Name: 大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶLAESI質量分析法による単一細胞の直接分析。レーザーアブレーションと電気スプレーイオン化を組み合わせ、大気圧下で植物・動物細胞の代謝物と脂質をリアルタイムに検出する革新的な手法です。

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著者は、以下の機関が資金援助を認める、国立科学財団（グラント0719232）、エネルギー省（グラントDEFG02 - 01ER15129）、WMケック財団（助成041904）、およびジョージワシントン大学の研究強化基金。著者らは赤外線ファイバーシステム（シルバースプリング、MD）によってだけでなく、マークE.リーブス、ジョージワシントンのジョーンA.ホフマンによって繊維のエッチングに関するプロトコルに関する初期の議論のための寛大に付属のGeO2系光ファイバのために感謝しています大学。また、作者はプロトコルのビデオ撮影中に彼女の助けのためにジェシカA. Stoleeに感謝したいと思います。

1。光学部品<ol><li>レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析（MS）のためのレーザーアブレーションは、2.94μmの波長の5ナノ秒レーザーパルスによって生成されます。ネオジムで駆動される可変光パラメトリック発振器：YAGレーザー（Opolette 100、Opotek社、カールスバッド、カリフォルニア州）はこの研究ではアブレーションのために使用されます。繰返し速度は5〜100 Hzの間で選択されています。これは直接の暴露による眼や皮膚に深刻な永久的な損傷を引き起こす可能性があることをクラスIVのレーザーです。レーザービームの乱反射はまた、皮膚や眼に対して危険です。保護のための適切なレーザーのゴーグルを着用してください。 </li><li>二酸化ゲルマニウムベースのガラス製の光ファイバは、赤外ファイバーシステムズ社（シルバースプリング、MD）から入手した。そこハイトレルであり、繊維のコーティングをポリイミド場合両端からそれらを削除するには、次の指示に従ってください。 ° Cドラフト内で130から150までヒート1 - メチル-2 - ピロリジノン。繊維は、約1分間、またはコーティングの軟化を開始し、剥離するまでこの液体に削除するようにしたい終わる浸します。分のためのメタノールまたはイソプロパノールに軟化コーティングを浸し、糸くずの出ないナプキンと残りのコーティングを拭き取ってください。コー​​ティングを除去した後、切断するスコアリングと優しくして洗浄液を完全にサファイアブレード（KITCOファイバーオプティクス、バージニアビーチ、バージニア州）と光ファイバの両端。 </li><li> 1％（v / v）の硝酸（試薬特級）ソリューションによって、繊維の先端の化学的エッチング一方の端を目的のシャープネスを実現する。垂直に最初の接触後、300〜500μmの深さに酸溶液中に繊維の選択終了を浸す。エッチングの約15分後、先端には、自発的に酸の表面から分離させます。曲率の​​〜15μmの半径を持つ尖った繊維の先端でこの結果。任意の酸残基を除去する脱イオン水ですすいでください。 </li><li>マイクロマニピュレータの光ファイバ（MN - 151、成茂、東京、日本）のエッチング端をマウントし、効率的なエネルギー付与のために細胞表面の近接（〜20μm）を閉じるためにそれをもたらす。 </li><li>ベアファイバチャック（BFC300、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）によって光ファイバの非エッチング端を保持する。光学的アラインメントの場合は、ファイバーチャックは5軸トランスレータ（BFT - 5、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）にマウントされています。レーザーのエネルギー（0.5〜1 MJ）は、その非エッチングエンドに平凸フッ化カルシウムまたは反射防止コーティングのZnSeレンズ（赤外線光学製品、ファーミングデール、ニューヨーク州）でビームを集中させ繊維に結合される。保護された金の鏡（PF10 - 03 - M01、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）は、集光レンズの上に中赤外レーザビームを操縦するために使用されます。 </li></ol> 2。エレクトロスプレーセットアップ<ol><li>導電性パーフロロエラストマーフェラル、フィッティング、チューブスリーブ、ニードルポート（それぞれ例えば、U - 435、M215、F - 331Nx、F - 242x、9013、IDEX健康科学、と金属労働組合：エレクトロスプレーシステムは、次のコンポーネントを使用して構築することができます。オークハーバー、ワシントン州）だけでなく、フューズドシリカチューブ（例えば、CT360 - 100 - 50 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）。推奨エミッタはステンレス鋼製で、50μmのID（例えば、MT320 - 50 - 5 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）とテーパー先端部を有している。 </li><li>エレクトロのための0.1％酢酸（v / v）で50％メタノール溶液を調製。ソリューションを使用して、シリンジポンプ（ハーバード装置、ホリストン、MA）で200〜300 NL / minの速度で励起され、例えば、500μLシリンジ（81222、ハミルトン社、リノ、ネバダ州）。 </li><li>安定したエレクトロスプレーを生成するために安定化電源（PS350、スタンフォードリサーチシステムズ社、カリフォルニア州サニーベール）によって金属の組合に2800と3,000 Vの間に高電圧を印加してください。すべての電気接続が確実、適切に接地されたシールドでシールドしていることを確認してください。露出の高電圧との直接接触は感電の恐れがあります。 </li></ol> 3。サンプル処理<ol><li>適切なソースから生きている組織または細胞のサンプルを入手し、それらを分析する前に推奨してください。このデモ用のタマネギの球根は、ローカルストアから購入した。外科用メスで縦方向に電球をカット。規模の少数のセンチメートルのセグメントは、ストリップに区分した。内側の表皮組織の完全な単分子膜を剥離する。 </li><li>表皮の湿った表面は、事前に洗浄したガラスの顕微鏡スライド上の組織をマウントするために使用されます。位置決め用の三軸移動ステージにマウントされている汎用のプレートホルダー（FP01、Thorlabs社、ニュートン、ニュージャージー州）でスライドをホールド。セルの劣化を防止するためにサンプルをマウントした直後にマススペクトルを取得する。 </li></ol> 4。可視化システム<ol><li>二つの長距離顕微鏡は、分析用のセルを選択すると尖った繊維の先端と細胞表面との間の距離を維持するために使用されています。