Name: 新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ、ラット新生児大脳皮質由来グリア細胞と背根神経節ニューロンの共培養系を用いて、グリア細胞の不均一性が軸索成長とニューロン接着に与える影響を解析する方法。神経発生研究に有用です。

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この研究はFMMU新しい発見の基盤と部分的にNIHの資金提供によってサポートされていました。

1。グリア細胞培養グリア細胞は中枢神経系のさまざまな地域から培養することができる。全体のプロセスは、プロセスの図に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="プロセス1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="プロセス1"> 1日目コーティング培養プレートとカバースリップ<ol><li>オートクレーブで滅菌したガラスの顕微鏡の円形のカバースリップを乾かします。 </li><li>滅菌24ウエル培養プレートにプレート滅菌カバースリップ。 </li><li>コー​​トポリ-リジンと根温下で2時間インキュベートするとカバースリップ。 </li><li>ステップ3と同じ方法でコート6ウェル培養プレート。 </li><li>カバーガラスと蒸留水と文化のフードの乾燥空気と二度6ウェル培養プレートを洗浄してください。 </li><li> 24ウェルプレートに各ウェルに200μLのDMEM培地（10％FBS）を追加し、6ウェルプレートの各ウェルに2mLのと、5％CO 2で37度の下インキュベーターに入れてください</li></ol>皮質とグリア細胞培養を分離する2日目<ol><li>正流の解剖のフードを滅菌する。 </li><li> 20分間UVライトをオンにします。 </li><li> 70％エタノールですべての面をスプレーし、使用前に15分待つ。 </li><li>緊張変更：麻酔ラットの低体温による仔（P2〜P6）、およびオペレーティングはさみを使用してframenマグナムのベースで首を切る。 </li><li>頭蓋骨オフアイリスのはさみと皮を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。 </li><li>前脳を除去し、チルドL15培地中にそれらを置くには、実体顕微鏡下で、慎重に、血管を硬膜と軟膜膜をきれいに皮質を分離し、L15培地で数回洗浄する。 </li><li>マイクロサージェリーのはさみと小さな断片に皮質を切り取ります。 </li><li>皮質の部分と15分間37℃でインキュベートにL15培地を用いて調製したトリプシン- EDTA 0.125パーセントを追加。 </li><li>火ポリッシュガラスPasteureピペットで20回上下に組織液を吸引し、最終濃度の10ug/mLへのDNaseストック溶液を追加し、50mLのチューブに20％FBSと20mlのDMEM培地に組織ブロックを転送する、単一の細胞懸濁液を収集する。 </li><li> 10％FBSを含むDMEM中で、DMEM培地で細胞懸濁液を再サスペンド細胞を一度に洗う、5000-10000/cm 2で、血球計数器を顕微鏡下で種子の細胞を細胞を数える。 37度5パーセントインキュベーター内で細胞を維持するため、週に培地2回の半分を変更する。 </li></ol> 2。後根神経節ニューロンの単離、培養および精製 1日目は、文化の材料を準備します。 <ol><li>コー​​トポリ-リジン、洗浄カバーグラスを持つ滅菌カバーグラスが水と空気の乾燥を蒸留で2回、24ウェルプレートに入れてください。 </li><li> 2パーセントB27と2.5S NGF（50 ng / mL）を持つ100μLNeurobasal培地を追加し、37度5％CO 2にプレートを置く。 </li></ol> 2日目は、胚からDRGSを分離<ol><li>グリア細胞培養と同じように流フードを滅菌。 </li><li> CO 2、70％エタノールで滅菌腹部に過剰投与による妊娠ラット（E15）を安楽死、胚を子宮から単離し、チルドL15培地に入れた。 </li><li>実体顕微鏡とチルドL15培地で35ミリメートル料理への転送で接続後根神経節と脊髄を分離する。 </li><li>単一の細胞懸濁液を収集し、NBFの培地（2％B27と2.5S NGF（50 ng / mLの）を含むNeurobasal培地）で1回洗浄する。 </li></ol> 3日目は、DRGニューロンを精製<ol><li>ニューロンの播種後18時間〜24時間、20μMの最終濃度と、200μLの最終容量にニューロンの培養液に1 mMの濃FUDRのストック溶液を加える。 </li><li> 72時間後から、FUDRなしで2パーセントB27と2.5S NGF（50ng/mL）を含むNeurobasal培地で半分培地を交換してください。その後、一日おきに培地を変更してください。 </li></ol> 3。グリア細胞との共培養DRGニューロン<ol><li>グリア細胞培養がコンフルエンス（播種後20日前後）に達したとき、彼らはニューロンとの共培養のための準備ができていました。 </li><li> 24時間精製されたニューロンを追加する前に、グリア細胞の培地を2％B27と2.5S NGF（50 ng / mL）を含むNeurobasal培地に変更されました。 </li><li>精製された神経細胞が培養ウェルから収集された、単一細胞の懸濁液は、火災研磨Pasteureのピペットを介して機械的に渡すことで得られた。 </li><li>数をカウントした後に、ニューロンを2％B27と2.5S NGF（50ng/mL）を含むNeurobasal培地でコンフルエントグリア細胞に500/cm 2で播種した。 </li><li>グリア細胞の神経細胞の接着や神経突起の成長を記録し、細胞型特異的抗体を用いて画像解析ソフトウェアと免疫細胞化学によって異なる時点で分析することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果<ol><li> グリア細胞の培養：接種した後、グリア細胞は20日周りにコンフルエントになる。位相コントラストmicrosc下OPE、それは簡単に別の形態学的なグリア細胞の亜集団は異なった成長パターンの部分構造を形成し、immuocytochemisty手法（図1、図2）で示されるようにGFAP正のアストロサイトは90％以上を占めることが確認された。 </li><li> DRGニューロン文化：私たちの方法では、72時間FUDRの治療後、DRGニューロンの純度は6日以内に99％にも達するだろう、DRGニューロンは、そのユニークな形態を示し、高密度の神経突起の成長（図3、図4）で。 </li><li> グリア細胞と神経細胞の共培養：DRGニューロンの接着や神経突起伸長は播種後4時間以内にグリア細胞に容易に発生し、注意深い観察がニューロンの接着や神経突起の成長は特殊な成長パターンの部分構造を形成するグリア細胞の亜集団の影響を受けていたことを示した、これは容易に同定することができた位相差顕微鏡下および免疫細胞化学（図5、図6）から。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。コンフルエントグリア細胞の形態。皮質のグリア細胞はポリリジンコートしたカバースリップ上に播種し、20日間培養した、グリア細胞、放射方向に配置された左側のセルの異なる成長パターンに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）抗体で標識したコンフルエントグリア細胞は。右側のGFAP（赤）陽性細胞の放射配置に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。後根神経節ニューロンはFUDRの治療せずにin vitroで成長した。混入細胞はDRGニューロン"の背景を形成する。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。後根神経節ニューロンはFUDRの治療後にin vitroで成長した。背景混入細胞が完全に除去されていた。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。グリア細胞上に成長した後根神経節ニューロン。神経細胞の接着や神経突起の成長は、放射配置細胞に阻害し、右側のグリア細胞に限られていた。 <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。ニューロフィラメント抗体で標識されたグリア細胞に成長する後根神経節ニューロン。神経突起（緑色）が抑制された左側のグリア細胞を配置し、右側に限ら照射で、すべてのグリア細胞はGFAP抗体（赤）で標識した。

