Name: 電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ電子スピン共鳴顕微鏡法による生細胞周辺の酸素濃度三次元マッピング。シアノバクテリアを用いてミクロン級の高解像度イメージングを実現し、光照射下の酸素動態を詳細に解析する手法です。

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この作業は、部分的にgrantないによってサポートされていました。イスラエル科学財団から213/09には、何を許可しない。 BSF基礎から2005258、助成金がない。欧州研究評議会（ERC）から201665、およびテクニオンでラッセルベリーナノテクノロジー研究所による。我々は、シアノバクテリアの供給及び取り扱いに関するテクニオンの化学のシューリックの学部から教授ノームADIRとファリスサラミの助けを認める。テクニオンマイクロナノファブリケーションユニットからのヘルプとスヴェトラーナYoffisのサポートが大幅に高く評価されています。

1。 ESRマイクロイメージングの概要最初に、我々は、ESRの簡単な説明、ESR顕微鏡、そして私たちのシステムのさまざまなコンポーネントを提供し、我々は、実際のイメージング実験を説明します。 電子スピン共鳴は、特定の周波数での電磁放射が外部静磁場（図1）下に置かれ、不対電子のスピンを持つ分子によって吸収される分光技術です。 ESRは、フリーラジカルや常磁性中心の検出と識別のために、このような化学、生物学、物理学、材料科学などの科学の幅広い分野で採用されている。それはライブの種で常磁性分子の環境を研究するための強力な方法であり、酸性度（pH値）、粘度、酸素、および活性酸素種の濃度が3に関する情報を提供します。 異種のサンプルについて、ESRスペクトル情報は、磁場勾配4の使用によって、（すなわち、画像を取得することによって）空間分解方法で得ることができます。これは主にプロトンのスピンを観測する磁気共鳴イメージングのより一般的な方法（MRI）と非常によく似ています。これまで、このようなESRイメージング技術は、数センチの比較的大きなサイズで、mmはスケールの分解能で生きたままの標本に適用した。 ESRイメージングにおける（例えば、参考文献5から取り出した図2を参照。）比較的最近の開発は、ミリ波、サブミリサイズの試料の測定値にミリメートルスケールの分解能で小動物を見てからその機能を拡張したものですミクロンスケールの分解能。このフィールドは、1ミクロン2（図3に代表的な例を参照）に近づい分解能で3次元ESR画像を提供することができる今日ESR顕微鏡、として知られています。 ESR顕微鏡は、従来のESR分光器と本質的に似ています。これは、取得プロセスおよびデータ処理を制御するための静的フィールド、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびコンピュータ化されたコンソールを生成するための磁石を持っています。一般的にESRイメージングユニークとESR縮小コピーを作るにも、既存の他のコンポーネントには、イメージングプローブに配置されている磁気電子システムの一部であるフィールドの勾配の源、および勾配コイルです。私たちの特定のシステムの詳細については、プロトコルの映画の中で示され、参考文献2に記載されています。 2。 ESRマイクロイメージングサンプルの調製この段階では、ESRマイクロイメージングの実験用サンプルの調製方法を説明します。この段階の細胞の最後にトリチルラジカル6の緩衝液と一緒に特別に準備ガラスのESR顕微鏡の試料容器の底部に配置されます。このプロトコルは、シアノバクテリア細胞の測定を説明し、従って、細胞の他のタイプのため、適切な調整は、サンプルの準備段階で必要になることがあります。 <ol><li>最初に、〜400 400μmの大きさと吸収紙のいくつかの正方形を取り、続いてシアノバクテリア懸濁液1.2 mlを（40 mg / mLの濃度で）で満たされているエッペンドルフチュー​​ブに挿入されます。 </li><li>懸濁液を微量遠心機で6000rpmで2分間遠心分離する。 </li><li>この後、上清バッファが完全に藍藻脱水​​を避けるために残っている〜50μLを除いて削除されます。このプロセスの結果として、吸収紙は現在シアノバクテリアの細胞が飽和している。 </li><li>細かいピンセットを使って、いくつかの繊維が紙から抽出され、カップ状、特別に準備ガラスの試料ホルダー7の底部に配置されます。 BG - 11溶液8、9のトリチル3mMのは（スキーム1参照）細かいシリンジの援助により、試料ホルダーに追加されていることを以下。ホルダーは、小さな排気口が開いたまま、UV硬化型接着剤を用いて封止されている。 <table border="1"><tbody><tr><td> 株式4 </td><td> 株式3 </td><td> 在庫2 </td><td> 在庫1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4：3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4を ： 7H 2 O 7.5g/liter </td><td>のNa 2 MgのEDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2を ：4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸第二鉄アンモニウムの0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 · 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸：1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> 4 ·：5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> 塩化カルシウム：2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td>のCoCl 2 ：6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4：2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> スキーム1。