後者は表面から測定した15 ° -30 °の角度でマウントされています。このシステムは、らで構成されています5倍の無限大とオングの距離のビデオ顕微鏡（7倍精度ズーム光学、エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）は、CCDカメラ（マーリンF131、アライドビジョンテクノロジーを搭載した、対物レンズ（Mプランアポ5倍、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）を修正監視および画像取り込みのための、Stadtroda、ドイツ）。 </li><li>秒のビデオ顕微鏡は、上から細胞を可視化するために試料表面に直角に取り付けられている。このシステムは、アブレーションおよび分析のために選択したセルの上のファイバーの先端を揃えるために視覚的なフィードバックを提供します。それは10倍の無限大を搭載した7倍の精度ズーム光学（エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）から成り、長作動距離対物レンズ（10倍Mプランアポ、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）とCCDカメラを訂正。 </li></ol> 5。マススペクトルの取得<ol><li>レーザー、エレクトロスプレー質量分析計、例えば、四重極飛行時間型システム（Q - TOFプレミア、ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州）をオンにします。アブレーションのスポットやエレクトロ互いに相対的なエミッタと最大イオン強度を達成するために質量分析計のオリフィスの位置を調整することによって、LAESIのイオン源の形状を最適化します。 </li><li>トップビューの可視化システムを使用して分析の対象セルを選択します。選択後、直接光ファイバの先鋭化先端下に選択したセルを持って来るために、サンプルステージを移動します。サイドビュー顕微鏡を使用すると、〜20μmの先端から細胞表面の距離を再調整。 </li><li>エッチングされた光ファイバ先端を介して選択されたセルでの火災のレーザーパルスを。細胞壁と粒子状物質の形で細胞質の放出の穿孔でこの結果。エレクトロスプレーによるpostionizationした後、生成したイオンは質量分析計と質量スペクトルによって収集され記録されます。 </li><li>データ収集後は、レーザー、スタンバイモードのエレクトロと質量分析計を入れたり、それらの電源を切ります。アブレーションA.キープ光顕微鏡によるオプションの観察のためのCEPAの組織サンプル。 </li></ol> 6。代表的な結果細胞壁とLAESIの質量スペクトルのコレクションの崩壊で、単一セルの結果の成功アブレーション。失敗した実験は、通常、無アブレーションおよび/または無質量スペクトルをもたらす。デモンストレーションの目的のために、我々はAの単一の埋め込 ​​まれた表皮細胞のLAESI - MS分析の結果を提示CEPAの電球。図2aは、細胞の採取後の代表的な光学顕微鏡像を示しています。細胞壁は、ミシン目が入っていますし、穿孔の程度は、隣接セルとの境界によって制限されます。隣接する細胞が正常であるように思われる。図2bは、細胞から産生さ代表LAESIの質量スペクトルを示しています。イオンの多種多様なAから検出されCEPAのセルとその正確な質量に基づいて、同位体の分布パターン、及び、いくつかのケースでは、タンデム質量スペクトル、それらは暫定的に内因性代謝物に割り当てられます。単一の細胞から検出されたイオンは、複数のセルの従来のLAESI - MSで同じ組織の分析で観察されたものと類似していた。13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 LAESI - MSによる単一細胞解析の概略図 。中赤外レーザーパルスが光ファイバに結合し、ガラススライド上に配置サンプルに配信されます。尖った繊維の先端は、標的細胞に光を当てて堆積したエネルギーは、セルを爆発。生成されたアブレーションプルーム（赤い点）は液滴が合体するエレクトロスプレープルーム（黒ドット）（緑の点）のサンプル、特定のイオン生成の結果とマージされます。これらのイオンは、質量分析計（MS）により分析し、検出されます。二つの長距離ビデオマイクロスコープ、顕微鏡1、顕微鏡2は、繊維の先端と細胞表面との間の距離を監視し、それぞれ、分析のためのセルを選択するために利用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="図2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2a"> A.単一の表皮細胞上図2a。アブレーションマークCEPAの電球。隣接するセルは、目に見える損傷を示していないと、その後別々に分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="図2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2b"> シングルAのアブレーションに対応する図2b。質量スペクトルCEPA表皮細胞は一次と二次代謝産物の存在を示しています。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞の細胞質と細胞壁や細胞膜の引張強度の含​​水量はLAESI - MS分析時の単一細胞のアブレーションを支配する重要な要素です。レーザーのフルエンスは、異なる細胞型のアブレーションしきい値に達するように調整する必要があります。納入レーザフルエンスは、レーザーパルスのエネルギーにし、繊維の先端と細胞表面との間の距離に依存する。単一細胞解析の間に隣接するセルの摂動を最小化することが重要です。アブレーションしきい値でレーザーのエネルギーを保つことは、隣接するセルに分析の影響を制限します。 潜在的なアプリケーションの一つは、MSによる化学イメージングのための自然な体積画素（ボクセル）として単一のセルを使用しています。人工しばしば長方形のグリッド上でデータを収集して比較して、一度に組織つのセルの化学イメージングは​​、細胞間の生化学的相互作用の空間的な組織を維持する可能性が高くなります。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Fluka</td><td>45727</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fluka</td><td>65548</td><td></td></tr><tr><td>1-メチル-2-ピロリドン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M79603</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Fluka</td><td>39259</td><td></td></tr></tbody></table>

