鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

この手順の全体的な目標は、シック体節または神経管の単一細胞に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを注入することです。これは、最初に適切な先端開口部の直径を持つマイクロインジェクションピペットを引っ張ることによって達成されます。手順の2番目のステップは、注射用のプラスミドストックを調製することです。

手順の3番目のステップは、注入用の胚を準備することです。手順の4番目のステップは、マイクロピペットにプラスミドDNAをロードすることです。手順の最後のステップは、目的の組織を注入することです。

最終的には、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、選択したSOMおよび神経管サブドメイン内の単一標識前駆細胞によって産生される細胞の数における誘導体の範囲を示す結果を得ることができます。こんにちは、エルサレム・ヘブライ大学医学部のハイム教授研究室のラエルです。今日は、ニワトリ体節と神経管の単一細胞を注入する手順を紹介します。

この手順を研究室で使用して、ダニ細胞と神経管細胞のライン分離を研究しています。では、始めましょう:ニワトリの胚で単一のトランスフェクション細胞を生成するには、マイクロピペットを引っ張ることから始めます。ピペットは、熱設定が13.5の標準のNaga PP 83ピペットプーラーで引っ張ります。

ピペットチップの直径を8〜10ミクロンにするために、正確な設定を校正する必要があります。ボリスケイ酸ガラス管を配合したフィラメントを使用し、外径は1mm、内径は0.75〜0.78mmです。また、外径1mm、内径0.75mmのフィラメントがない市販のマイクロピペットも使用できます。

準備されたピペットは、先端が皿の端に接触しないように保護されたプラスチック皿に保管されます。マイクロインジェクション用のDNAを調製するために、目的のプラスミドをDH five alpha e coliにトランスフェクションします。翌日、標準的な手順を使用して、プラスミドは非クローン注射用のMaxi調製キットを使用して精製され、1マイクロリットルあたり1マイクログラムのDNA濃度を使用します。

個々のクローンが必要な実験では、プラスミド濃度ははるかに低くなり、調整が必要になります。P-C-A-G-G-F-P-Aの場合、マイクロリットルあたり0.05〜0.1マイクログラムの濃度がうまく機能します。最適な濃度が決定されたら、個々の調製物ではなく、精製したプラスミドストック全体を所定の濃度に希釈することをお勧めします。

後者は、おそらく純度やその他のパラメータの変動により、成功率に多少のばらつきが生じる可能性があります。例えば、所望の発達段階が70%エタノールで綿棒で拭かれて乾燥するまで長軸に横たわったまま孵化させられたニワトリの卵をマイクロインジェクション用の卵を準備するためのスーパーコイルプラスミドの割合などです。次に、卵の先のとがった端を手術用ハサミで突き刺します。10ミリリットルの注射器と19ゲージの針を使用して、卵から2ミリリットルのアルブミンを引き出し、注射前にホットパラフィンで穴を塞

手術用ハサミを使用して卵殻の上部にある窓を開け、破片が穴に入るのを防ぎます。窓にテープを貼り、穴を開けます。胚を視覚化するために、吸引器に取り付けられた火で引っ張られた毛細血管を使用して、ブラストされた皮膚の下にペリカン17などの無毒のインクを注入します。

次に、ニードルホルダーに取り付けられた0.14ミリメートルの昆虫ピンを使用して、生命膜および/または羊膜を切断して迂回させ、DNAを引っ張ったピペットEloquaにロードし、キャピラリーを使用して少量の高速緑色粉末を追加することにより、胚にアクセスします。適切な直径のプラスミドマウントキャピラリーを最小量で吸引器に引き込みます。次に、鋭利な先端とは反対側のピペットの端に挿入し、DNAを鋭利な先端にできるだけ近づけてロードします。

次に、マイクロマニピュレーターに取り付けられた手動空気圧インジェクターにピペットを取り付けます。必要に応じて最小限の圧力で、プラスミド溶液がピペットの先端に到達するようにします。ピペットの先端が詰まらないように空気圧をかけながら、ピペットを卵の液体培地に操作します。

関連する組織ドメインが穿孔されると、圧力の変化はしばしばプラスミドを放出するのに十分であり、目に見える速い緑色になります。これが起こらない場合は、プラスミドの速い緑色の混合物が排出されるまで、シリンジにわずかな圧力を加えます。.この手順を胚の軸に沿って繰り返し、注入後にPBSを追加してもよい。

最後に、窓を粘着テープで密閉し、卵をインキュベーターに戻します。換気を避け、インキュベーターに小さな水の容器を入れて、水分を維持し、収量を増やします。注射の標的部位が、背側体節神経管や外胚葉内など、容易に明らかになるほど表面的であった場合、蛍光双眼鏡を使用して全マウント観察を行うことで、実験の成功率を測定できます。

このステップは、ラベル付けされたセルが多すぎるか少なすぎるかを評価するのに特に役立ちます。さらにインキュベーションが必要な場合は、観察後にPBS溶液を含む抗生物質を卵に追加し、天井テープを交換します。さらに、胚を連続的に切片化し、免疫組織化学を行うことにより、注射の成功率を評価できます。

4時間以上経過した後、注入後の胚を固定し、パラフィン切片処理のために処理します。その後、ガラス実装切片はデパファイナライズされ、ビオチンストレプトアビジンなどのレポーター可視化増幅法のための免疫染色が望ましい場合があります。最後に、シリアル切片をスキャンして、注入されたセグメント内の標識された細胞を検出します。

最初の試験で単一細胞ではなく複数の細胞が得られた場合は、適切な結果が得られるまで、プラスミドストックをプロセスで希釈する必要があります。私たちは通常、胚ごとに6〜12セグメントを標的としながら、ダニごとにP-C-A-G-G-F-Pを1回注射します。この設定では、10個中1個の胚の少なくとも1つのセグメントに注入後8時間で、全体のマウント観察によって明確な信号を検出することができます。

この例では、SOダニにGFPをコードするプラスミドを注入し、5時間後に、ここに示す胚の全マウントビューで単一の蛍光細胞が観察されます。中央ソダニへの注入から24時間後に観察すると、クローン注射の2日後に全体のマウントされた胚に蛍光細胞のクローンが観察されます。このセグメントの切片化により、真皮と筋肉の両方にクローン子孫が存在することが明らかになり、単一の前駆細胞が両方の誘導体を生成することが実証されています。

体節に関しては、この横断面に示されているように、背側神経管内の単一の神経上皮前駆細胞も突き刺すことができます(これはここで注射の5時間後に撮影されています)。シリアル切片解析により、成功率が約10%のときにクローン性トランスフェクトが達成されることが明らかになりましたこれは、クローナリティを達成するためには、この技術が定義上非常に非効率的であることを意味します。一方、これらの条件下では、陽性標識イベントの93%以上がクローン性であることがわかりました。

この手順を行う際に、ニワトリの胚の単一細胞を注入する方法を紹介しました。大量のストックプラスミドをシングルセル感染に最適な濃度に希釈し、実験全体で使用することを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。