BG - 11培地の調製。 </li></ol> 3。 ESRマイクロイメージング実験<ol><li>イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムをオンにし、イメージングプローブの内部に入ることを共振器に試料を挿入する。 </li><li>今、コンピュータの制御ソフトウェアを使用して、"チューニング"モードでシステムを設定し、ESR測定に使用されるプローブの共振マイクロ波の周波数を見つける。 </li><li>ていることに続いて、適用されるマイクロ波の周波数と一致する値に静磁場を設定し、パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定してもシステムが機能するとサンプルが十分用意されていることを確認するためにESR信号を観測。 </li><li>その後、このような画素数としてイメージングパラメータ、、勾配の強さ、そしてそれらの必要な値に勾配パルスの長さを設定します。 </li><li>セットアップに続いて、パルス間の分離、500、600の値、および700ナノ秒とハーンエコーイメージングのパルスシーケンス（図4）によって三次元ESR画像を収集する。 </li><li>サンプルで投射された光は、必要な実験条件に応じてオンまたはオフになっています。 </li><li>買収時には、データが自動的に保存されます。論文生データファイルは、トリチルラジカル濃度と緩和時間の画像をT 2、既存のキャリブレーションを介して酸素濃度の画像に変換されるマップを、提供するために、MATLABソフトウェアのスクリプトを介して処理されます。 </li></ol> 4。代表的な結果実験の結果は、異なるτの値で記録された複数の三次元ESRマイクロ画像です。典型的な生データの画像を図5に提供されています。暗条件下で測定した上位3つの画像は、信号強度の減少を除いて非常によく似ています。一方、試料の異なる部分で異なる緩和時間による光照射下での画像パターンの変化。このデータは、図6に示すように、また、緩和時間、T 2（図7）の画像、振幅の画像を取得するには、1を処理することができます。 T 2の画像は、方程式を経由して緩和時間に酸素濃度を結ぶ既存の検量線を経由して酸素濃度の値に変換されます。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式1">ここで、T 2 0は、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間（プローブの濃度、C、に応じて、その拡散係数、D）であり、kは比例定数である。ほとんどの場合、拡散係数は、（必要であれば、それは原則的に直接ESR 6,10によっても評価できる、が）ライブサンプルのためにあまり変化しない、とスピン濃度は、イメージングプロセス中に取得されたものです。したがって、この関係は直接に酸素濃度を測定することができます。 図6に戻ると、それは、シアノバクテリアの細胞は主に、サンプルホルダの右側に位置していることが振幅画像から明らかである。さらに、図7に基づいて、それは光がO 2の生産を開始し、主にシアノバクテリアに近いボクセルで、ソリューションのO 2濃度の有意な増加を引き起こすことは明らかである。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：電子スピン共鳴のエネルギー準位。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：担癌マウスの代表的な酸素濃度のイメージ。左の画像は、MRI画像に基づいて、解剖学的情報を示しています。安定した遊離有機ラジカルは、マウスに注入し、そのESR特性は、その環境での酸素濃度を（右）を提供した。 ESRベースの結果は、MRI解剖学的画像上に重畳されています。ビューのフィールドは32 mmです。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：高分解能マイクロスケールのESの二つの例N @ C 60粉末（左）とLiPc常磁性結晶とフォトリソグラフィにより生成されたサンプルのRの画像（右） <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：典型的なマイクロ波を示すハーンイメージングパルスシーケンス（MW）と勾配、G X、G y及びG zのパルス。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：典型的な生データESRマイクロ画像：a、b、およびcはそれぞれ、τ= 500600700ナノ秒で測定された無光照射によるシアノバクテリアサンプルの生データです。項目D、E、及び、b、およびcと同じですが、光照射と同じです。強度は、（が、3つの暗いまたは明るい生データの画像の各セット内で一貫している）任意のスケールでプロットされています<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6：溶液中のラジカル濃度（任意スケール）に対応する振幅画像。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7：T 2の画像と対応する値が暗い（左）とライト（右）の条件の下で[O 2]。