大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

単一細胞内の生化学物質の分析でも同じ種類の細胞がそれらの生理的条件と環境との相互作用に応じて、異種の生化学的メイクを示す細胞の代謝、細胞周期、適応、疾患の状態などを理解する上で重要です。単一細胞内の生体分子の解析に用いる質量分析（MS）の従来の方法には、豊富なサンプル調製に依存しています。彼らの自然環境と豊富なサンプルの処理から細胞を除去する細胞組成の変化につながる可能性があります。周囲のイオン化法は、ネイティブ環境では、広範な試料調製のないサンプルの分析が可能になります。1は 2.94μmの波長の生物学的材料の中間赤外（中赤外）レーザーアブレーションに基づく技術は、水の突然の励起を利用するその段階での結果爆発。このようなレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（LAESI）と大気圧赤外線マトリックス支援レーザー脱離イオン化（AP IR - MALDI）などの中赤外レーザーの照射に基づいて2周囲イオン化技術は、正常に直接水を分析する能力を実証した大気圧下で豊富な組織や体液。LAESI主にイオンを生成するために高度に帯電したエレクトロスプレー液滴と試料の合体から中性の粒子状物質で構成されて中赤外レーザーアブレーションプルーム中の3-11。最近、単一の細胞の中赤外アブレーションは、エッチングされた光ファイバを介して中赤外放射を提供することにより行った。このアブレーションから生成されるプルームはLAESI - MSによる単一細胞の多様な代謝物の分析を可能にするエレクトロスプレーによってpostionizedした。12この記事は、LAESI - MSを用いて単一細胞解析のための詳細なプロトコルを記述している。紹介ビデオは、 タマネギの球の皮膚から単表皮細胞の分析を示しています。システムの概略図を図1に示されています。細胞から単一細胞のアブレーションとLAESIのマススペクトルの代表例を図2に提供されています。

