Name: 鶏胚における単一細胞のトランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ 鶏胚の体節や神経管への単一細胞マイクロインジェクション法。プラスミドDNAを用いてGFP発現するクローン細胞集団を作製し、発生生物学における遺伝子機能のin vivo解析を支援します。

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我々は、神経管の画像にShlomi Krispinに感謝。特に、我々はGFPのトランスフェクション技術を開始するためのYuvalシナモンを認めます。この作品は、イスラエル科学財団、協会フランセーズcontre LESミオパシー、およびDeutche Forschungsgemeinshaft、共同研究センター488からCKへの補助金によって支えられて

1。マイクロピペットの準備我々は13.5の熱が設定された標準ナリシゲPP - 83ピペットプラーで私たちのピペットを引く。正確な設定は8〜10ミクロンのピペットの先端径を目指して、校正する必要があります。私たちは、フィラメントを含有する1.0ミリメートルと0.75〜0.78ミリメートルの内径、外径とホウケイ酸ガラス管を使用してください。ピペットは、結果的に皿の縁との接触から保護されたヒントとプラスチック製の皿に格納されています。 2。 DNAの調製目的のプラスミドを大腸菌 DH5αにトランスフェクトさ標準的な手順を用いて大腸菌 。単一のコロニーから一晩培養し、プラスミドを使用してマキシプレップキットを（任意の市販のキットが何をすべき）を精製するために使用されます。我々は、非クローン性注射用は1.0μg/μLのプラスミド濃度を使用してください。高濃度では、ピペットチップの目詰まりを増加させる。クローンのアプリケーションでは、プラスミドの濃度ははるかに低いですし（下記参照）を調整する必要があります。 pCAGG - GFPの場合は、クローンの結果を生成する最適な濃度は約0.05から0.1μg/μLのであることが判明した。プラスミドの1〜2μLは、通常、実験ごとに使用され、実験が始まる前に高速緑色の粉末（乾燥、鋭いガラスピペットの先端に付着している）は必要最小限のプラスミドに追加されます。プラスミドは、最大速度で2分間、卓上遠心機で遠心分離される。この手順では、ピペット、目詰まりの問題を軽減するようです。 3。胚の注入胚3.1準備私たちは、注射用ウズラと同様に鶏の卵を使用してください。卵は、所望の発達段階まで、その長軸上に寝そべってインキュベートする。卵は70％エタノールでswabbedと乾燥させる。卵の先端は、外科用はさみ（これが唯一の鶏の卵に必要である）と1mLの（ウズラ）または10 mLシリンジ（19G針）で卵から描かれている卵白を2mL（ひよこ）で穴を開けている。セキュリティホールは、熱いパラフィンで密封されています。 実際の注入に先立ち、ウィンドウは、外科はさみを使って卵の殻の上部に開かれます。シェルを介して粘着テープを置いて、それを切断するには、シェルから破片を減らすことができます。抗生物質を含むPBS緩衝液を卵にすぐにピペットで入れる。胚にアクセスするには、卵黄及び/または羊膜は、ニードルホルダーにマウントさ0.14ミリメートル虫ピンを使ってカットして迂回されます。非毒性インク（ペリカン＃17）アスピレーターに搭載されたキャピラリープル火を使用して、胚を視覚化するために胚盤葉の下に注入されます。 3.2マイクロピペットのロードとマウント引き手のマイクロピペットをアスピレーターにマウントされている、適切な直径の火 - プ​​ル毛細血管によってプラスミドをロードすることができます。プラスミドは必要最小限のキャピラリーを使用して、その開口部の反対側から先鋭化先端にピペットにロードされ、そして可能な限り内側から先端に近づいて描画されます。ピペットは、結果的にインジェクターがマニピュレータに搭載された手動の空気の圧力の上にロードされます。最小限の圧力は、プラスミド溶液は、ピペットの先端に到達することを可能にするために、必要に応じて、適用されます。 3.3プラスミド注入ピペットチップの目詰まりを防ぐためにいくつかの空気の圧力をかけながらピペットを卵の液体培地中に操作されます。関連する組織のドメインを刺している。先端が組織に入ると圧力の変化が頻繁に目に見える速いグリーンでプラスミド放出するのに十分です。そうでない場合は、プラスミド/高速グリーンになるまで注射器にわずかな圧力を適用して排出されます。このプロセスは、隣接する体節の例のためにまたは神経管の範囲に沿って、胚の軸に沿って繰り返すことができます。注射後、PBSを添加してもよい。ウィンドウが（パラフィルムは、特にウズラのために望ましいものではない卵、これはシェルを介して酸素交換を遮断することによって、おそらく、胚の死亡率を増加させる）粘着テープを用いて封止されている。処理された胚をインキュベーターに戻されます。換気を避け、彼らが水分と増加収量を維持するためにインキュベーターの水で小さな容器を置きます。 4。注入パラメータを調整し、成功率を監視 Asessingと様々な注入パラメータのキャリブレーションは、シングルセル解析を目指したアプリケーションにとって重要です。いないすべての注入イベントは、単一セルの成功ラベリングにつながる。高い故障率の非常に低濃度の結果ながら、高すぎるとプラスミド濃度は、非クローン性ラベリングにつながることができます。注入されたプラスミドの濃度は、クローンの注射のために最適化されている必要があります。