Name: グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶグラミシジンベースの蛍光アッセイを用いて、脂質二重層のプロパティ変化を測定する方法。薬剤誘導性の膜ダイナミクス変化を迅速に評価し、膜タンパク質の機能解析に応用可能です。

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我々は、多くの刺激的な議論のためにマイケルJ.ブルーノ、ラッダRusinovaとジョンT.サックに感謝。 NIH、R01GM021342とARRAサプリメントR01GM021342 - 35S1、及びOSAのジョサイアメイシー、ジュニア財団からの財政支援、トライ- I HII用CMBプログラム、およびアイリスL.とレヴェレットS.ウッドワース医学者フェローシップとNIH MSTP助成金RK用GM07739。

1。 ANTS充填リポソームを生成する<ol><li> 1日目に、脂質から有機溶媒を除去。 </li><li>冷凍庫から脂質を取り外して、常温に平衡させる。 </li><li> 25mLの丸底フラスコにクロロホルム溶液25 mg / mLの（1,2 - dierucoyl - sn -グリセロ-3 - ホスホコリン）脂質0.6 mLを加え。 </li><li>すべてのクロロホルムが蒸発し、脂質コートフラスコの全体の下半分の薄い白色フィルム完了するまで、窒素下で乾燥しながら継続的にフラスコを回転させる。 </li><li>一晩真空下でデシケーター中で乾燥させます。 </li></ol><ol><li> 2日目、小胞に取り込まれる蛍光体でサンプルを準備。 </li><li> 100mMのNaNO 3を 、25mMのANTS（Na塩）、10mMのHEPESで再水和。 pHを7.0に調整してHNO 3またはNaOHを使用してください。各ANTSの分子が2のNa +を持って 、150mMの合計[Na +の ]。 10mMの脂質懸濁液を得るために電解液の1.671 mLを加え。 </li><li>徹底的にパラフィルムと渦サスペンション。 </li><li>箔で光から試料を保護し、室温で一晩、それは年齢ができます。 </li></ol><ol><li> 3日目に、大きな単ラメラ小胞を作り、小胞の外からすべての蛍光体を削除します。 </li><li>低消費電力の超音波処理器で1分間超音波洗浄します。 </li><li>凍結融解サンプルドライアイス上で5分、暖かい所で約5分で5〜6回、各時間（〜50 ° C）水。 </li><li>アバンティミニ押出機を用いて脂質懸濁液を押し出します。 0.1μmのポリカーボネートフィルターとフィルターをサポート（詳細については、押出機のマニュアルを参照してください）​​とミニ押出機を設定します。前後にサスペンションが反対側のシリンジに終わりますように、21回のサスペンションを押し出す。複数のバッチが押し出されるときは、常に同じシリンジでサンプルをロードすることを忘れないでください。押出中に曇った最初の脂質懸濁液は、（それはまだANTSの蛍光団のために黄色になる）とほぼ透明になるはず。押し出しが突然容易になり、少ない圧力がフィルタを通過移動するために必要な場合は、フィルターが破裂している可能性があり、交換する必要があります。 </li><li>重力のプロトコルを使用してPD - 10脱塩カラムに押し出されたサスペンションを実行することにより、外部ANTSを削除します。ナトリウム緩衝液の20〜30 mLでカラムを平衡化（140mMのNaNO 3を 、10mMのHEPES、pH 7.0のpHを調整するHNO 3または水酸化ナトリウムを使用することを忘れないでください）。列に押し出し脂質懸濁液1.5 mLを加え、それが入って1 mLのナトリウム緩衝液を添加することにより2.5mLのためにサンプルの合計量を持参浸透しましょう​​。バッファが完全にカラムと何も組み込まれている後は、漏れ出しナトリウム緩衝液3mLでリポソームを溶出し、得られたサンプルを収集しています。満たされた結果として得られるANTSは、ストック溶液は4〜5 mMの脂質に関する含むと半透明の乳白色を表示するLUVは。アルミホイルで光からサンプルを保護する。 </li><li>ストック溶液は13で、すぐにストアを使用されていない場合で7日間の最大のためのC。警告：フリーズまたはその結晶相転移温度（〜12 ° C）、これは小胞の整合性を破壊すると蛍光物質が漏れないので液体の下に脂質溶液を冷却していない。 </li></ol> 2。蛍光溶液を混合<ol><li> 24時間前、使用リポソームを希釈し（13℃時）グラミシジンでインキュベートする。脂質小胞"内側と外側の単分子膜との間のグラミシジンの平衡は、長いインキュベーションを必要とする、時間のかかるプロセスです。 </li><li>アリが充填徹底的に渦LUVsは密度&gt; 1 g / mlのとソリューションにしたがって堆積物意志を持っているストック溶液をLUVは。 </li><li>ミックスANTS充填ナトリウム緩衝液中で株式の1:20にマブラヴ。サンプルの均一性を高めるために、単一のフラスコ中で一緒に実験の一日に使用するためのすべてのリポソームを混ぜる。 </li><li>リポソームの3 / 4を分離し、260nmのグラミシジンDMSOにあらかじめ希釈して（500μg/ mL）を加える。 </li><li>残りの1 / 4に全てのサンプル中の溶媒濃度を一定に保つためにDMSOの同じ体積を（グラミシジンせずに）追加。 </li></ol> 3。蛍光インストゥルメントの設定<ol><li>我々は、蛍光消光の速度を測定する温度制御と応用光物性SX.20ストップトフロー分光を使用してください。 </li><li>ウォームアップを可能にするために前もって時間の時間で楽器をオンにします。コンポーネントは次のとおりです。コンピュータ、電子制御ユニット、水浴（クーラーとヒーターの両方）、ランプの電力供給と窒素のタンク。 </li><li>プロのデータSXのソフトウェアを使用して記録条件を設定します。 </li><li> 1 / 1〜励起用352 nmおよびスリット幅の開口部にモノクロの励起波長を設定します。 </li><li>排出量を記録するためにλ= 455 nmのハイパスフィルタを使用してください。 </li><li>録音時の窒素圧力を維持するために楽器を可能にするため、最初の数ミリ秒の間に圧力の振動（および録音のアーティファクト）を防止する"圧力ホールド"の設定を、使用してください。 </li><li> "Tiを設定する私は5000〜ポイント""1秒とする"。 </li><li>リピートボックスを使用するとリピートの数を調整するには、通常、我々はそれぞれ、バッファおよびクエンチャーの実行のために9および13のリピートを使用してください。 </li><li>水槽温度を25に設定する必要があります° C、温度は、SXソフトウェアで監視する必要があります。 </li><li>たびに楽器が、サンプルを実行するには2つのシリンジの各々から60μLを混合することを意味し、120μLのドライブボリュームを設定します。この楽器のセットアップでは、120μLボリュームは≈1.2ミリ秒のデッドタイムを与える。 </li><li> 8の周囲にANTS -リポソームの出力のための蛍光検出器に高電圧（ゲイン）を調整します。標準的な実験的な混合のために利得が400から420にする必要がありますV.一部の薬は、蛍光は、蛍光信号を飽和させることができるようになっている。これらのケースでは、ゲイン/電圧を減少させるべきである。 </li><li>常に右シリンジで左の注射器とバッファ/消光剤に蛍光サンプルをロードする。ロードする前に、リポソームを含む徹底的にボルテックスすべてのサンプルにすることを確認し、時間とLUVsは注射器で解決されることに注意してください。 </li></ol> 4。実験を行っ<ol><li>ナトリウム緩衝液またはTL -クエンチャー（50mMのTlNO 3、94 mMのNaNO 3を 、pH7.0で10mMのHEPES）のいずれかと一緒にANTS -ロードされた溶媒や化合物のいずれかとLUVs、と分光へのロードのサンプルを準備します。 </li><li>前日準備グラミシジンの有無にかかわらず、1.5 mLの希釈ANTS - Luvのソリューションを、使用してください。 </li><li>所望の濃度の化合物またはコントロールの溶剤を追加。すべてのサンプル間の最小値と定数に溶剤濃度を維持する。濃度は、所望の投与量 - 応答の範囲を達成するために、新しい（未知の）化合物とを調整する必要があります。 25℃で10分間インキュベート° Cの暗所で。 </li><li>渦は、左のシリンジにサンプルと負荷をLUVは。右のシリンジにナトリウムバッファーまたはTL -クエンチャーをロードします。 </li><li>徹底的に前後にシリンジを押すことによって、両方のサンプルから気泡を取り除く。 </li><li>両方の注射器がバルブを閉じる前に均等に負荷されていることを確認します。彼らはレコーディング室に到達する前に不平等な負荷がソリューションのプリミキシングになります。 </li><li>非常に最初のサンプルの場合は、必要に応じて高電圧（ゲイン）を調整し、4回繰り返し、5回を繰り返し、ナトリウム緩衝液と蛍光を記録。 </li><li>残りのサンプルは、Na -バッファとレコード9繰り返すため。 </li><li>タリウムクエンチャーとレコード13を繰り返すとナトリウム緩衝液を交換してください。 </li><li>水ですすぎ、次のサンプルを続行します。