単一細胞解析は、レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析のために細胞をサンプリングするために削られた光ファイバを使用して、大気圧下で植物や動物の細胞に質量分析法によって行われます。

単一細胞内の生化学物質の分析は、細胞代謝、細胞周期、適応、疾患状態などを理解する上で重要です。たとえ同一の細胞であっても...

本実験の全体的な目的は、単一の生存細胞の内容物を放出させ、放出された生体分子を大気圧下でイオン化し、質量分析計で分析することである。これは、長距離顕微鏡を用いて単一の細胞を選択し、研磨した光ファイバーを通じて配送される波長2.94 µmのレーザーパルスで選択した細胞をアブレーションすることにより達成される。単一細胞のアブレーションにより、中性粒子状物質からなる微細なプルームが形成され、このアブレーションプルームをイオン化する。これはエレクトロスプレーによって遮断されます。スプレーからの帯電した液滴は、細胞に由来するアブレーションプルームの粒子と合体します。その結果、得られた液滴には細胞由来の分子が取り込まれ、関連するイオンが生成されます。単一細胞からのマススペクトルを示す結果が得られました。このスペクトルには、細胞の代謝物および脂質に関連する多数のピークが含まれています。こんにちは。ジョージ・ワシントン大学化学科、Verese研究室のBin Drester博士です。本日は、大気圧下での質量分析による単一生細胞の直接分析の手順について解説します。当研究室ではこの手法を用いて、単一の植物細胞および動物細胞から代謝物や脂質を解析しています。それでは始めましょう。レーザーアブレーション電 spraying イオン化質量分析（Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry）、または LAESI-MS は、波長 2.94 µm の 5 ns のレーザーパルスによって行われます。本研究のアブレーションには、Nd:YAG レーザー駆動の可変波長光パラメトリック発振器を使用しています。まず、エッチングを施した光ファイバー端をマイクロマニピュレーターに取り付け、細胞表面の至近距離まで近づけます。効率的にエネルギーを注入するため、光軸調整用にエッチングされていない光ファイバー端をベアファイバーチャックで固定してください。ファイバーチャックは5軸トランスレーターに取り付けられています。プラノコンベックス（平面凸）のフッ化カルシウムレンズまたは反射防止コーティングを施したセレン化亜鉛レンズを用いてビームを集光し、非エッチング端に照射することで、レーザーエネルギーをファイバーに結合させます。中赤外レーザービームを集光レンズに向けるには、保護ゴールドミラーを使用して誘導してください。研磨したファイバーチップと細胞表面との距離を維持するために、表面から計測して15～30度の角度に取り付けられた長距離ビデオ顕微鏡を使用します。このシステムは、モニタリングおよび画像キャプチャ用のCCDカメラを備えた5倍の無限遠補正対物レンズでも構成されています。2台目のビデオ顕微鏡を試料表面に対して直角に取り付け、細胞を上面から可視化して分析対象を選択します。このシステムにより、アブレーションおよび分析のために、選択した細胞の上にファイバーチップを合わせるための視覚的なフィードバックが得られます。構成は、7倍の精密ズーム光学フィッター、10倍の無限遠補正長作動距離対物レンズ、およびCCDカメラで構成されています。エレクトロスプレーシステムは、導電性パーフルオロエラストマー製フェルール継手、チューブ、スリーブニードルポート、およびFUシリカチューブを備えた金属ユニオンを用いて構築しました。推奨されるエミッターはステンレス鋼製で、先端がテーパー状になっており、直径は50 $\mu$mです。エレクトロスプレー用に、0.1%酢酸を含む50%メタノール溶液を調製します。シリンジポンプを用いて、この溶液を200〜300 nL/minの速度で注入してください。500 µLシリンジを用い、調整可能な電源を使用して、金属接合部に2,803,000 Vの高電圧を印加します。安定したエレクトロスプレーを生成するために、すべての電気接続が確実であり、シールドで適切に保護され、接地されていることを確認してください。露出した高電圧に直接触れると感電の恐れがあります。適切なソースから生体組織または細胞サンプルを入手し、分析前に推奨される方法で保存してください。本デモンストレーションに使用したAllium cepaの球根は、地元の店舗で購入しました。Allium cepaの球根サンプルの調製として、外科用メスを用いて球根を縦方向に切断し、鱗片から約2平方センチメートルの断片を切り出します。次に、内表皮組織の完全な単層を剥離します。表皮の濡れた面を利用して、あらかじめ洗浄したガラス製顕微鏡スライドに組織を固定します。スライドは汎用プレートホルダーで固定し、位置調整のために3軸トランスレーションステージに取り付けます。細胞の劣化を防ぐため、サンプルの装着直後に質量スペクトルを取得してください。まず、レーザー、エレクトロスプレー、および質量分析計の電源を入れます。アブレーションスポットおよびエレクトロスプレーエミッターの位置を、互いに対して、および質量分析計のオリフィスに対して調整することで、レーザーイオン源のジオメトリを最適化します。イオン強度を最大にするために、上面視可視化システムを用いて、分析対象のセルを選択してください。選択後、サンプルステージを移動させ、選択したセルを光ファイバーの研磨された先端の直下に配置します。サイドビュー顕微鏡を使用して、チップから細胞表面までの距離を約20 micronsに再調整します。エッチングされたファイバーチップを通じて選択した細胞にレーザーパルスを照射し、正しい位置に合わせます。これにより細胞壁が穿孔され、細胞質が粒子状物質として放出されます。エレクトロスプレーによるイオン化後、生成されたイオンを質量分析計で回収し、質量スペクトルを記録します。データ取得後、レーザー、エレクトロスプレー、および質量分析計をスタンバイモードにするか、電源を切ってください。アブレーション処理を施したallium cper組織サンプルは、光学顕微鏡による任意観察のために保管してください。単一細胞のアブレーションに成功すると、細胞壁が破裂し、遅延質量スペクトルが収集されます。以下は、Allium SEPA球根の単一の埋め込み表皮細胞を用いたlazy MS分析の結果であり、代表的な光学顕微鏡画像を示しています。細胞のサンプリング後、細胞壁に穿孔が生じますが、その穿孔範囲は隣接する細胞との境界によって制限されます。隣接する細胞は無傷であると考えられます。ここでは、細胞から得られた代表的なレーザー質量分析スペクトルを示します。1細胞あたりの allium sea から多種多様なイオンが検出されており、それらの精密質量、同位体分布パターン、およびタンデム質量分析スペクトルに基づいて、イオンが内因性代謝物へと慎重に割り当てられています。単一細胞から検出されたイオンは、複数の細胞を用いた従来のレーザーMSによる同一組織の分析で観察されたものと同様でした。以上で、大気圧下での質量分析による単一生細胞の解析方法について説明しました。この手順を行う際は、クラス4赤外線レーザーによる不慮の曝露を避けるため、保護メガネを着用することを忘れないでください。これで終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