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
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<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、ESRマイクロイメージングは​​、ライブの小さな試料の近くに酸素濃度をマップに適用できる方法を示しています。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それは細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。近い将来、我々はもちろんのスーパーオキシドの濃度、酸性度（pH値）、プローブの拡散係数と、酸素濃度などのコントラストのパラメータを提供、さらに数ミクロンの分解能でのライブのサンプル画像を提供するために、この方法論を改善する予定。これらの機能は、両方ともコントラストタイプのとまたサンプルの特性（例えば、非透過的な厚さのサンプルと、いくつかのケースでは、細胞対細胞の測定）の点で現在の光ベースの手法と相補的である。

<table><tbody><tr><td>遠心分離機</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>完全重水素化トリアリルメチル（トリチル）ラジカル</td><td>ノボシビルスク</td><td></td><td>参考文献 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;に記載の方法を用いてノボシビルスクにて合成</td></tr><tr><td>BG-11バッファー</td><td></td><td></td><td>調製手順については、スキーム1および参考文献8、9を参照</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>紫外線硬化剤</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63またはNOA61</td><td></td></tr></tbody></table>

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

このプロトコルは、ミクロンスケールの分解能1で生きている細胞の直接の環境中の酸素濃度の三次元マッピングのための電子スピン共鳴（ESR）マイクロイメージングの方法を説明します。酸素は生命のサイクルの中で最も重要な分子の一つである。それはミトコンドリアで酸化的リン酸化の端末の電子受容体として機能し、活性酸素種の生産に使用されています。酸素の測定は、ミトコンドリアや代謝機能、シグナル伝達経路、様々な刺激、膜透過性、および疾患の分化の効果の研究に重要である。酸素消費量は、全体の生物への細胞へのミトコンドリアからの様々な生物学的システムに広く適用可能である、したがって、細胞代謝の有益なマーカーです。その重要性から、多くのメソッドは、ライブシステムでの酸素の測定のために開発されている。高解像度の酸素のイメージングを提供するために、現在の試みは、主に彼らは高い光毒性および低酸素感度を持つプローブを採用するとして、満足のいく結果を提供することができない光学的蛍光と燐光の方法に基づいています。サンプル中の外因性の常磁性プローブ​​からの信号を測定するESRは、酸素濃度の非常に正確な測定を提供することが知られている。典型的なケースでは、ESR測定は、プローブの線形拡大および/または局所酸素濃度に直接リンクされている緩和時間の短縮をマップします。 （酸素は常磁性であるため、外因性の常磁性プローブ​​に衝突するときに、その緩和時間を息切れ。）伝統的に、実験のこれらのタイプは、低解像度、小動物イメージングのためのミリメートルスケールのESRで行われている。ここでは、ESRイメージングも小さなライブサンプルの検査のためにミクロンスケールで実施することができる方法を示します。 ESRマイクロイメージングは、室温2で1ミクロンに近づき解像度と空間分解ESR信号の取得を可能にする比較的新しい手法です。このプロトコルは、紙の主な目的は、この新しいメソッドは、新しく開発された酸素に敏感なプローブと一緒に、小さなライブ試料中の酸素濃度のマッピングに適用できる方法を示すことです。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それはまた、細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。