我々は、あらかじめ決められた濃度に個々のプレップを希釈するのではなく、全体の精製されたプラスミド株式の希薄化をお勧めします。後者のおそらく、そのようなスーパーコイルプラスミドの割合として純度の変動と他のパラメータの設定によって、成功率のいくつかの差異が導入される可能性があります。 全体のマウントの観察によって成功率の評価4.1 注入された胚の初期評価は、蛍光双眼でホールマウントの観察によって行うことができます。 6〜8時間後に注射はpCAGG強化されたGFPのコンストラクトで成功率を評価するために十分である。これは、標的部位（例えば背側体節、背側神経管、外胚葉などは、図1A - Cを参照してください。）容易に明らかになるのに十分な表面的な状態で提供される。このステップでは、あまりにも多くの標識細胞あるいは、任意の蛍光細胞が欠如しているのどちらかを示す実験的なシリーズを評価するために特に有用です。さらにインキュベーションを希望する場合は、抗生物質含有PBS溶液を表示した後に卵を追加する必要がありますし、シールテープを交換する必要があります。 シリアルセクション分析によってクローンの評価4.2 成功した注射の速度を評価するための最良の手段は、注入された胚を直列に切片と標識された細胞を可視化するために免疫組織化学を使用することです。これらの条件下では、インキュベーション時間は4時間後の注射可能な限り短くすることができます。胚を固定し、パラフィン切片（またはcryosectioning）のために処理されます。ガラスにマウントされたセクションは、脱パラフィン処理し、レポーターの可視化のための免疫染色です。このようなビオチン - ストレプトアビジンのような増幅方法は、望ましいかもしれません。最後に、連続切片を注入セグメントで標識された細胞を検出するためにスキャンされます。むしろ、単一細胞よりも複数の時に最初の試験が得られる場合、十分な結果が得られるまで、プラスミド株式を希釈し、プロセスが繰り返されている必要があります。プラスミドストック溶液の2〜10倍希釈では高すぎて成功率のケースで必要になる場合があります。 それぞれのプラスミドをトランスフェクトされるため、クローンを確実に徹底したキャリブレーションを繰り返す必要があります。 5。代表的な結果胚1 2あたり6〜12のセグメントをターゲットにしながら我々は一般的に、体節ごとpCAGG - GFPの単回注射を行う。この設定では、明確なシグナルは10のうち1胚の少なくとも1つのセグメントでは、全体のマウントの観察8時間のポスト噴射により検出することができます。これらの条件下で、標識は、さらに（図1B、C）クローンであることが確認された。高DNA濃度を使用する場合、ほとんどの胚は、複数のセルをトランスフェクトされたという可能性を高め、少なくとも一つの成功注入を示すことができる。 連続切片の解析では、成功率は約10％のときクローンのトランスフェクションが達成されたことを明らかにした。これは、クローンを達成するために、技術は、定義ごとに非常に非効率的であることを意味します。一方、これらの条件下で、正のラベリングイベントの93％以上は1クローンであることがわかった。 <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。神経や骨格前駆細胞にpCAGGS - GFPのクローン注射。背側神経管のラベル（NT）（A）、dermomyotome（DM）（B）の腹ドメイン、または中央のDMシート（C）を示す（AC）横断切片では、 、単一の前駆細胞にpCAGGS - GFPのマイクロインジェクション後6hr。 （D）真皮（D）だけでなく、筋肉（M）（refを参照してください。詳細については、1）両方の誘導体を生成された中央のDM、単一の前駆細胞のクローン性のトランスフェクション後二日。

<ol><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li>
<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium%2C+smooth%2C+and+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li>
<li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. </a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

上記の方法では、小細胞サブセットまたは単一の前駆細胞を3に親油性色素を提供するための前述した手法を変更したものです。それは標準的なエレクトロポレーション法に比べて3つの主な利点があります。最初に、それは（C、例えば図1Bを参照されたい）、エレクトロポレーションよりはるかに大きい空間分解能を可能にする、標的組織への信頼離散サイトで標識するための手段を提供します。第二に、それはこのようにそれ以外の場合は、通常の条件下で1 2（図1C、D）を、in vivoでその系譜をトレースできるように、単一細胞の標識が許可されます。第三に、単一細胞レベルで遺伝子ミス発現は、その成長因子のまたはそれ以外の場合は、通常バックグラウンドでの細胞挙動に関する他の遺伝子の役割を研究するための系統分離の分子機構、などを調査するためのツールを提供する、この方法では、補完広くエレクトロポレーション技術を適用し、さらに、in vivoでの遺伝子機能の空間時間的調節のゲインおよびロスに鳥類胚のアクセシビリティを利用している。 ますます、関連...

