頂部の上に作られています。生物由来スキャフォールドは、注射の前にビオチン標識によって視覚化し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ニュートラビジンで組織切片を染色し、ジアミノベンジジン（DAB）染色を介して可視化することができます。注入領域の解析も組織学的および免疫組織化学的染色を行うことができます。この方法では、以前に調べた心膜と心筋のマトリックスのゲルは、繊維状、多孔質ネットワークを形成し、注入の領域内の血管形成を促進することが示された。

脱細胞組織から注射マトリックスのゲルを調製し、ラット心筋にそれを注入するための方法<em&gt; in vivoで</em&gt;説明して​​います。

本プロトコルでは、心筋組織工学への応用のための注入可能な細胞外マトリックス（ECM）ゲルの調製方法を提供します。

脱細胞化された心膜および心筋組織から作製されたマトリックスゲルは、多様なタンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンを含む天然の細胞外マトリックス成分を保持しています。これらの組織マトリックスは、組織工学に利用可能です。本ビデオでは、心膜組織を脱細胞化して無細胞の細胞外マトリックスを得ることで、マトリックスゲルを作製します。次に、細胞外マトリックスを処理して可溶化された液体状にします。続いて、この可溶化マトリックスを小動物モデルで試験し、注入可能なスキャホールドとしての実現可能性を評価します。組織学的および免疫組織化学的解析により、生体内で注入された材料が多孔性の線維状スキャホールドを形成し、血管細胞の浸潤が可能になることが示されています。こんにちは、ソニア・ゼキです。私はカリフォルニア大学サンディエゴ校のKaren Chrisman博士の研究室に所属する大学院生です。本日は、脱細胞化組織から可溶化ECM（細胞外マトリックス）を作製し、心臓組織工学への応用に向けたin vivo試験の実演を行います。これらの手法は、心不全治療のための注入可能なバイオマテリアル療法の開発において重要です。心筋梗塞後の外科的手順については、当研究室の獣医神経外科医であるPam shoot McGuffinが実演します。それでは始めましょう。まず、組織を脱細胞化して細胞外マトリックス（ECM）のみにすることからこのプロトコルを開始します。まずブタ心膜を脱イオン水の入ったビーカーに入れ、室温で30分間攪拌して洗浄します。洗浄後、組織を1% SDSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含む1× PBSに入れ、室温で24時間連続して攪拌します。翌日、組織を脱イオン水に戻して5時間連続して攪拌し、泡がすべて消えるまで50 mLチューブに入れて振盪します。ヘマチン・エオシン染色により、脱細胞化組織に核が存在しないことが確認されるはずです。脱細胞化組織の残りを15〜50 mLのコニカルチューブに入れます。その後、組織を-80 °Cのフリーザーで保存します。凍結サンプルを、完全に乾燥するまで極低圧および極低温下で凍結乾燥させます。使用するシステムやサンプルの含水量によって異なりますが、これには12時間から72時間かかる場合があります。脱細胞化組織が完全に乾燥したら、Wiley Minim millに移します。40メッシュの篩を用いて、組織を微粉末状に粉砕します。サンプルの大部分がフィルターを通過したら、回収ジャーを取り出します。このサンプルを以後、細胞外マトリックスまたはECMパウダーと呼びます。次のステップへすぐに進まない場合は、ここで2回目の凍結乾燥を行うことができます。これにより、ECMを溶解させるための記録重量の正確性が確保されます。必要な量のECM粉末を滅菌アライアンスバイアルに量

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここで、我々は、骨格筋芽細胞を含むコラーゲンベースの、組織構造の作製を実証する。これらの3次元設計された構造は、組織を交換または修復するために使用されることがあります...

筋原培養組織コンストラクトの作製

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

複雑な組織の高度に組織化された構造を作成するためには、複数の材料と細胞タイプを統合された複合材料に組み立てる必要があります。...

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

このプロトコルは、心筋梗塞の幹細胞治療のための細胞生着不良の制限を、ハイドロゲルシステムとフィブリンベースの接着剤の使用を通じて緩和することを目的としています。このアプローチにより、梗塞後の細胞間接触を維持でき、損傷部位における有益な薬剤の治療可能性が高まります。...

ヒドロゲルは、構築し、マウス心筋梗塞モデルにおける治療薬を送達するためのフィブリンベースの接着剤のアプローチ。

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D...

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization...

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。...

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

幹細胞ベースの治療は、心筋梗塞後に負傷した心臓組織を修復するための効率的な戦略として浮上している。酵素的に架橋できるゼラチンハイドロゲルを用いた幹細胞移植に最適なインビボアプリケーションを提供します。...

マウスモデルにおける心筋梗塞後のMSC負荷注入性ヒドロゲルの筋内移植

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro...

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぶ、脱細胞化心膜組織からのマトリックスゲル作製法とラット心筋への注入技術。組織工学用スキャフォールドとしての多孔性繊維構造と血管細胞浸潤の評価方法を習得する。

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

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