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

この実験のプロトコルは、グリア細胞、神経細胞の接着や神経突起の成長に特にアストロサイトの不均質性の影響を検討する2つの目標を達成するために設計されました。最初の目標は、この実験ではアストロサイトの不均一性を可能な限り、維持することでした、コンフルエントグリア細胞培養濃縮星状膠細胞は、さらに細胞を損傷し、アストロサイトの傷害応答を誘発する可能性のある化学的処理と消化の伝播、なしで初代培養を混合した。最後の星状膠細胞純度はfibrobasts FNによって検証として1％未満汚染の線維芽細胞で、90％以上GFAP陽性である。始まる作られた細胞における低播種密度は、合流前に分裂のいくつかのラウンドを受ける。位相差顕微鏡下では、グリア細胞の不均一性は、異なる形態的星状膠細胞によって形成された別の部分構造が観察された。第二の目標は、高精製されたDRGニューロンを取得することでしたし、ニューロンの動作上の不均質性の影響を検討するグリア細胞でそれらを共培養。このような線維芽細胞やシュワン細胞などの後根神経節における混入細胞は明らかにこの不要な影響を避けるために、培養条件5,6の軸索の成長に影響を及ぼすか変えることができる、DRGニ...

<table><tbody><tr><td>DMEM(high glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>L15培地</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ポリリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>培養グレード</td></tr><tr><td>NGF(2.5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>ニューロフィラメント抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

すべての哺乳類の中枢神経系では、損傷後の切断軸索が元のターゲットに再生成することができないと機能回復は1非常に悪いです。軸索再生の失敗は、敵対的なグリア細胞の環境を含むいくつかの要因の組み合わせの結果である、抑制性ミエリン関連分子と内因性ニューロン再生の容量2を減少させた。アストロサイトは、中枢神経系で最も優勢なグリア細胞の種類であり、生理学及び病理学の条件3の下軸索の機能に重要な役割を果たす。相同なオリゴデンドロサイトとは対照的に、アストロサイトは、多様な形態と遺伝子発現4別の星状膠細胞亜集団によって構成される不均一な細胞集団である。このような軸索の成長に与える影響として、この不均一性の機能的意義は、、あまり知られていない。 特にグリア細胞、神経細胞の挙動におけるアストロサイト異質の機能を調べるために、我々は、ラットの大脳皮質から得られるグリア細胞と共培養する高精製された後根神経節の神経細胞によって新しい方法を確立した。この技術によって、我々が直接、同一条件で別の星状膠細胞の亜集団のニューロンの接着と軸索の成長を比較することができた。 このレポートでは、我々はこのアストロサイトの単離および培養のための方法、後根神経節ニューロンの単離及び精製、及びアストロサイトとニューロンのDRGの共培養の詳細なプロトコルを与える。この方法はまた、ニューロンとグリア細胞間の細胞または地域の特定の相互作用を研究するために他の脳領域に拡張することができます。

このプロトコルでは、我々は、ある軸索の成長にグ​​リア細胞の不均一性の影響を研究する新しい方法を説明<em&gt; in vitroで</em&gt;共培養系。ラット皮質グリア細胞をコンフルエントに培養し、高度にラットの後根神経節の神経細胞を精製して培養した。神経細胞の接着や軸索の成長上の別のグリア細胞の影響は、同じ文化の中で直接比較した。このメソッドは、直接神経細胞の接着や軸索の成長に対するグリア細胞の不均一性の影響を研究する新しい方法を提供します。

すべての哺乳類の中枢神経系において、損傷後に切断された軸索は元の標的に向かって再生することができず、機能回復は...

