グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

この手順の全体的な目標は、二重層にまたがるタンパク質によって感知される二重層特性の薬物誘発性変化を測定することです。これは、最初にFluorを装填した大きな片側スレを作ることによって達成されます。手順の2番目のステップは、グラミンで小胞をドープすることです。

手順の3番目のステップは、外部クエンチャーを追加し、内部フルオロの焼入れ速度を測定することです。4。手順の最後のステップは、伸張指数関数を蛍光時間経過に適合させることにより、グラミン活性あたりの蛍光消光の変化を定量化することです。最終的には、amfiファイルが脂質二重層の特性を変更できるかどうかを評価するための結果を得ることができます。

こんにちは、オラ・アンダーソンです。こんにちは、ヘルソンです。こんにちは、リッチー・カポです。

私は、ワイル・コーネル医科大学の生理学・生物物理学部のオラフ・アンダーソン博士の研究室のリア・サンフォードです。今日は、脂質バイオ層の特性の変化を測定する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、脂質ビラール特性に対する薬物や低分子の影響を研究しています。

それでは始めましょう この手順の初日に、脂質を冷凍庫から取り出し、室温まで平衡化させます。平衡化したら、25ミリリットル/ミリリットル、脂質、クロロホルム溶液を0.6ミリリットル/ミリリットルの丸底フラスコに加えます。次に、すべてのクロロホルムが蒸発するまでフラスコを連続的に回転させながら、窒素ガス下で溶液を乾燥させます。

そして、脂質の薄い白いフィルムがフラスコの下半分全体をコーティングし、脂質をさらに真空下で一晩乾燥させます。100ミリモルの硝酸ナトリウム25ミリモル、A NTSおよびpH 7の10ミリモルHEPの溶液を準備します。この溶液のpHを調整するときは、塩化物を含む溶液を避けてください。

タリウムクエンチャーは2日目に塩化物と不溶性錯体を形成するため、脂質を1.67で再水和します。この電解質溶液の1ミリリットルで、10ミリモルの脂質懸濁液が得られます。正しい濃度に達したら、パラフィルムで覆い、懸濁液をボルテックスしてサンプルをホイルで光から完全に保護し、室温で一晩熟成させます。

3日目に、混合物を低電力超音波処理で1分間超音波処理します。その後、ドライアイスで5分間サンプルを凍結解凍し、続いて温水で5分間凍結解凍し、凍結解凍サイクルを4〜5回繰り返します。Avanti mini extruderを使用して脂質懸濁液を押し出します。

0.1ミクロンのポリカーボネートフィルターとフィルターサポートを使用してミニエクストルーダーをセットアップし、ほぼ半透明の懸濁液が反対側のシリンジにたどり着くように懸濁液を前後に21回押し出し、大きな円小胞またはLUV懸濁液を生成します。ナトリウム緩衝液で平衡化したPD 10デュリングカラム上に押し出し懸濁液を走らせて、外部A NTSを除去します。1.5ミリリットルのLUVサスペンションと1ミリリットルのナトリウムバッファーをカラムに加えます。

溶液がカラムに完全に統合された後、3ミリリットルのナトリウム緩衝液でリポソームを溶出し、溶出液を収集します。得られたA NTS充填LUVストック溶液は、約4〜5ミリモルの脂質を含み、半透明に見えるはずです。乳白色。

溶液をホイルで光から保護し、使用の24時間前に摂氏13度で保管してください。A NTS充填LUVストック溶液。UUVは、ミリリットルおよび/または堆積物あたり1グラムを超える密度を持っているため。

次に、A NTSを充填したLUVストック溶液を希釈します。ナトリウム緩衝液を含む1〜20は、DMSO中の260ナノグラムのアビジンとリポソームの4分の3をインキュベートします。残りの4分の1に同量のグラミンなしのDMSOを追加します。

すべてのサンプルで溶媒濃度を一定に保つには、グラミンを脂質小胞の内側と外側の単層間で摂氏13度で24時間平衡化させます。ここでは、温度制御を備えた応用光物理学SXポイント20停止フロー分光蛍光計を使用して、蛍光消光速度を測定します。開始するには、機器のウォームアップを可能にするために、機器の1時間前に機器の電源を入れます。

励起のための報告者が付いているスリットは1つのスラッシュ1であるべきであり、4 55ナノメートルのハイパスフィルターはproデータSXソフトウェアを使用して放出を記録するために使用するべきである。最初に記録条件を設定し、モノクロメーターの励起波長を3 52ナノメートルに設定します。圧力保持設定を使用してください。

