心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

脱細胞化された心膜および心筋組織から作製されたマトリックスゲルは、多様なタンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンを含む天然の細胞外マトリックス成分を保持しています。これらの組織マトリックスは、組織工学に利用可能です。本ビデオでは、心膜組織を脱細胞化して無細胞の細胞外マトリックスを得ることで、マトリックスゲルを作製します。

次に、細胞外マトリックスを処理して可溶化された液体状にします。続いて、この可溶化マトリックスを小動物モデルで試験し、注入可能なスキャホールドとしての実現可能性を評価します。組織学的および免疫組織化学的解析により、生体内で注入された材料が多孔性の線維状スキャホールドを形成し、血管細胞の浸潤が可能になることが示されています。

こんにちは、ソニア・ゼキです。私はカリフォルニア大学サンディエゴ校のKaren Chrisman博士の研究室に所属する大学院生です。本日は、脱細胞化組織から可溶化ECM（細胞外マトリックス）を作製し、心臓組織工学への応用に向けたin vivo試験の実演を行います。

これらの手法は、心不全治療のための注入可能なバイオマテリアル療法の開発において重要です。心筋梗塞後の外科的手順については、当研究室の獣医神経外科医であるPam shoot McGuffinが実演します。それでは始めましょう。

まず、組織を脱細胞化して細胞外マトリックス（ECM）のみにすることからこのプロトコルを開始します。まずブタ心膜を脱イオン水の入ったビーカーに入れ、室温で30分間攪拌して洗浄します。洗浄後、組織を1% SDSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを含む1× PBSに入れ、室温で24時間連続して攪拌します。翌日、組織を脱イオン水に戻して5時間連続して攪拌し、泡がすべて消えるまで50 mLチューブに入れて振盪します。

ヘマチン・エオシン染色により、脱細胞化組織に核が存在しないことが確認されるはずです。脱細胞化組織の残りを15〜50 mLのコニカルチューブに入れます。その後、組織を-80 °Cのフリーザーで保存します。

凍結サンプルを、完全に乾燥するまで極低圧および極低温下で凍結乾燥させます。使用するシステムやサンプルの含水量によって異なりますが、これには12時間から72時間かかる場合があります。脱細胞化組織が完全に乾燥したら、Wiley Minim millに移します。

40メッシュの篩を用いて、組織を微粉末状に粉砕します。サンプルの大部分がフィルターを通過したら、回収ジャーを取り出します。このサンプルを以後、細胞外マトリックスまたはECMパウダーと呼びます。

次のステップへすぐに進まない場合は、ここで2回目の凍結乾燥を行うことができます。これにより、ECMを溶解させるための記録重量の正確性が確保されます。必要な量のECM粉末を滅菌アライアンスバイアルに量り取ります。

1 mg/mL濃度の滅菌ろ過した塩酸溶液を、ECMパウダーが入ったシンチレーションバイアルに添加し、ECM濃度が10 mg/mLになるようにします。スターバーを加え、バイアルをスタープレートの上に置きます。

48〜60時間、絶えず撹拌し、滅菌済みのWHEスプーンまたはスパチュラでバイアルの側面を定期的にこそげ落としてください。これは、すべてのECMパウダーを完全に消化させるためです。ECMが消化されるにつれて、溶液に溶解します。

ECMが可溶化した後、サンプルを氷上に置き、水酸化ナトリウムと塩酸を用いてpHを7.4に調整します。pH調整後、溶液の最終濃度が1倍PBSとなるように10倍PBSを加えます。例えば、pH調整後のECM溶液が900 µLである場合は、100 µLの10倍PBSを添加します。

中和のために添加した容量と、pH測定のために除去した容量を合算し、可溶化されたECM溶液の濃度を決定します。その後、目的の最終濃度にするために1倍のPBSを添加します。ここでは6 mg/mLとします。

手術当日、可溶化ECM 75 µLを、30ゲージの針を装着した0.1 mLシリンジに準備します。挿管した雌のHarlan dolly ratを2.5% isofluraneで麻酔管理します。その後、足指をつねって麻酔状態を確認します。

水分補給のため、乳酸リンゲル液 3 mL を下腹部に皮下注射します。次に、動物を手術台の上で仰向けにし、四肢を優しくテープで固定します。バリカンで腹部の毛を除去し、切り落とした毛を掃除機で吸引します。

剣状突起から腹部の右下側に向かって対角線上に、2% Lidocaineを50 µLずつ連続的に注入します。次に、Betadineを用いて中心から外側に向かって3回洗浄します。その後、イソプロピルアルコールで同様に洗浄を繰り返します。