本手順の全体的な目的は、グリア細胞の不均一性がDRG軸索成長および細胞分化に及ぼす影響を研究することです。まず、新生ラット皮質からグリア細胞を分離します。次に、ラット胚DRGニューロンを培養し、精製します。手順の3番目のステップは、精製したDRGニューロンをグリオ細胞上に添加することです。手順の最終ステップは、軸索の伸展を観察し、細胞染色および定量分析を行うことです。これにより、最終的な結果を得ることができます。タイムラプス記録と免疫蛍光顕微鏡法を用いて、DRGニューロンの成長が不均一なグリア細胞によって影響を受けることを示します。こんにちは、私はUCLA神経内科学、神経イメージング研究室の者です。本日は、新しい共培養法を用いて、グリア細胞の不均一な影響が成長に及ぼす影響を研究するための手順をご紹介します。当研究室では、ニューロンとグリア細胞の相互作用を研究するためにこの新しい手法を用いています。それでは、実験方法を確認しましょう。グリア細胞と後根神経節（DRG）ニューロンの共培養系を構築するために、まず組織培養フード内でグリア細胞の培養から開始します。あらかじめ滅菌した24ウェル培養プレートの底に、滅菌済みの円形ガラスカバースリップを敷きます。6ウェル培養プレートのウェル内のカバースリップをポリリシンでコートし、室温で2時間インキュベートします。カバーガラスと培養プレートを蒸留水で2回洗浄し、風乾させます。次に、24ウェルプレートまたは6ウェルプレートの各ウェルに、10%胎児牛血清（FBS）を添加したDC-modified Eagle's mediumまたはDMEMを、それぞれ200 µLまたは2 mLずつ分注します。翌日まで、37 °C、5% CO₂の条件下でプレートをインキュベートします。陽圧フロークリーンベンチを滅菌します。UVライトを20分間点灯させた後、ベンチ内のすべての表面に70% ethanolをスプレーし、15分間待機してから使用します。低体温法で麻酔をかけたP2からP6のラット仔マウス2匹の頭部から処置を開始します。次に、手術用はさみを用いて、大後頭孔の基部で断頭します。アイリス剪刀で正中縫合に沿って頭蓋骨を開き、頭蓋蓋を取り除きます。前脳を取り出し、冷却した Levo Wit's L 15 液に入れ、2つ目の頭部でも同様の操作を繰り返します。次に、実体顕微鏡下で操作を行います。硬膜および脳を覆っている膜と血管を慎重に取り除きます。皮質を単離し、L 15培地で数回洗浄します。顕微手術用鋏を用いて、皮質を小さく切り分けます。次に、0.125% trypsin-EDTAを含むL 15培地中で37°Cで15分間インキュベートします。その後、組織片を20% FBS含有DMEM 20 mLが入った50 mLチューブに移します。DSを最終濃度10 µg/mLになるように加えます。次に、火炎滅菌したパステールピペットを用いて組織溶液を約20回撹拌し、細胞を分離させます。最後に、10% FBS含有DMEMで細胞を1回洗浄し、ヘモサイトメーターで細胞数を測定します。次に、1 cm²あたり5,000～10,000個の密度で細胞を播種し、37 °C、5% CO₂でインキュベートします。DRGを単離・精製し、培養するために、培地を週に2回交換します。まず、前述の手順に従い、ポリリシンでコートしたガラスカバースリップを敷いた24ウェルプレートを用意します。各カバースリップに100 µLのNVF培地を加え、翌日まで37 °Cでプレートをインキュベートします。前回と同様に、ポジティブフローフードを滅菌します。次に、二酸化炭素で安楽死させた妊娠ラットの子宮から実体顕微鏡下で分離した、胎生12日から15日（E 12〜E 15）のラット胚を用いて操作を開始します。接続された後根神経節（DRG）を含む脊髄を分離し、冷却したL-15培地が入った35 mmディッシュに移します。マイクロサージェリー用ピンセットを用いて、DRGを損傷しないように注意しながら、冷却したL-15培地中で脊髄から接続されたDRGを慎重に切り離し、接続している軸索を切断します。通常、脊髄からすべてのDRGを分離し終えると、1本の脊髄から20〜30個のDRGが単離されます。単離したすべてのDRGを0.125%trypsin-EDTAに入れ、37°C、5%CO2条件下で20分間インキュベートします。20%FBS含有DMEMで細胞を1回洗浄し、その後DNAsを加えて、グリア細胞の手順と同様に、火炎研磨したパステールピペットで数回ピペッティングし、均一な細胞懸濁液を作成します。MBF培地で2回目の洗浄を行い、細胞数をカウントした後、準備した24ウェルプレートのカバーガラス上に1ウェルあたり5,000個の細胞を播種し、一晩インキュベートしてDRGニューロンを純化します。播種から18〜24時間後。培地を20 µMの5-フルオロウラシル-2'-デオキシウリジン（FUDR）を含むニューロベーサル培地に交換します。72時間後、培地の半分をFUDRを含まないニューロベーサル培地で置換します。その後、培地を1日おきに交換します。グリア細胞を播種してから約20日後に、細胞はコンフルエンスに達し、2つの細胞型を混合する24時間前にニューロンとの共培養が可能な状態になります。グリア細胞培地をMBF培地に交換します。既報の手法に従い、精製したDRGの単一細胞懸濁液を調製します。細胞密度を測定します。次に、神経細胞を1cm²あたり500個の密度でグリア細胞上に播種します。グリア細胞上の神経細胞の生存および神経突起の伸長は、画像解析ソフトおよび細胞型特異的抗体を用いた免疫化学的染色により、さまざまな時点で解析することが可能です。ここでは、個別に培養した場合と共培養した場合のグリア細胞およびDRGニューロンの例を示します。グリア細胞は20日後にコンフルエントになります。培養において、位相差顕微鏡で観察すると、異なるグリア細胞のサブポピュレーションがそれぞれ異なる増殖パターンと形態を形成していることが明らかになりました。また、免疫細胞化学染色により、GFAP陽性アストロサイトが培養細胞の90%以上を占めていることが示されました。FUDRを用いて72時間処理するという我々の手法を用いることで、DRGニューロンの純度は6日以内に99%に達し、ニューロンとグリア細胞の共培養において、神経突起が高密度に成長するという特有の形態を示すようになります。ニューロンの接着と神経突起の伸展は、ニューロンを播種して4時間以内にグリア細胞上で速やかに起こりました。ニューロンの接着と神経突起の成長はグリア細胞のサブポピュレーションの影響を受けており、それらは位相差顕微鏡下で容易に識別可能な、特殊な成長パターンを形成する下部構造を構築します。そして、免疫細胞化学によって、グリア細胞の不均一性が神経成長に与える影響を研究するために、いかにしてDRGニューロンをグリア細胞と共に共培養するかを提示します。本セッションを行う際は、組織を非常に慎重に扱い、細胞を常に培地中に保持することが極めて重要です。細胞を空気にさらしたり、乾燥させたりしないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Neuroscience

神経科学

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