大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析

本実験の全体的な目的は、単一の生存細胞の内容物を放出させ、放出された生体分子を大気圧下でイオン化し、質量分析計で分析することである。これは、長距離顕微鏡を用いて単一の細胞を選択し、研磨した光ファイバーを通じて配送される波長2.94 µmのレーザーパルスで選択した細胞をアブレーションすることにより達成される。単一細胞のアブレーションにより、中性粒子状物質からなる微細なプルームが形成され、このアブレーションプルームをイオン化する。

これはエレクトロスプレーによって遮断されます。スプレーからの帯電した液滴は、細胞に由来するアブレーションプルームの粒子と合体します。その結果、得られた液滴には細胞由来の分子が取り込まれ、関連するイオンが生成されます。

単一細胞からのマススペクトルを示す結果が得られました。このスペクトルには、細胞の代謝物および脂質に関連する多数のピークが含まれています。こんにちは。ジョージ・ワシントン大学化学科、Verese研究室のBin Drester博士です。

本日は、大気圧下での質量分析による単一生細胞の直接分析の手順について解説します。当研究室ではこの手法を用いて、単一の植物細胞および動物細胞から代謝物や脂質を解析しています。それでは始めましょう。

レーザーアブレーション電 spraying イオン化質量分析（Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry）、または LAESI-MS は、波長 2.94 µm の 5 ns のレーザーパルスによって行われます。本研究のアブレーションには、Nd:YAG レーザー駆動の可変波長光パラメトリック発振器を使用しています。

まず、エッチングを施した光ファイバー端をマイクロマニピュレーターに取り付け、細胞表面の至近距離まで近づけます。効率的にエネルギーを注入するため、光軸調整用にエッチングされていない光ファイバー端をベアファイバーチャックで固定してください。ファイバーチャックは5軸トランスレーターに取り付けられています。

プラノコンベックス（平面凸）のフッ化カルシウムレンズまたは反射防止コーティングを施したセレン化亜鉛レンズを用いてビームを集光し、非エッチング端に照射することで、レーザーエネルギーをファイバーに結合させます。中赤外レーザービームを集光レンズに向けるには、保護ゴールドミラーを使用して誘導してください。研磨したファイバーチップと細胞表面との距離を維持するために、表面から計測して15～30度の角度に取り付けられた長距離ビデオ顕微鏡を使用します。このシステムは、モニタリングおよび画像キャプチャ用のCCDカメラを備えた5倍の無限遠補正対物レンズでも構成されています。

2台目のビデオ顕微鏡を試料表面に対して直角に取り付け、細胞を上面から可視化して分析対象を選択します。このシステムにより、アブレーションおよび分析のために、選択した細胞の上にファイバーチップを合わせるための視覚的なフィードバックが得られます。構成は、7倍の精密ズーム光学フィッター、10倍の無限遠補正長作動距離対物レンズ、およびCCDカメラで構成されています。

エレクトロスプレーシステムは、導電性パーフルオロエラストマー製フェルール継手、チューブ、スリーブニードルポート、およびFUシリカチューブを備えた金属ユニオンを用いて構築しました。推奨されるエミッターはステンレス鋼製で、先端がテーパー状になっており、直径は50 $\mu$mです。エレクトロスプレー用に、0.1%酢酸を含む50%メタノール溶液を調製します。シリンジポンプを用いて、この溶液を200〜300 nL/minの速度で注入してください。

500 µLシリンジを用い、調整可能な電源を使用して、金属接合部に2,803,000 Vの高電圧を印加します。安定したエレクトロスプレーを生成するために、すべての電気接続が確実であり、シールドで適切に保護され、接地されていることを確認してください。露出した高電圧に直接触れると感電の恐れがあります。適切なソースから生体組織または細胞サンプルを入手し、分析前に推奨される方法で保存してください。

本デモンストレーションに使用したAllium cepaの球根は、地元の店舗で購入しました。Allium cepaの球根サンプルの調製として、外科用メスを用いて球根を縦方向に切断し、鱗片から約2平方センチメートルの断片を切り出します。次に、内表皮組織の完全な単層を剥離します。表皮の濡れた面を利用して、あらかじめ洗浄したガラス製顕微鏡スライドに組織を固定します。

スライドは汎用プレートホルダーで固定し、位置調整のために3軸トランスレーションステージに取り付けます。細胞の劣化を防ぐため、サンプルの装着直後に質量スペクトルを取得してください。まず、レーザー、エレクトロスプレー、および質量分析計の電源を入れます。

アブレーションスポットおよびエレクトロスプレーエミッターの位置を、互いに対して、および質量分析計のオリフィスに対して調整することで、レーザーイオン源のジオメトリを最適化します。イオン強度を最大にするために、上面視可視化システムを用いて、分析対象のセルを選択してください。選択後、サンプルステージを移動させ、選択したセルを光ファイバーの研磨された先端の直下に配置します。

サイドビュー顕微鏡を使用して、チップから細胞表面までの距離を約20 micronsに再調整します。エッチングされたファイバーチップを通じて選択した細胞にレーザーパルスを照射し、正しい位置に合わせます。これにより細胞壁が穿孔され、細胞質が粒子状物質として放出されます。

エレクトロスプレーによるイオン化後、生成されたイオンを質量分析計で回収し、質量スペクトルを記録します。データ取得後、レーザー、エレクトロスプレー、および質量分析計をスタンバイモードにするか、電源を切ってください。アブレーション処理を施したallium cper組織サンプルは、光学顕微鏡による任意観察のために保管してください。単一細胞のアブレーションに成功すると、細胞壁が破裂し、遅延質量スペクトルが収集されます。

以下は、Allium SEPA球根の単一の埋め込み表皮細胞を用いたlazy MS分析の結果であり、代表的な光学顕微鏡画像を示しています。細胞のサンプリング後、細胞壁に穿孔が生じますが、その穿孔範囲は隣接する細胞との境界によって制限されます。隣接する細胞は無傷であると考えられます。

ここでは、細胞から得られた代表的なレーザー質量分析スペクトルを示します。1細胞あたりの allium sea から多種多様なイオンが検出されており、それらの精密質量、同位体分布パターン、およびタンデム質量分析スペクトルに基づいて、イオンが内因性代謝物へと慎重に割り当てられています。単一細胞から検出されたイオンは、複数の細胞を用いた従来のレーザーMSによる同一組織の分析で観察されたものと同様でした。

以上で、大気圧下での質量分析による単一生細胞の解析方法について説明しました。この手順を行う際は、クラス4赤外線レーザーによる不慮の曝露を避けるため、保護メガネを着用することを忘れないでください。これで終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。