次に、あらかじめ円形の窓が開けられた手術用ドレープで動物を覆います。手術用ドレープで固定します。10番メスを使用します。

剣状突起から腹部の右下側に向かって3〜4 cmの切開を加えます。剣状突起を確認し、右側の太い血管を避けるように注意しながら、筋肉を通って垂直に右下方向へ剥離します。次に、鋏を用いて筋肉を外側に向かって切開し、横隔膜を露出させます。

36インチの3-0 Vicryl縫合糸と止血鉗子を使用し、肝臓を傷つけないよう注意してください。針を剣状突起に通し、縫合糸を半分まで引き出します。縫合糸の両端をテープでまとめ、動物の頭側かつ背側の点に固定して剣状突起を吊り上げ、さらに別の36インチの3-0 Vicryl縫合糸を用いて横隔膜を露出させます。

剣状突起に最も近い筋肉に針を刺し、再度引き抜いて手術台の右側の別の点に固定し、手術腔を完全に露出させます。次に、小型のラット歯用マイクロ鉗子を用いて横隔膜の中心を掴んで引き出し、鈍端剪刀でごく小さな切開を加えます。この穴を開けると、肺が後退します。

心臓を視認するため、横隔膜を垂直に2〜3 cm切開します。次に、腔の左側に3インチの綿棒を挿入し、肺を脇に押し除けます。タオルクランプを用いて、綿棒を所定の位置に固定します。

別の綿棒を使用して右肺をどかし、心膜嚢を確認します。次に、マイクロ鉗子と大型のセレーション鉗子を用いて心膜嚢を切り開き、心尖部を露出させます。右の歯付きマイクロ鉗子で心尖部を固定し、針を挿入して、溶媒化マトリックスを針先の斜面を左に向けて注入します。

心尖部から心外膜面に平行に3分の1まで上がった位置に針を刺します。この際、大心静脈を避けるように注意してください。可溶化したマトリックスゲルを注入し、数秒待ってから針を抜きます。

注射部位の組織が白くなったことを確認し、腔内の血液をスワブで拭き取ります。曲線状のマイクロ止血鉗子を用いて、右肺を固定しているタオルクランプとスワブを取り除き、30インチの5-0プロリン縫合糸で最初の結び目を作ります。次に、ラット用歯付きマイクロ鉗子を使用し、テーパー針による連続縫合で横隔膜を完全に閉鎖します。PE1 60吸引チューブを挿入し、その周囲を閉鎖した後、10 mLシリンジを用いて胸腔内を排液します。

縫合糸を締め上げると、横隔膜が凹状になります。フッ素氷を1%まで下げます。腔を広げた状態で保持している3-0 Vicryl縫合糸を2本とも取り出します。筋肉を湿らせ、余分な水分を綿棒または滅菌ガーゼで拭き取ります。

新しい3-0縫合糸を用い、断続縫合で筋肉層を閉鎖します。その後、イソフルランを停止します。患部を洗浄し、ステープラーで皮膚を閉鎖します。

次に、切開部位に3種混合抗生物質軟膏を塗布します。100%酸素下でラットを回復させます。動物が人工呼吸器の周囲で自発呼吸を始めたら、気管チューブを抜去してください。

動物が立ち上がったら、塩酸ブプレノルフィン鎮痛剤を0.05 mg/kgで皮下投与し、滅菌タオルの敷いたホームケージに戻します。可溶性マトリックスゲルを注入したラットの心臓組織を切り出し、さまざまな時点でヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織全体の解析を行いました。手術直後の早い時点では、注入部位はピンク色の線維状ネットワークとして現れ、時間が経過すると間質に広がった様子が観察されました。

2週間後に細胞の流入が観察されます。注入されたマトリックスの分解が見られます。ECMを注入前にビオチンで標識していた場合、ビオチンをHRP結合ストレプトアビジンで染色することで、マトリックス注入領域における血管の進入と形成をより直接的に可視化することが可能です。

ここでのスライドは、Fitzyで共染色されています。緑色で示されているのは内皮細胞に結合する接合セレクトリンであり、赤色で示されているのは抗平滑筋アクチン抗体です。注射部位の近くに幹細胞が確認される場合もあります。

ここでは、C kitに対する免疫組織化学染色を用いて可視化されています。このビデオを視聴することで、脱細胞化組織から可溶化ECMを作製し、心臓組織工学への応用に向けてin vivoで試験する方法について十分に理解できたはずです。今回は心膜組織を使用しましたが、この一般的な手順を修正すれば、あらゆる組織源に使用できることを忘れないでください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。