このプロトコルでは、市販の試薬と機器を使用した質量分析 による...

凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語)

このプロトコルは、揮発性塩溶液洗浄、急速液体窒素急冷、凍結乾燥、および-8°C保存を組み合わせることにより、単一細胞質量分析(SCMS)用の細胞代謝産物を保存することを目的としています。これは、液体窒素の急冷が代謝産物プロファイルを維持するために不可欠である一方で、代謝の変化を防ぐために長期の冷蔵保管を最小限に抑える必要があることを示しています。...

シングルセル質量分析メタボロミクス研究のためのサンプル前処理:細胞洗浄、急冷、乾燥、保管の組み合わせ

本プロトコルは、脱着エレクトロスプレーイオン化を用いてOVCAR-8細胞の単一細胞質量分析画像化を用い、Orbitrap質量分析器と結合して高空間分解能のメタボロミクス解析を行うことを説明しています。...

脱着電気噴霧イオン化を用いた単細胞質量分析イメージングとオービトラップ質量分析計

このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI -...

MALDIサンプル調製：超薄層法

学ぶLAESI質量分析法による単一細胞の直接分析。レーザーアブレーションと電気スプレーイオン化を組み合わせ、大気圧下で植物・動物細胞の代謝物と脂質をリアルタイムに検出する革新的な手法です。

大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析

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