新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

本手順の全体的な目的は、グリア細胞の不均一性がDRG軸索成長および細胞分化に及ぼす影響を研究することです。まず、新生ラット皮質からグリア細胞を分離します。次に、ラット胚DRGニューロンを培養し、精製します。

手順の3番目のステップは、精製したDRGニューロンをグリオ細胞上に添加することです。手順の最終ステップは、軸索の伸展を観察し、細胞染色および定量分析を行うことです。これにより、最終的な結果を得ることができます。

タイムラプス記録と免疫蛍光顕微鏡法を用いて、DRGニューロンの成長が不均一なグリア細胞によって影響を受けることを示します。こんにちは、私はUCLA神経内科学、神経イメージング研究室の者です。本日は、新しい共培養法を用いて、グリア細胞の不均一な影響が成長に及ぼす影響を研究するための手順をご紹介します。

当研究室では、ニューロンとグリア細胞の相互作用を研究するためにこの新しい手法を用いています。それでは、実験方法を確認しましょう。グリア細胞と後根神経節（DRG）ニューロンの共培養系を構築するために、まず組織培養フード内でグリア細胞の培養から開始します。あらかじめ滅菌した24ウェル培養プレートの底に、滅菌済みの円形ガラスカバースリップを敷きます。6ウェル培養プレートのウェル内のカバースリップをポリリシンでコートし、室温で2時間インキュベートします。

カバーガラスと培養プレートを蒸留水で2回洗浄し、風乾させます。次に、24ウェルプレートまたは6ウェルプレートの各ウェルに、10%胎児牛血清（FBS）を添加したDC-modified Eagle's mediumまたはDMEMを、それぞれ200 µLまたは2 mLずつ分注します。翌日まで、37 °C、5% CO₂の条件下でプレートをインキュベートします。

陽圧フロークリーンベンチを滅菌します。UVライトを20分間点灯させた後、ベンチ内のすべての表面に70% ethanolをスプレーし、15分間待機してから使用します。低体温法で麻酔をかけたP2からP6のラット仔マウス2匹の頭部から処置を開始します。

次に、手術用はさみを用いて、大後頭孔の基部で断頭します。アイリス剪刀で正中縫合に沿って頭蓋骨を開き、頭蓋蓋を取り除きます。前脳を取り出し、冷却した Levo Wit's L 15 液に入れ、2つ目の頭部でも同様の操作を繰り返します。

次に、実体顕微鏡下で操作を行います。硬膜および脳を覆っている膜と血管を慎重に取り除きます。皮質を単離し、L 15培地で数回洗浄します。

顕微手術用鋏を用いて、皮質を小さく切り分けます。次に、0.125% trypsin-EDTAを含むL 15培地中で37°Cで15分間インキュベートします。その後、組織片を20% FBS含有DMEM 20 mLが入った50 mLチューブに移します。

DSを最終濃度10 µg/mLになるように加えます。次に、火炎滅菌したパステールピペットを用いて組織溶液を約20回撹拌し、細胞を分離させます。最後に、10% FBS含有DMEMで細胞を1回洗浄し、ヘモサイトメーターで細胞数を測定します。

次に、1 cm²あたり5,000～10,000個の密度で細胞を播種し、37 °C、5% CO₂でインキュベートします。DRGを単離・精製し、培養するために、培地を週に2回交換します。まず、前述の手順に従い、ポリリシンでコートしたガラスカバースリップを敷いた24ウェルプレートを用意します。

各カバースリップに100 µLのNVF培地を加え、翌日まで37 °Cでプレートをインキュベートします。前回と同様に、ポジティブフローフードを滅菌します。次に、二酸化炭素で安楽死させた妊娠ラットの子宮から実体顕微鏡下で分離した、胎生12日から15日（E 12〜E 15）のラット胚を用いて操作を開始します。

接続された後根神経節（DRG）を含む脊髄を分離し、冷却したL-15培地が入った35 mmディッシュに移します。マイクロサージェリー用ピンセットを用いて、DRGを損傷しないように注意しながら、冷却したL-15培地中で脊髄から接続されたDRGを慎重に切り離し、接続している軸索を切断します。

通常、脊髄からすべてのDRGを分離し終えると、1本の脊髄から20〜30個のDRGが単離されます。単離したすべてのDRGを0.125%trypsin-EDTAに入れ、37°C、5%CO2条件下で20分間インキュベートします。20%FBS含有DMEMで細胞を1回洗浄し、その後DNAsを加えて、グリア細胞の手順と同様に、火炎研磨したパステールピペットで数回ピペッティングし、均一な細胞懸濁液を作成します。MBF培地で2回目の洗浄を行い、細胞数をカウントした後、準備した24ウェルプレートのカバーガラス上に1ウェルあたり5,000個の細胞を播種し、一晩インキュベートしてDRGニューロンを純化します。

播種から18〜24時間後。培地を20 µMの5-フルオロウラシル-2'-デオキシウリジン（FUDR）を含むニューロベーサル培地に交換します。72時間後、培地の半分をFUDRを含まないニューロベーサル培地で置換します。

その後、培地を1日おきに交換します。グリア細胞を播種してから約20日後に、細胞はコンフルエンスに達し、2つの細胞型を混合する24時間前にニューロンとの共培養が可能な状態になります。

グリア細胞培地をMBF培地に交換します。既報の手法に従い、精製したDRGの単一細胞懸濁液を調製します。細胞密度を測定します。

次に、神経細胞を1cm²あたり500個の密度でグリア細胞上に播種します。グリア細胞上の神経細胞の生存および神経突起の伸長は、画像解析ソフトおよび細胞型特異的抗体を用いた免疫化学的染色により、さまざまな時点で解析することが可能です。ここでは、個別に培養した場合と共培養した場合のグリア細胞およびDRGニューロンの例を示します。グリア細胞は20日後にコンフルエントになります。

培養において、位相差顕微鏡で観察すると、異なるグリア細胞のサブポピュレーションがそれぞれ異なる増殖パターンと形態を形成していることが明らかになりました。また、免疫細胞化学染色により、GFAP陽性アストロサイトが培養細胞の90%以上を占めていることが示されました。

FUDRを用いて72時間処理するという我々の手法を用いることで、DRGニューロンの純度は6日以内に99%に達し、ニューロンとグリア細胞の共培養において、神経突起が高密度に成長するという特有の形態を示すようになります。ニューロンの接着と神経突起の伸展は、ニューロンを播種して4時間以内にグリア細胞上で速やかに起こりました。ニューロンの接着と神経突起の成長はグリア細胞のサブポピュレーションの影響を受けており、それらは位相差顕微鏡下で容易に識別可能な、特殊な成長パターンを形成する下部構造を構築します。そして、免疫細胞化学によって、グリア細胞の不均一性が神経成長に与える影響を研究するために、いかにしてDRGニューロンをグリア細胞と共に共培養するかを提示します。

本セッションを行う際は、組織を非常に慎重に扱い、細胞を常に培地中に保持することが極めて重要です。細胞を空気にさらしたり、乾燥させたりしないでください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。