のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで腫瘍イメージングとモニタリング

卵巣がんは一般に、致死率に対する症例数が多い進行期に診断されます。したがって、卵巣がんは、米国の女性の間ですべての婦人科悪性腫瘍の中で最も致死的です。ここでは、漿液性卵巣癌の同系マウスモデルについて、in vivoイメージングと腫瘍微小環境の研究の両方で行うことができます。

Cnmy由来の蛍光タンパク質kakaとDR26マウストランスジェニックに由来する卵巣癌細胞株をMIS two Rタグに安定的に形質導入しました。MOV one catと名付けられたこれらの細胞は、腫瘍が発生しやすいTG MIS two Rタグトランスジェニックマウスの卵巣に注射され、成長して蛍光性漿液性卵巣癌に発展します。腫瘍の進行をモニターするために、In vivoイメージングが行われます。

次に、卵巣を解剖し、免疫組織化学を行って腫瘍微小環境を研究します。この動物モデルは、遺伝子モデルの存在に比べて3つの主要な利点を示しています。まず、マウスは、患者で最も頻度の高い組織型であるヒトゼロ卵巣がんと同様の腫瘍を発症しました。

第二の腫瘍細胞は蛍光標識されています。したがって、腫瘍の進行はinbivoイメージングによって追跡することができます。第三に、マウスは免疫適格であるため、宿主の白血球による腫瘍浸潤を研究することができます。

全体として、これらの特性により、動物モデルは前臨床試験に理想的でした。MUおよび阻害物質2型受容体またはtgm MIS S two Rタグの転写制御下でSB40大腫瘍抗原をトランスジェニックするマウスは、Fox Chase Cancer CenterのConnelley医師とHamilton医師によって開発されました。雌のtgm IS two Rタグマウスは、Tgm IS two Rタグマウスでヒトの漿液性卵巣癌に似た両側上皮性卵巣癌を自然に発症しました。

IS two Rプロモーターは、SV 40 T抗原の発現を、卵巣を含む雌マウス生殖管の上皮に標的とする。導入遺伝子の発現は子宮や卵管で検出できますが、腫瘍は卵巣でのみ発生します。TG MISの2つのRタグマウスの独立系統を単離した。

tgm IS two R tag DR 26において、特異的にタグ導入遺伝子発現を示す明確な表現型を示す。MICEは、浸透度100%の両側性卵巣腫瘍の発生につながる変化を遂げています。DR 26マウスは6ヶ月生存しますが、卵巣腫瘍の早期発生により不妊です。

SB 40タグ導入遺伝子を発現するが、卵巣腫瘍を発症しない追加のトランスジェニック系統が同定されている。これらのマウスは、C 57ブラックシックスマウスの典型的な寿命を示し、繁殖力があります。これらのマウスは、TG MIS S two R tag DR 26マウスから単離された腫瘍細胞のSYNGENEIC同種移植レシピエントとして使用できます。

同系マウスにおける漿液性卵巣癌のこの新しい同所性モデルの利点は、最初にin vivoイメージングによって腫瘍の発生を追跡できることです。第二に、自発的な腫瘍増殖などの交絡因子なしに腫瘍の発生を制御すること。第三に、宿主白血球による腫瘍浸潤を研究し、第四に、非腫瘍になりやすいtgm ISの繁殖力による大規模な実験グループを簡単に設定するために、同所性注射前に2つのRタグ付きマウスを培養します。DR26腫瘍に由来するMOV 1 cat細胞をT1 75フラスコで90%コンフルエントになるまで培養します。

1回の注射で1〜500万個の細胞を使用することを計画し、注射当日に1〜2個のT1 75フラスコが必要になります。細胞を採取し、ヘモサイトメーターを使用して細胞数を決定します。細胞濃度が決定したら、室温で300 Gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。

スピン後、リースは、手術前に細胞を懸濁して、0.002モルEDTAの滅菌PBSの10マイクロリットルに100万個を含有させます。10立方センチメートルのインスリン注射器3本に、10マイクロリットルのP-B-S-E-D-T-Aに100万個のmov one猫細胞を入れます。イソフッ素系麻酔マウスを加熱パッドに移します。

I脱水症を防ぐために目の軟膏を追加します。その後、すぐに動物の頭部をイソフッ素気化器に接続されたノーズコーンシステムに挿入し、消毒部位で手術中に麻酔を照射します。10立方センチメートルのインスリン注射器3本で術前鎮痛剤であるケトプロフェンを1キログラムあたり5ミリグラムを皮下注射します。

