電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

本実験の全般的な目的は、電子スピン共鳴（ESR）顕微鏡を用いて、生存細胞の直近環境における酸素濃度のミクロンスケールの3次元画像を取得することです。本プロトコルでは、一般的な光合成細胞であるシアノバクテリアを用いて実演します。まず、ESR顕微鏡用サンプルホルダー内でシアノバクテリア細胞の試料を調製することで、これを達成します。

安定な有機ラジカル溶液に埋め込みます。サンプルホルダーをイメージングプローブ内に設置し、それをESR顕微鏡システムの静電磁石内に挿入します。これにより、ESR顕微鏡を用いて有機ラジカル溶液の3次元ESRマイクロイメージを数枚取得します。

これは、複数のパルスシーケンスのバリエーションで行われ、また、明暗条件などの様々な外部条件下で実施されることが多い。次に、コンピュータで生データ画像を処理し、ラジカルの3次元空間分解能を持つ緩和時間を抽出する。これらの緩和時間は、既存のキャリブレーションを通じて酸素濃度の直接的な指標となり、様々な外部条件下における測定サンプルの完全な3次元酸素マップが得られる。

光を照射しない場合、シアノバクテリアによる酸素生成が行われないことが明確に示されました。さらに、光照射下では、シアノバクテリア細胞の近傍に顕著な酸素勾配と酸素の不均一性が生じることが示されました。こんにちは、私はハイファにあるイスラエル工科大学（Technion）化学部のBLA研究室のalです。

本日は、ファイバーアーム顕微鏡を用いて、生細胞近傍の酸素濃度を高い空間分解能で三次元的にマッピングする手順をご紹介します。当研究室では、細胞の酸素消費速度や代謝活性を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

電子スピン共鳴（ESR）は、外部静磁場下に置かれた不対電子スピンを持つ常磁性種が、特定の周波数の電磁放射線を吸収する分光技術です。これは、酸素濃度や活性酸素種を含む、生体内の常磁性分子の環境を調べるための強力な手法です。ここでは、不均一なサンプルの例として、腫瘍担持マウスの典型的な酸素濃度画像を示します。

磁場勾配を用いることで、ESRスペクトル情報を空間的に分解して得ることができます。安定な遊離有機ラジカルをマウスに注入し、そのESR特性から周囲の酸素濃度を算出しました。ESRによる結果をMRI解剖画像に重ね合わせて表示しています。

これまで、生体試料に対するこのようなESRイメージング技術は、ミリメートルスケールの比較的大きなサンプルを用いてのみ実施されてきました。高分解能ESR顕微鏡法では、ミリメートルおよびサブミリメートルサイズのサンプルを測定することで、1 µmに迫る分解能を持つ3次元ESR画像を提供します。

以下は、NNC 60粉末およびシアニド化リチウム常磁性結晶を用いて作製したサンプルの、高分解能ミクロンスケールESR画像の2つの例です。ESR顕微鏡は従来のESR分光計に似ており、静磁場を発生させるための磁石、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびデータ収集プロセスとデータ処理を制御するためのコンピュータコンソールを備えています。システムのその他の構成要素には、電子システムの一部である磁場勾配ドライバと、イメージングプローブ内に配置された勾配コイルが含まれます。

グラジエントコイルには、試料への光照射を可能にする開口部があります。実験中の脱水を最小限に抑えるため、温度管理された湿潤空気が試料に供給されます。ESR顕微鏡の主な特徴は、プローブとグラジエントコイルの小型化、システムの高いスピン感度、および磁場勾配ドライバーの高強度であることです。本手順を開始する前に、濃度 40 mg/mL のシアノバクテリア懸濁液を調製してください。

ESRマイクロイメージングの試料調製を開始するには、精密ピンセットを用いて、約400 by 400 µmサイズの吸収紙を数枚取り出します。次に、それらをエプンドープに挿入します。続いて、チューブにシアノバクテリア懸濁液を1.2 mL加えます。

次に、マイクロ遠心分離機を用いて、懸濁液を6,000 RPMで2分間遠心分離します。遠心分離後、シアノバクテリアの脱水を避けるため、約50 µLだけを残して上清を完全に除去します。この操作により、吸着紙がシアノバクテリア細胞で飽和します。続いて、専用に調製したカップ状のガラス試料ホルダーを用意し、精密ピンセットを用いて紙から数本の繊維を抽出して、試料ホルダーの底に配置します。

続いて、記述されたプロトコルに従って調製した3 mMのtridelおよびBG 11溶液を、シリンジを用いて加えます。次に、ガラス製サンプルホルダーの縁と対応するカバーガラス片の間にUV硬化型接着剤を塗布してサンプルホルダーを密封し、小さな空気抜き穴だけを開けておきます。最後に、UVライトで2秒間接着剤を硬化させます。

イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムを起動し、イメージングプローブ内部の共振器に試料を挿入します。次に、コンピュータ制御ソフトウェアを使用してシステムをチューニングモードに設定し、ESR測定に使用するプローブの共鳴マイクロ波周波数を求めます。その後、印加したマイクロ波周波数に一致する値に静磁場を設定します。

パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定し、ESR信号を観察して、システムが正常に機能していることおよびサンプルが適切に調製されていることを確認します。次に、ピクセル数、グラジエント強度、グラジエントパルス幅などのイメージングパラメータを必要値に設定します。セットアップ後、パルス間隔tauを500、600、700 nanosecondsとして、Hahn Echo Imagingパルスシーケンスにより3枚の3D ESR画像を収集します。

この時点で、実験条件により取得期間を通じて必要な場合は、サンプルへの光照射を開始してください。データは自動的に保存されます。データ取得プロセス後、MATLABソフトウェアスクリプトを介して生データファイルを処理します。同ソフトウェアを使用して、トリルラジカル濃度と緩和時間の画像を生成します。

T₂ mapを作成し、酸素濃度と緩和時間を結びつける既存の検量線を用いて、これらの画像を酸素濃度画像に変換します。ここで T₂₀ は、プローブの濃度 C および拡散係数 D に依存する、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間です。シアノバクテリアを用いて実施した複数の三次元 ESR イメージング実験から得られた典型的な生データ画像を示します。これらの画像は、暗条件または明条件の下で、異なる tau 値を用いて取得されました。

暗条件下では、スピン緩和時間 T₂ による大きな T 値での強度低下を除けば、結果は非常に類似しています。逆に、光照射下では、サンプル全体で緩和時間が異なるため、画像パターンが変化します。その後、このデータを処理して、この画像から振幅画像を取得します。

シアノバクテリアが主にサンプルホルダーの右側に位置していることが分かります。2つの画像は、酸素濃度と緩和時間を結びつける既存の検量線を用いて、酸素濃度の値に変換されます。光がある場合とない場合におけるシアノバクテリアの結果を以下に示します。

光によって酸素生成が開始され、溶液中の酸素濃度が大幅に上昇することは明らかです。これにより、主にシアノバクテリアを含む吸収紙繊維付近のボクセルにおいて、ラジカルT2が減少します。以上で、EESR顕微鏡による酸素濃度のマッピングのために、安定自由ラジカルを含む生細胞サンプルを調製する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルの変動性を確保し、サンプルの劣化を防ぐために、時間をできるだけ短くすることが重要です。

以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。