溶剤持つグラミシジンと、最大化合物濃度と無グラミシジンとを、グラミシジンと溶剤の両方で：私たちがサンプルを使用しない制御として。 </li></ol> 5。データの分析<ol><li>分析のコンピュータに結果を転送する。分析するためのMATLABへのすべてのデータを読み込みます。各サンプルについて、それらが混合アーティファクトを含んでいるので、それぞれの場合の最初の4つを除く、すべてのバッファおよびクエンチャーの繰り返しで読み込む。 120μLのドライブボリュームを想定し、それは完全にストップトフローチューブから前の混合物をクリアするために4つのショット弱かかります。 </li><li>すべてのサンプルのバッファの繰り返しは非常に似ている必要があります。化合物の濃度に依存して蛍光シグナル、大きな変化が存在する場合、化合物自体は蛍光可能性があります、それは最初のサンプルを正規化する前に、この余分な蛍光信号を減算する必要があるかもしれません。 </li><li>手動でトレースを通過すると、"悪い"繰り返し削除する：ミキシングアーティファクトおよび/または気泡によるマルチexponentialityからスパイクや逸脱を含む繰り返しを。 </li><li>各サンプルのバッファーを繰り返すの平均開始値にクエンチャーが繰り返されを正規化する。可視化のための一つのグラフにすべてのサンプルの平均値を組み合わせる。 </li><li>ないグラミシジンで記録されたトレースはどれも似たり寄ったりだとほとんど蛍光消光を示すようにすべきですが、Tlの漏れを遅くする+小胞二重層〜8による蛍光シグナルの遅い低下する可能性があります。無グラミシジンと無修飾されたサンプルは、重要な消光を示している場合は、小胞は悪化しており、さらには使用しないでください。ないグラミシジンはあるが修飾子を持つ試料が大きな消光を示す場合は、修飾子は、それが蛍光団または消光剤が二重層を通過することができるような程度に小胞の脂質二重層を乱す。 </li><li>グラミシジンのチャンネルで検出されたとして、化合物は、脂質二重層のプロパティを変更した場合、蛍光の時間経過が明白に変更されます。 </li><li>各サンプルについて、指数関数的に引き伸ばさ<img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）">例えば、4）は、個々の繰り返しの正規化蛍光消光カーブの最初の200から100ミリ秒と速度に適合さ<img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 42ミリ秒で計算。平均値と標準偏差はすべての個々の繰り返しから、与えられたサンプルに対して計算されます。 </li><li>最後に、グラミシジンと無修飾されている時間に最も近いコントロールサンプルに正規化することによって急冷速度の相対的な変化を決定する。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：蛍光クエンチベースのアッセイの必需品は、脂質二重層の特性の変化を検出するために左上：。ズームの内側と外側のNaNO 3を加えてTlNO 3のアリプラスNaNO 3を持つ単一の脂質小胞で。右上：クエンチャー、87、260と780nmのグラミシジンとプリドープで、消光剤と、クエンチャーなし（上から下フォーム）ANTS充填小胞を用いて記録された蛍光シグナル。ボトム：ストップトフロー混合室の模式図。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：実験装置の説明で参照されているさまざまなパネルを示すプロデータSXのソフトウェアからのスクリーンショット。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：彼らはミキシングアーティファクトを含むとしてのNa -バッファ付きANTS負荷LUVsからの蛍光信号の複数の繰り返し測定は、最初の4つの繰り返しは常に、除外されます。混合セルにサンプルの注射器を接続する配管には、定義されたボリュームを持っている、したがって、最初のいくつかの繰り返しは、私たちのチューブに以前にあったものの読書を与える：水を繰り返し1と2、繰り返し3の水とサンプルのいくつかの組合せに対してリピート4、残りの繰り返しのためだけのサンプルのほとんどがサンプル。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：。ANTS負荷のNa -バッファ付きおよびTl -クエンチャーとLUVsからの蛍光信号の複数の繰り返しの決定は、最初の4つの繰り返しは、両方の条件から削除されています。さらに、TL -消光測定のため、アーティファクト、ほとんど気泡により、削除する8ニーズを繰り返します。