バリカンを使用して、背側の左カラル部分を胸部腰椎接合部から動物の尾の付け根まで剃ります。脱毛クリームを塗ると、髪の毛を完全に取り除きます。次に、濡れたペーパータオルで余分なものを取り除きます。

髪の毛を取り除いたら、剃った部分をポビドンヨードとアルコール綿棒で滅菌します。次に、手術の直前に切開部の周りに外科用ドレープを置きます。isofフッ素気化器のレベルを1.5%に調整しますフットパッドをつまんで動物が完全に麻酔されていることを確認します。

次に、脾臓を皮膚の下に配置します。次に、手術用ハサミを使用して、背側を1〜2センチの長さに切開します。脾臓の右上で、後腹膜を解剖します。

マウスの卵巣を囲むパッドが観察されます。湾曲した鉗子を使用して、マウスの卵巣を囲む脂肪パッドをつかんで露出させました。湾曲した鉗子を使用して卵巣をつかみ、位置を引っ込めてから、鉗子で卵巣をしっかりとつかみながら注射のために卵巣を固定する滅菌PBSを数滴滴で臓器に水分補給します。

10マイクロリットルのmov one cat腫瘍細胞を卵巣に注入します。しっかりと握ることで、注入直後の体液の逆流や漏れを防ぐことができます。鉗子がかける張力を解放します。

卵巣の穿孔は、吸収性ポリグリコール酸縫合糸を使用して自発的に収縮および閉じ、後腹膜創傷を閉じ、動物を鼻円錐から解放し、皮膚を伸ばし、背側側創傷縁を数滴の組織接着剤で密封するべきである。動物をケージに戻し、回復を監視します。動物が経口で回復したら、100マイクロリットルの抗生物質を投与します。

動物を飲料水中の抗生物質に1週間保管してください。mov one catの同所性注射の1週間後、腫瘍細胞はin vivoイメージングを行います。まず、イソフッ素系麻酔マウスをイメージングチャンバーに移します。

isofフッ素気化器のレベルを2%に下げますイメージングシステムメーカーの指示に従って、invivoイメージングを実行します。このビデオでは、ルミナシステムを使用してイメージングを行います。リビングイメージソフトウェアのデスクトップアイコンをクリックします。

次に、IVIS 取得コントロール パネルで [初期化] を選択します。機器の設定は、データ収集コントロールパネルのカメラ設定と似ています。蛍光チェック蛍光灯のための装置の取得パラメータを設定します。

写真ボックスをクリックすると、各画像で写真を取得できます。次に、ピクセル入札またはCCD解像度で露光時間を自動に設定し、メディアを確認します。次に、Fストップまたは絞りで、2の値を確認します。

次に、視野で5 35励起フィルターとDS赤色発光フィルターを選択します。ビュー B をクリックして、1 つのマウスをイメージします。次に、[取得]をクリックして画像取得を開始します。

画像取得が完了したら、関心領域または ROI ツールを使用して信号を測定します。アイコンをクリックすると、信号値とエリアが解放されます。最後に、[保存]をクリックして、画像をユーザーフォルダに保存します。

画像を保存した後、イソフッ素の投与を中止し、マウスをケージに戻します。マウスは、このプロトコルを使用してすぐにウェイクアップする必要があります。オルソトピックのin vivo成長。

卵巣がんは少なくとも3週間監視できます。非侵襲的手順を使用して、MOV one cat cells or PBS as negative control or ortho topically to non-tumor prent recipient.マウスのin vivoイメージングは2週間後に行われました。

mve one cat細胞を卵巣に生着させて生成した蛍光発光を測定し、ネガティブコントロールマウスの蛍光発光と比較した。mve one cat卵巣腫瘍の凍結切片をビオチン化抗CD 4モノクローナル抗体で染色し、続いてDAB基質で染色しました。腫瘍浸潤リンパ球を検出するために、細胞をメチルグリーンで対比染色して細胞核を視覚化しました。

腫瘍細胞は形態学的にT細胞と異なっていました。このビデオを見た後、マウス卵巣で同所性注射を行う方法についてよく理解しているはずです。また、この技術は、卵巣がんの分野の研究者が免疫担当マウスモデルで腫瘍と宿主微小環境との相互作用を研究する道を開きました。