<table><tbody><tr><td>ピペットチューブ</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-100</td><td></td></tr><tr><td>昆虫用針</td><td>Watkins Doncaster</td><td>E6871</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

Single Cell Transfection in Chick Embryos

発生生物学の中心テーマは、系統の多様化と分子メカニズムの解明である。これは正常な実験条件下で単一細胞の運命の徹底的な分析を伴います。この目的のために、単一の前駆細胞を標的とトランスフェクション法が前提です。私たちはトレーシング信頼性の高い系統と同様に遺伝子操作を可能にする、ここに、OVOでの鶏の組織で単一の細胞をトランスフェクトするための技術的に簡単な方法を説明します。特定の組織のドメインは、体節や神経管の中でターゲットとしている、とするDNAを単一の細胞の散発的なトランスフェクションの結果、関心の上皮に直接注入される。記者を使って、クローン集団は結果的に3日間まで遡ることができる、そして遺伝子操作クローン集団の挙動は、対照のそれと比較することができます。このメソッドは、遺伝子操作のための新たなツールと共に、ニワトリ胚のアクセシビリティを活用しています。我々は、比較とその広く使用されているエレクトロポレーション法上の利点、および可能なアプリケーションについて説明し、また提案されている追加のin vivoモデルで使用してください。我々は既存の系統のトレースと遺伝的干渉のツールのための重要な追加機能と補完するものとしてこのメ​​ソッドの使用を提唱。

ファインチップを使用すると、我々はニワトリの体節や神経管のサブドメインにプラスミドDNAを注入するマイクロピペット。プラスミドの濃度は、単一のトランスフェクションされた細胞を生成するために調整されます。私たちは、その後、細胞はクローン集団に発展することができます。

発生生物学における中心的なテーマは、系統の多様化とその根底にある分子メカニズムの解明です。これには、...