時間を 1 秒に設定し、ポイントを 5, 000 に設定します。繰り返し回数を、バッファー実行の場合は 9 回、クエンチャー実行の場合は 13 回に調整します。Essexソフトウェアチェックドライブプロファイルで温度を監視します。

駆動容量は120マイクロリットルに設定する必要があり、これにより各シリンジから60マイクロリットルが混合されます。これにより、デッドタイムは約 1.2 ミリ秒になります。蛍光検出器の高電圧またはゲインを約420ボルトに調整します。

目標は、暗所で摂氏25度で10分間、事前に準備したA NTS負荷UUVを平衡化して約8の蛍光読み取り値を取得することです。平衡化したら、サンプルをボルテックスし、左のシリンジにロードします。右シリンジの負荷で、ナトリウムバッファーまたはタリウムのいずれか。クエンチャー。

シリンジを前後に押して気泡を取り除きます。両方のシリンジは等しく装填する必要があります。最初のサンプルのバルブを閉じる前に、ナトリウムバッファーで蛍光を記録します。

4回繰り返し、必要に応じてゲインを調整します。次に、残りのサンプルに対してさらに5回繰り返します。ナトリウムバッファーで9回の繰り返しを記録します。

ナトリウムバッファーをタリウムクエンチャーに交換し、13回のリピートを記録します。水ですすぎ、次のサンプルコントロールに進みます。グラミンを含まないサンプルと溶媒を含むサンプル、グラミンを含まないサンプル、および最大化合物濃度のサンプルを含めます。

また、蛍光アッセイに続いてグラミンと溶媒の両方を使用して、データをMATLABソフトウェアに読み込んで分析します。すべてのバッファーおよびクエンチャーリピートで読み取られたサンプルごとに、最初の 4 回のリピートは、以前にチューブ内にあったものによって汚染されます。この場合、シグナルは、前回の洗浄で得られた水と混合したナトリウム緩衝液サンプルから得られます。

リピート5〜9は、サンプルのみからの信号を表します。したがって、各ケースで最初の 4 回の繰り返しを常に除外します。ミキシングアーティファクトを回避するには、手動でトレースを調べて、スパイクやミキシングアーティファクトや気泡による偏差を含む赤いトレースなど、不良なリピートを削除します。

次に、クエンチャーリピートを各実験条件の各サンプルのバッファーリピートの平均開始値に正規化し、すべてのサンプルの平均をグラミンを含まない可視化サンプルの1つのグラフに結合すると、すべてが類似し、蛍光クエンチングがほとんどないはずです。グラムシジンを含むサンプルの小胞へのタリウムイオンがゆっくりとするため、蛍光シグナルがゆっくりと減少します。蛍光の時間経過が化合物によって目に見えて変化した場合、化合物は、次にテストされた濃度で脂質二重層特性を変化させ、正規化された蛍光消光曲線の最初の2〜100ミリ秒に引き伸ばされた指数

個々の繰り返しについて、2ミリ秒でレートを計算します。次に、個々のリピートから所与のサンプルのための所与のサンプルのための平均および標準偏差を計算する キャップとしてここに示されるカプサイシンの効果は、gaとして示されるグラミンの不在下または存在下で蛍光消光の時間経過で観察された、正規化された蛍光シグナルは、ここで1秒にわたって示される。灰色の点はすべての繰り返しの結果を表し、赤い線は平均です。

正規化された蛍光シグナルの最初の100ミリ秒が示されています。灰色のドットは、各条件の 1 回の繰り返しの結果です。赤い線は、これらの繰り返しに指数関数的に引き伸ばされたフィットです。

息苦しい青い線は、2ミリ秒のマークを示します。焼入れ速度が決定される時間。クエンチレートの相対的な変化は、グラミンとモディファイアなしを使用してデータをコントロールサンプルに正規化することによって決定されます。

カプサイシンが脂質二重層に吸収されると、二重層の特性が変化します。より柔らかい二重層への変化は、モノダイマー平衡のグラム側のシフトとして反映され、導電性ダイマーが有利になります。小分子の二重層摂動効果を測定する手順を示しました。

この手順を実行するときは、同じ小胞のバッチを使用する各実験に適切なコントロールを使用することを忘れないでください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。