グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

本手順の目的は、バイレイヤーを貫通するタンパク質によって検知される、薬剤誘発性のバイレイヤー特性の変化を測定することです。まず、フルオロ基を導入した大型の一方向性小胞（LUV）を作製します。次に、これらの小胞にグラミンを添加します。

手順の3番目のステップは、外部クエンチャーを添加し、内部フルオロフォアの消光速度を測定することです。4番目の最終ステップでは、蛍光の時間経過に伸張指数関数をフィッティングさせることで、グラミン活性あたりのフルオロフォア消光の変化量を定量します。最終的に、得られた結果から、amfiファイルが脂質二重層の特性を変化させ得るかどうかを評価できます。

こんにちは、Ola Andersonです。こんにちは、Helsonです。こんにちは、Richie Kapoです。

私は、ウェイルコーネル医科大学生理学・生物物理学部のOlaf Anderson博士の研究室に所属しているLeah Sanfordです。本日は、脂質二重層の特性変化を測定する手順をご紹介します。当研究室では、薬剤や低分子化合物が脂質二重層の特性に及ぼす影響を調べるためにこの手法を用いています。

それでは開始しましょう。この手順の1日目に、脂質をフリーザーから取り出し、室温まで平衡化させます。平衡化後、25 mg/mLの脂質・クロロホルム溶液0.6 mLを25 mL丸底フラスコに入れます。次に、クロロホルムが完全に蒸発するまで、フラスコを連続的に回転させながら窒素ガス下で溶液を乾燥させます。

脂質の薄い白い膜がフラスコの下半分全体を覆っています。この脂質をデシケーター内で真空状態で一晩さらに乾燥させます。100 mM硝酸ナトリウム、25 mM ANTS、およびpH 7の10 mM HEPES溶液を調製します。この溶液のpHを調整する際は、塩素を含む溶液の使用を避けてください。

2日目にタリウムクエンチャーが塩化物と不溶性複合体を形成するため、1.67 mLの電解質溶液で脂質を再水和させ、10 mMの脂質懸濁液を作成します。正しい濃度に達したら、パラフィルムで蓋をして懸濁液を十分にボルテックスし、サンプルをアルミホイルで遮光して室温で一晩熟成させます。

3日目に、低出力のソニケーターで混合物を1分間超音波処理します。次に、ドライアイスで5分間凍結させ、続いて温水に5分間浸すことで試料を凍結融解し、この凍結融解サイクルを4〜5回繰り返します。Avanti mini extruderを用いて、脂質懸濁液を押し出し（エクストルード）します。

0.1 µmのポリカーボネートフィルターとフィルターサポートを用いてミニエクストルーダーをセットアップし、サスペンションを21回往復して押し出し、ほぼ半透明のサスペンションを反対側のシリンジに回収することで、大単層小胞（LUV）サスペンションを作成します。ナトリウムバッファーで平衡化したPD-10脱塩カラムに、押し出し後のサスペンションを流して外部の未結合物質を除去します。LUVサスペンション1.5 mLとナトリウムバッファー1 mLをカラムに加えます。

溶液がカラムに完全に浸透した後、3 mLのナトリウム緩衝液でリポソームを溶出し、溶出液を回収します。得られたA NTS充填LUVストック溶液は、脂質濃度が約4～5 mMであり、半透明の乳白色を呈しているはずです。

溶液をアルミホイルで遮光し、13 °Cで保存します。使用する24時間前に十分にボルテックスしてください。A NTS充填LUVストック溶液は、UUVの密度が1 g/mLより大きいため、沈殿が生じます。

次に、A NTSを封入したLUVストック溶液を、ナトリウム緩衝液で1:20に希釈します。リポソームの4分の3量を、DMSOに溶解した260 ngのアビジンとともにインキュベートします。残りの4分の1量には、グラミンを含まない同量のDMSOを添加します。

すべてのサンプルで溶媒濃度を一定に保つため、グラミンを13 °Cで24時間静置し、脂質ベシクルの内層および外層単分子層間で平衡化させます。ここでは、温度制御機能を備えたApplied Photophysics SX point 20ストップフロー分光蛍光光度計を用いて、蛍光消光速度を測定します。まず、器具のウォームアップを行うため、測定の1時間前に電源を入れておきます。

励起用のスリット幅を1/1に設定し、ProData SXソフトウェアを用いて放射を記録する際は、455 nmのハイパスフィルターを使用してください。まず記録条件を設定し、モノクロメーターの励起波長を352 nmに設定します。プレッシャーホールド設定（pressure hold setting）を使用してください。