本プロトコルでは、近接環境における酸素濃度の三次元マッピングを目的とした、電子スピン共鳴（ESR）マイクロイメージング法について解説します。

本実験の全般的な目的は、電子スピン共鳴（ESR）顕微鏡を用いて、生存細胞の直近環境における酸素濃度のミクロンスケールの3次元画像を取得することです。本プロトコルでは、一般的な光合成細胞であるシアノバクテリアを用いて実演します。まず、ESR顕微鏡用サンプルホルダー内でシアノバクテリア細胞の試料を調製することで、これを達成します。安定な有機ラジカル溶液に埋め込みます。サンプルホルダーをイメージングプローブ内に設置し、それをESR顕微鏡システムの静電磁石内に挿入します。これにより、ESR顕微鏡を用いて有機ラジカル溶液の3次元ESRマイクロイメージを数枚取得します。これは、複数のパルスシーケンスのバリエーションで行われ、また、明暗条件などの様々な外部条件下で実施されることが多い。次に、コンピュータで生データ画像を処理し、ラジカルの3次元空間分解能を持つ緩和時間を抽出する。これらの緩和時間は、既存のキャリブレーションを通じて酸素濃度の直接的な指標となり、様々な外部条件下における測定サンプルの完全な3次元酸素マップが得られる。光を照射しない場合、シアノバクテリアによる酸素生成が行われないことが明確に示されました。さらに、光照射下では、シアノバクテリア細胞の近傍に顕著な酸素勾配と酸素の不均一性が生じることが示されました。こんにちは、私はハイファにあるイスラエル工科大学（Technion）化学部のBLA研究室のalです。本日は、ファイバーアーム顕微鏡を用いて、生細胞近傍の酸素濃度を高い空間分解能で三次元的にマッピングする手順をご紹介します。当研究室では、細胞の酸素消費速度や代謝活性を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。電子スピン共鳴（ESR）は、外部静磁場下に置かれた不対電子スピンを持つ常磁性種が、特定の周波数の電磁放射線を吸収する分光技術です。これは、酸素濃度や活性酸素種を含む、生体内の常磁性分子の環境を調べるための強力な手法です。ここでは、不均一なサンプルの例として、腫瘍担持マウスの典型的な酸素濃度画像を示します。磁場勾配を用いることで、ESRスペクトル情報を空間的に分解して得ることができます。安定な遊離有機ラジカルをマウスに注入し、そのESR特性から周囲の酸素濃度を算出しました。ESRによる結果をMRI解剖画像に重ね合わせて表示しています。これまで、生体試料に対するこのようなESRイメージング技術は、ミリメートルスケールの比較的大きなサンプルを用いてのみ実施されてきました。高分解能ESR顕微鏡法では、ミリメートルおよびサブミリメートルサイズのサンプルを測定することで、1 µmに迫る分解能を持つ3次元ESR画像を提供します。以下は、NNC 60粉末およびシアニド化リチウム常磁性結晶を用いて作製したサンプルの、高分解能ミクロンスケールESR画像の2つの例です。ESR顕微鏡は従来のESR分光計に似ており、静磁場を発生させるための磁石、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびデータ収集プロセスとデータ処理を制御するためのコンピュータコンソールを備えています。システムのその他の構成要素には、電子システムの一部である磁場勾配ドライバと、イメージングプローブ内に配置された勾配コイルが含まれます。グラジエントコイルには、試料への光照射を可能にする開口部があります。実験中の脱水を最小限に抑えるため、温度管理された湿潤空気が試料に供給されます。ESR顕微鏡の主な特徴は、プローブとグラジエントコイルの小型化、システムの高いスピン感度、および磁場勾配ドライバーの高強度であることです。本手順を開始する前に、濃度 40 mg/mL のシアノバクテリア懸濁液を調製してください。ESRマイクロイメージングの試料調製を開始するには、精密ピンセットを用いて、約400 by 400 µmサイズの吸収紙を数枚取り出します。次に、それらをエプンドープに挿入します。続いて、チューブにシアノバクテリア懸濁液を1.2 mL加えます。次に、マイクロ遠心分離機を用いて、懸濁液を6,000 RPMで2分間遠心分離します。遠心分離後、シアノバクテリアの脱水を避けるため、約50 µLだけを残して上清を完全に除去します。この操作により、吸着紙がシアノバクテリア細胞で飽和します。続いて、専用に調製したカップ状のガラス試料ホルダーを用意し、精密ピンセットを用いて紙から数本の繊維を抽出して、試料ホルダーの底に配置します。続いて、記述されたプロトコルに従って調製した3 mMのtridelおよびBG 11溶液を、シリンジを用いて加えます。次に、ガラス製サンプルホルダーの縁と対応するカバーガラス片の間にUV硬化型接着剤を塗布してサンプルホルダーを密封し、小さな空気抜き穴だけを開けておきます。最後に、UVライトで2秒間接着剤を硬化させます。イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムを起動し、イメージングプローブ内部の共振器に試料を挿入します。次に、コンピュータ制御ソフトウェアを使用してシステムをチューニングモードに設定し、ESR測定に使用するプローブの共鳴マイクロ波周波数を求めます。