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：ANTS蛍光消光の時間経過に対するカプサイシンの効果（キャップ）1秒以上（）正規化された蛍光シグナルは、灰色のドットは、すべてのリピート（N&gt; 5あたり状態）からの結果を表し、赤い線はすべての平均を表す繰り返す。 （B）最初の100 msのは、灰色のドットは、条件ごとに単一の繰り返しからの結果を表し、赤い線は指数関数フィット（2 - 100ミリ秒）に引き伸ばされて、それらの繰り返しにして。点描青い線が2ミリ秒のマーク、消光の速度が決定された時刻を示します。 AとBの両方でトップのトレースは、TLがない場合の結果を示しています+;次の2つのトレースは+ ±キャップTlのと、GAの不在の結果を示し、下位4トレースがどこに、260nmのGaとTlの+との結果を表示数字は、μMの[キャップ]を表します。として伸張指数関数の速度によって決定される0、10、30、90μMのキャップ、、のための消光の速度は36です± 6、69 ± 6、85 ± 8と247 ± 27（± SD、n個&gt; 8を意味する） 、それぞれ。

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</ol>

原稿に記載されているメソッドをカバーする仮特許出願が提出されています。共同発明者は、HIIとOSAです。

私たちは、麻薬や他の小さな両親媒性物質の二重層変更の可能性を決定するための高速な蛍光ベースのアッセイを実証している。二重層のプロパティを変更する化合物は、おそらく&quot;オフターゲット&quot;薬の効果に​​貢献し、間接的、非特異的に膜タンパク質の機能を変更する可能性があります。アッセイは、二重層貫通タンパク質によって感知される二層プロパティの変更12のプローブとしてグラミシジンのチャンネルのパワーを活用する。蛍光ベースのアッセイを用いて得られた結果は、このメソッドは同様にスクリーニング化合物ライブラリー用として、機械論的研究のために使用することができることを示す、シングルチャネルのGA実験12からの結果とよく一致している。我々はシングルチャネルのアプローチを使用して可能なより高いスループットの大きさの1対二桁である化合物の数十日を、テストすることができるアッセイの現在の設定を使用する。そこに蛍光ベースのアッセイにおける基本的な律速ステップははありませんが、それが真のハイスループットモードで実行するように拡張することができることを意味する。アッセイの電解質溶液を変えると/またはLUVs&...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>グラミシジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruderキット</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

多くの薬と生物学的機能を調節するために使用される他の小さな分子は両親媒性脂質二重層/溶液界面のその吸着であり、それによって脂質二重層のプロパティを変更する。膜タンパク質がエネルギー的に疎水性相互作用によって、そのホストの二重層に結合されているため、これは重要です。二重層の特性の変化は、このように両親媒性物質は、タンパク質の機能と&quot;オフターゲット&quot;薬の効果の可能なメカニズムを変調するための間接的な方法を提供する、膜タンパク質の機能を変化させる。我々は以前のプローブ3,12のような線形グラミシジンのチャンネルを使用して、脂質二重層の特性の変化を検出するための電気生理学的ア ​​ッセイを開発した。グラミシジンのチャンネルは2つの非導電性サブユニットのtransbilayer二量体化によって形成されるミニ蛋​​白質である。彼らはそれらのタンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための強力なプローブになる彼らの膜環境の変化に敏感です。我々は現在、プローブと同じチャンネルを使用して二重層の特性の変化を検出するための蛍光アッセイを示す。アッセイは、グラミシジンのチャンネルを通じて、クエンチャーのエントリに起因する蛍光体にロードされた大きな単ラメラ小胞からの蛍光消光の時間経過を測定することに基づいています。我々は、蛍光指示薬/消光剤ペア8 -アミノナフタレン-1,3,6 - trisulfonate（ANTS）/ TL +を正常他の蛍光消光アッセイ5,13で使用されている使用してください。 TL +はゆっくり8脂質二重層に浸透がグラミシジンのチャンネル1,14を実施を通じて容易に通過する。このメソッドは、両方の効果機序の研究と二重層-摂動のための小分子のハイスループットスクリーニング、および潜在的な&quot;オフターゲット&quot;のための拡張性と最適です。我々は、このメソッドを使用して結果が以前の電気生理学的結果12とよく一致していることがわかります。