本手順の全般的な目的は、ニワトリの体節または神経管の単一細胞に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを注入することです。まず、適切な先端開口径を持つマイクロインジェクションピペットをプル（抽出）することでこれを達成します。手順の第2ステップでは、注入用のプラスミドストックを調製します。本手順の第3ステップは、注入用の胚を準備することです。第4ステップでは、マイクロピペットにプラスミドDNAを充填します。そして最終ステップで、目的の組織に注入を行います。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察を通じて、選択した体節および神経管のサブドメインにおいて、単一ラベルされた前駆細胞から産生される細胞数の誘導細胞の範囲を示す結果を得ることができます。こんにちは、エルサレム・ヘブライ大学医学神経生物学教室のハイム教授の研究室のRaelです。今日は、ニワトリの体節および神経管への単一細胞注入の手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて、ニワトリ胚のsomite（体節）および神経管細胞の系統分離を研究しています。それでは、始めましょう。ニワトリ胚において単一の細胞にトランスフェクションを行うために、まずマイクロピペットを製作します。ピペットの製作には、標準的なNaga PP 83ピペットプラーを使用し、加熱設定を13.5に設定します。ピペットチップの直径を8〜10 µmにするため、正確な設定で校正を行う必要があります。本手法では、外径1 mm、内径0.75〜0.78 mmのホウケイ酸ガラス管を含むフィラメントを使用しています。また、外径1 mm、内径0.75 mmのフィラメントを備えていない市販のマイクロピペットを使用することも可能です。準備したピペットは、チップが容器の縁に触れないようにプラスチック製のディッシュに保存します。マイクロインジェクション用のDNAを準備するため、目的のプラスミドをDH5α E. coliにトランスフェクションします。翌日、標準的な手順に従い、Maxi prepキットを用いてプラスミドを精製します。非クローナル注入の場合、DNA濃度は1 µg/µLを使用します。個別のクローンを得たい実験では、プラスミド濃度を大幅に下げて調整する必要があります。P-C-A-G-G-F-P-Aの場合、0.05 to 0.1 microgram per microliterの濃度が適切です。最適な濃度が決定したら、個別に調製するのではなく、精製したプラスミドストック全体をあらかじめ定めた濃度に希釈することを推奨します。後者により、おそらく純度や、超らせん構造プラスミドの割合などのその他のパラメータの変動に起因して、成功率にばらつきが生じる可能性があります。マイクロインジェクション用の鶏卵を準備するには、目的の発生段階に達するまで長軸に沿って寝かせた状態で孵化した鶏卵を70% ethanolで拭き、乾燥させます。次に、外科用ハサミで卵の尖った端に穴を開けます。10 milliliterのシリンジと19ゲージの針を用いて、卵から2 milliliterの白蛋白を吸引し、注入前に穴を熱パラフィンで封止します。外科用鋏を使用して、卵殻の上部に窓を開け、穴の中にゴミが入るのを防ぎます。窓の上にテープを貼り、そのテープに穴を開けます。胚を視覚化しやすくするため、アスピレーターに取り付けた火炎延伸キャピラリーを用いて、剥離した外胚葉の下にpelican 17などの無毒性インクを注入します。次に、ニードルホルダーに装着した0.14 mmの昆虫ピンを用いて、卵黄嚢膜および羊膜を切開・除去して胚にアクセスし、引いたピペット（Eloqua）にDNAをロードします。そして、キャピラリーを用いて少量のfast green粉末を加えます。適切な直径のプラスミド搭載キャピラリーを、アスピレーターを用いて最小限の量だけ吸引します。その後、キャピラリーをピペットの先端とは反対側の端から挿入し、DNAを先端にできるだけ近い位置までロードします。次に、マイクロマニピュレーターに取り付けられた手動空気圧インジェクターにピペットを装着します。必要に応じて最小限の圧力をかけ、プラスミド溶液をピペットの先端まで到達させます。ピペット先端の詰まりを防ぐために少量の空気圧をかけながら、ピペットを卵の液体培地内へと操作します。適切な組織領域を貫通させると、圧力の変化だけで可視化用Fast Greenを含むプラスミドが放出されることが多くあります。放出されない場合は、プラスミドとFast Greenの混合液が排出されるまで、シリンジに軽く圧力をかけます。この手順を胚の軸に沿って繰り返します。注入後にはPBSを添加しても構いません。最後に、ウィンドウを粘着テープで密閉し、卵をインキュベーターに戻します。換気を避け、湿度を維持して回収率を高めるために、インキュベーター内に少量の水を入れた容器を配置してください。注入の標的部位が、背側体節の神経管や外胚葉内など、容易に確認できる浅い部位であった場合は、蛍光双眼顕微鏡を用いてホールマウント観察を行うことで、実験の成功率を測定できます。このステップは、ラベル化された細胞が多すぎないか、あるいは少なすぎないかを確認するのに特に有用です。さらにインキュベーションを行う場合は、観察後にPBS含有抗生物質溶液を卵に加え、天井テープを貼り直してください。また、胚を連続切片化して免疫組織化学染色を行うことで、注入の成功率を評価することも可能です。注射から4時間以上経過後、胚を固定し、パラフィン切片作成のための処理を行います。スライドガラスに貼付した切片を脱パラフィン化し、レポーターを可視化するための免疫染色を行います。この際、ビオチン・ストレプトアビジンなどの増幅法の併用が有効である場合があります。最後に、連続切片をスキャンし、注射した部位におけるラベル化細胞を検出します。初期の試行において、単一細胞ではなく複数の細胞が得られた場合は、プラスミドストックを希釈し、適切な結果が得られるまで工程を繰り返す必要があります。通常、胚1個あたり6〜12個の節を標的とし、1つのsomiteにつきP-C-A-G-G-F-Pを1回注入します。この設定では、注入から8時間後のホールマウント観察により、10個中1個の胚において、少なくとも1つの節で明確なシグナルを検出することが可能です。この例では、so節の節肢にGFPをコードするプラスミドを注入し、5時間後に、ここに示す胚のホールマウント像において単一の蛍光細胞が観察されました。中央のso節への注入から24時間後に観察すると、クローン注入の2日後のホールマウント胚において、蛍光細胞のクローンが観察されます。この体節を切片化すると、真皮と筋肉の両方にクローン子孫が存在することが明らかになり、単一の前駆細胞がこれら両方の派生組織を生成することが示されました。体節と同様に、この横断面（注入から5時間後に撮影）に示されているように、背側神経管内の単一の神経上皮前駆細胞を穿刺することも可能です。連続切片解析の結果、クローン性の導入が達成された際の成功率は約10%であることが明らかになりました。これは、クローン性を確保するためには、定義上、この手法が非常に効率の悪いものであることを意味します。一方で、これらの条件下では、陽性ラベルイベントの93%以上がクローン性であることが判明しました。本手順におけるニワトリ胚の単一細胞への注入方法について説明しました。大量のストックプラスミドを単一細胞感染に最適な濃度に希釈し、それを一連の実験を通して使用することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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