その後、印加したマイクロ波周波数に一致する値に静磁場を設定します。パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定し、ESR信号を観察して、システムが正常に機能していることおよびサンプルが適切に調製されていることを確認します。次に、ピクセル数、グラジエント強度、グラジエントパルス幅などのイメージングパラメータを必要値に設定します。セットアップ後、パルス間隔tauを500、600、700 nanosecondsとして、Hahn Echo Imagingパルスシーケンスにより3枚の3D ESR画像を収集します。この時点で、実験条件により取得期間を通じて必要な場合は、サンプルへの光照射を開始してください。データは自動的に保存されます。データ取得プロセス後、MATLABソフトウェアスクリプトを介して生データファイルを処理します。同ソフトウェアを使用して、トリルラジカル濃度と緩和時間の画像を生成します。T₂ mapを作成し、酸素濃度と緩和時間を結びつける既存の検量線を用いて、これらの画像を酸素濃度画像に変換します。ここで T₂₀ は、プローブの濃度 C および拡散係数 D に依存する、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間です。シアノバクテリアを用いて実施した複数の三次元 ESR イメージング実験から得られた典型的な生データ画像を示します。これらの画像は、暗条件または明条件の下で、異なる tau 値を用いて取得されました。暗条件下では、スピン緩和時間 T₂ による大きな T 値での強度低下を除けば、結果は非常に類似しています。逆に、光照射下では、サンプル全体で緩和時間が異なるため、画像パターンが変化します。その後、このデータを処理して、この画像から振幅画像を取得します。シアノバクテリアが主にサンプルホルダーの右側に位置していることが分かります。2つの画像は、酸素濃度と緩和時間を結びつける既存の検量線を用いて、酸素濃度の値に変換されます。光がある場合とない場合におけるシアノバクテリアの結果を以下に示します。光によって酸素生成が開始され、溶液中の酸素濃度が大幅に上昇することは明らかです。これにより、主にシアノバクテリアを含む吸収紙繊維付近のボクセルにおいて、ラジカルT2が減少します。以上で、EESR顕微鏡による酸素濃度のマッピングのために、安定自由ラジカルを含む生細胞サンプルを調製する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルの変動性を確保し、サンプルの劣化を防ぐために、時間をできるだけ短くすることが重要です。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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このプロトコルは、標準的な蛍光顕微鏡での酸素化および細胞死のマルチパラメトリック分析を使用して、バイオプリンティングのためのハイスループットスフェロイド生成を記述している。このアプローチは、スフェロイドの生存率を制御し、3D組織、腫瘍微小環境、および成功した(マイクロ)組織バイオファブリケーションのモデリングにおいて重要な標準化を実行するために適用することができる。...

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。...

生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。...

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

マウス腫瘍の定量的3D酸素マップは、パルス電子常磁性共鳴を使用して非侵襲的に画像化されました。超音波Bモードとパワードップラーは、解剖学と血管構造に使用されました。両方のモダリティからの画像を重ね合わせることで、マルチパラメトリック腫瘍解析が可能になりました。...

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング 

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

私たちは、光学多層干渉断層撮影(OMLIT)という新しいイメージング技術を導入し、脳標本内のすべての細胞をメソスケールで偏りなくイメージングでき、同じサンプル上のテープベースのシリアル走査型電子顕微鏡のイメージングワークフローにシームレスに統合できます。...

走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

学ぶ電子スピン共鳴顕微鏡法による生細胞周辺の酸素濃度三次元マッピング。シアノバクテリアを用いてミクロン級の高解像度イメージングを実現し、光照射下の酸素動態を詳細に解析する手法です。

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

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