我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。

生物学的機能を調節するために用いられる多くの薬剤やその他の低分子化合物は、脂質二重層と溶液の界面に吸着して、それによって……を変化させる両親媒性物質である。

本手順の全体的な目的は、二重層貫通タンパク質によって感知される、薬物誘発性の二重層特性の変化を測定することです。これは、まず蛍光物質を封入した大型の単層小胞（LUV）を作製することによって達成されます。手順の第2段階は、これらの小胞にグラミンを添加することです。手順の3番目のステップは、外部クエンチャーを添加し、内部蛍光物質の消光速度を測定することです。4番目の最終ステップでは、蛍光の時間経過に伸張指数関数をフィッティングさせることで、gramin活性あたりの蛍光消光の変化量を定量します。最終的に、amfiファイルが脂質二重層の特性を変化させ得るかどうかを評価するための結果が得られます。こんにちは、オラ・アンダーソンです。こんにちは、ヘルソンです。こんにちは、リッチー・カポです。私は、ウェイル・コーネル医科大学生理学・生物物理学部のOlaf Anderson博士の研究室に所属しているLeah Sanfordです。本日は、脂質二重層の特性の変化を測定する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、薬剤や低分子が脂質二重層の特性に及ぼす影響を研究しています。それでは始めましょう。本手順の1日目に、脂質をフリーザーから取り出し、室温に戻します。室温に達したら、25 mg/mLの脂質およびクロロホルム溶液0.6 mLを25 mL丸底フラスコに加えます。次に、クロロホルムがすべて蒸発するまで、フラスコを絶えず回転させながら窒素ガス下で溶液を乾燥させます。また、脂質の薄い白い膜がフラスコの下半分全体を覆っています。この脂質をデシケーター内で真空状態で一晩さらに乾燥させます。100 mM硝酸ナトリウム、25 mM ANTS、およびpH 7の10 mM HEPsを含む溶液を調製します。この溶液のpHを調整する際は、塩化物を含む溶液を一切使用しないでください。タリウムクエンチャー（Quencher）が2日目に塩化物と不溶性複合体を形成するため、1.67で脂質を再水和させます。この電解質溶液を1 mL加え、10 mMの脂質懸濁液にします。正しい濃度に達したら、パラフィルムで蓋をして懸濁液を十分にボルテックスし、サンプルをアルミホイルで遮光して、室温で一晩静置します。3日目に、低出力のソニケーターで混合物を1分間処理します。次に、ドライアイスで5分間凍結させ、続いて温水で5分間融解させることでサンプルの凍結融解を行い、このサイクルを4〜5回繰り返します。Avanti mini extruderを用いて、脂質懸濁液を押し出します。0.1 µmのポリカーボネートフィルターとフィルターサポートを用いてミニエクストルーダーをセットアップし、懸濁液を21回往復してエクストルージョンを行い、ほぼ半透明の懸濁液が反対側のシリンジに入るようにして、大単層小胞（LUV）懸濁液を作成します。ナトリウム緩衝液で平衡化したPD 10脱塩カラムに、エクストルージョン後の懸濁液を流し込み、外部のANTSを除去します。LUV懸濁液1.5 mLとナトリウム緩衝液1 mLをカラムに加えます。溶液がカラムに完全に浸透した後、3 mLのナトリウム緩衝液でリポソームを溶出し、溶出液を回収します。得られたA NTS充填LUVストック溶液は、脂質濃度が約4〜5 mMであり、乳白色の半透明に見えるはずです。溶液をホイルで遮光し、13 °Cで保存してください。使用する24時間前に、A NTS充填LUVストック溶液を十分にボルテックスしてください。UUVは密度が1 g/mLより大きいため、沈殿することがあります。次に、A NTSを充填したLUVストック溶液をナトリウム緩衝液で1:20に希釈します。リポソームの4分の3を、DMSOに溶解した260 nanogramのabidinとともにインキュベートします。残りの4分の1には、graminを含まない同量のDMSOを加えます。すべてのサンプルで溶媒濃度を一定に保つため、グラミンを13°Cで24時間放置し、脂質小胞の内層および外層の単分子層間で平衡化させます。ここでは、温度制御機能を備えたApplied Photophysics SX point 20ストップフロー分光蛍光光度計を用いて、蛍光消光速度を測定します。測定を開始する1時間前に装置の電源を入れ、ウォームアップを行ってください。