時間を1秒に、ポイントを5,000に設定します。繰り返し回数を、バッファーランでは9回に、クエンチャーランでは13回に調整します。Essexソフトウェアのチェックドライブプロファイルで温度をモニターします。

ドライブボリュームは120 µLに設定し、各シリンジから60 µLずつ混合されるようにします。これにより、デッドタイムは約1.2 msになります。蛍光検出器の高電圧またはゲインを約420 Vに調整します。

目標は、約8の蛍光読み取り値を得ることです。あらかじめ調製したA NTS負荷UUVを、暗所にて25 °Cで10分間平衡化させます。平衡化後、サンプルをボルテックスし、左側のシリンジにロードします。右側のシリンジには、ナトリウム緩衝液または thallium.Quencher のいずれかをロードします。

シリンジを前後に動かし、気泡を完全に取り除きます。両方のシリンジに同量ずつ充填してください。最初のサンプルを導入してバルブを閉じる前に、ナトリウム緩衝液を用いて蛍光を記録します。

これを4回繰り返し、必要に応じてゲインを調整します。次に、残りのサンプルについてさらに5回繰り返します。ナトリウム緩衝液を用いて9回の繰り返し測定を記録してください。

ナトリウムバッファーをタリウムクエンチャーに置き換え、13回の繰り返し測定を行います。水で洗浄し、次のサンプルコントロールの測定を続けます。グラミンを含まず溶媒のみのサンプルと、グラミンを含まず最大化合物濃度のサンプルも含めてください。

蛍光アッセイ後、グラミンと溶媒の両方について、データを分析用MATLABソフトウェアに読み込みます。各サンプルのすべてのバッファーおよびクエンチャーの繰り返し測定値を読み込みますが、最初の4回の繰り返し測定値は、チューブ内に残っていた前回の成分によって汚染されます。この場合、信号はナトリウムバッファーサンプルが前回の洗浄で使用した水と混合することによって生じます。

5回目から9回目までの繰り返しは、サンプルのみからの信号を表しています。したがって、いずれの場合においても、最初の4回までの繰り返しは常に除外します。ミキシングによるアーティファクトを避けるため、トレースを手動で確認し、ミキシングアーティファクトや気泡によるスパイクや偏差を含む赤色のトレースなどの不適切な繰り返しを除去してください。

次に、各実験条件のサンプルごとに、クエンチャー反復値をバッファー反復値の平均開始値で標準化し、すべてのサンプルの平均を1つのグラフにまとめます。グラミンを含まない可視化サンプルはすべて同様の結果となり、蛍光クエンチングはほとんど起こらないはずです。グラミジンを含むサンプルでは、タリウムイオンがゆっくりと小胞内に流入するため、蛍光信号が緩やかに減少します。化合物によって蛍光の時間経過が明らかに変化している場合、その化合物はテストした濃度で脂質二重層の特性を変化させていることになります。次に、標準化した蛍光クエンチング曲線の最初の2～100 msに対して、伸張指数関数をフィッティングさせます。

個々の繰り返し測定を行い、2ミリ秒時点での速度を算出します。次に、個々の繰り返し測定の結果から、特定のサンプルの平均値と標準偏差を算出します。ここでは、gramin（gaと表記）の不在下または存在下における、カプサイシン（capと表記）が蛍光消光のタイムコースに及ぼす影響を観察しました。正規化した蛍光信号を1秒間で示しています。グレーの点はすべての繰り返し測定の結果を表し、赤線は平均値を示しています。

正規化された蛍光信号の最初の100ミリ秒を示しています。灰色の点は、各条件における1回の繰り返し測定の結果です。赤線は、これらの繰り返し測定に対する伸張指数関数近似（stretched exponential fit）を示しています。

点線の青線は2ミリ秒の時点を示しています。これは消光速度を決定する時間です。消光速度の相対的な変化は、修飾剤を加えずgraminのみを用いたコントロールサンプルでデータを正規化することで決定されます。

カプサイシンが脂質二重層に吸着すると、二重層の特性が変化します。二重層がより柔軟な状態へと変化することは、モノマーとダイマーの平衡において、導電性ダイマー側に有利なグラム側へのシフトとして反映されます。以上で、低分子による二重層への摂動効果を測定する手順について説明しました。

この手順を行う際は、同一バッチのベシクルを用いて、各実験に適切なコントロールを設定することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。