励起用のスリット幅は1/1とし、pro data SXソフトウェアを用いてエミッションを記録する際は、455 nmのハイパスフィルターを使用してください。まず記録条件を設定し、モノクロメーターの励起波長を352 nmに設定します。プレッシャーホールド設定を使用してください。時間を1秒に、ポイント数を5,000に設定します。リピート回数は、バッファーランでは9回に、クエンチャーランでは13回に調整してください。Essexソフトウェアのチェックドライブプロファイルで温度を監視します。ドライブボリュームは120 µLに設定してください。これにより、各シリンジから60 µLずつ混合されます。このときのデッドタイムは約1.2 msとなります。蛍光検出器の高電圧またはゲインを約420 Vに調整してください。目的は、約8の蛍光強度を得ることです。事前に調製したNTS負荷UUVを、暗所で25°Cで10分間平衡化します。平衡化後、サンプルをボルテックスし、左側のシリンジに充填します。右側のシリンジには、ナトリウム緩衝液または thallium.Quencher のいずれかを充填します。シリンジを前後に動かして、気泡を完全に取り除きます。両方のシリンジに等量ずつ充填してください。最初のサンプルを導入してバルブを閉じる前に、ナトリウム緩衝液を用いて蛍光を記録します。これを4回繰り返し、必要に応じてゲインを調整します。その後、残りのサンプルに対してさらに5回繰り返します。ナトリウム緩衝液を用いて9回の繰り返し測定を記録してください。ナトリウム緩衝液をタリウムクエンチャーに交換し、13回の繰り返し測定を行う。水で洗浄し、次のサンプルコントロールの手順に進む。グラミンを含まない溶媒のみのサンプル、およびグラミンを含まず最大化合物濃度となるサンプルを含めること。続いて、グラミンと溶媒の両方で蛍光アッセイを行い、データをMATLABソフトウェアに取り込んで解析します。読み込んだ各サンプルのすべての緩衝液およびクエンチャーの繰り返し測定において、最初の4回の繰り返しは、チューブ内に以前に残っていた成分によって汚染されます。この場合、シグナルはナトリウム緩衝液サンプルが前回の洗浄による水と混ざり合うことで発生します。5回目から9回目の繰り返しは、サンプルのみからの信号を表します。したがって、いずれの場合も最初の4回の繰り返しは常に除外します。ミキシングによるアーティファクトを避けるため、トレースを手作業で確認し、ミキシングのアーティファクトや気泡に起因するスパイクや偏差を含む赤色のトレースなど、不良な繰り返しを除去してください。次に、各実験条件の各サンプルについて、クエンチャー（消光剤）の繰り返し測定値をバッファーの繰り返し測定値の平均開始値で正規化し、すべてのサンプルの平均値を1つのグラフにまとめます。グラミンを含まない可視化サンプルはすべて同様の結果となり、蛍光消光はほとんど見られないはずです。グラムシジンを含むサンプルでは、タリウムイオンが徐々に小胞内へ浸入するため、蛍光信号が緩やかに減少します。蛍光のタイムコースが化合物によって目に見えて変化している場合、その化合物はテストした濃度において脂質二重層の特性を変化させていることになります。次に、正規化した蛍光消光曲線の最初の2〜100ミリ秒に対して、伸張指数関数をフィッティングさせます。個々のリピートについて、2ミリ秒における速度を算出します。次に、個々のリピートから、特定のサンプルの平均値と標準偏差を算出します。ここでは、gramin（gaと表記）の不在下または存在下における、カプサイシン（capと表記）が蛍光消光のタイムコースに及ぼす影響を観察しました。正規化された蛍光信号を1秒間で示しています。灰色の点はすべてのリピートの結果を表し、赤線は平均値を示しています。規格化された蛍光信号の最初の100ミリ秒を示しています。灰色の点は、各条件における1回ずつの繰り返し測定の結果です。赤線は、それらの繰り返し測定に対する伸長指数関数近似（stretched exponential fit）です。点線の青い線は2ミリ秒の時点を示しています。これは消光速度を決定する時間です。消光速度の相対的な変化は、修飾剤を含まずグラミンのみを用いたコントロールサンプルでデータを正規化することによって決定します。カプサイシンが脂質二重層に吸収されると、二重層の特性が変化します。より柔軟な二重層への変化は、モノマー・ダイマー平衡において、伝導性ダイマーに有利な方向へのグラム側のシフトとして反映されます。以上で、低分子による二重層への摂動効果を測定する手順について説明しました。この手順を行う際は、同一バッチのベシクルを用いて、各実験に適切なコントロールを設定することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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