Name: のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで腫瘍イメージングとモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ漿液性卵巣癌の同所性マウスモデル構築法。免疫担当マウスを用いたin vivoイメージングで腫瘍進行をリアルタイムにモニタリングし、腫瘍微小環境の動態解析が可能です。

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この作品は、NIHの助成金P01 AI 068730（SNC、NS）、NIHの助成金CA016520 / TAPITMAT（NS）、Claneil財団（NS）、および卵巣SPORE助成金からFCCCへの民間資金とペンシルベニア大学（によってサポートされていましたP50 CA83638）とフォックスチェイスがんセンターコアグラント（P30 CA06927）（DCC）。著者らは、ペンシルベニア癌の大学で博士G. Danet -デスノイヤーズ監督幹細胞および異種移植片のコアからペンシルベニア州、アンソニーSecretoの大学で博士EJ Delikatny監督光/生物発光の中核施設の優秀な技術支援に感謝手術を支援するためのペンシルベニア州/ OCRC大学の同所性の注入法とDenada DangajへのトレーニングSNCのためのセンター。

1。細胞の文化<ol><li>同所性注入の前に、T175フラスコにDR26腫瘍由来の培養MOV1 キャット細胞 、、彼らは90％コンフルエントになるまで。 1または2 T175フラスコを必要とする注射1〜5万セルを、使用する予定。 </li><li>注射の日に、細胞を収穫し、血球計算盤を用いて細胞数を決定します。 </li><li>一度細胞濃度は、室温で300 × gで5分間、遠心分離によって細胞がペレット、決定されている。 </li><li>スピンに続いて、0.002 M EDTAを滅菌PBSの10マイクロリットルで100万人を持っている細胞を再懸濁</li></ol> 2。手術前<ol><li>手術前に、PBS EDTAの10マイクロリットルで100万MOV1 - キャット細胞と3/10ccインスリン注射器をいっぱいに。 </li><li>加熱パッドにイソフルラン麻酔マウスを転送します。目の脱水を防ぐために、眼軟膏を追加。その後、すぐに手術中麻酔を提供するためにイソフルラン気化器に接続されたノーズコーンのシステムに動物の頭を挿入する。 </li><li>アルコール綿棒で注射部位の消毒した後、皮下3/10ccインスリン注射器で、ケトプロフェン、術前鎮痛剤の5 mg / kgを注入する。 </li><li>バリカンを使用して、動物の尾の基部に胸腰椎接合部から背側の左尾部を削る。完全に毛を除去する除毛クリームを適用します。その後、ぬれたペーパータオルで余分を削除してください。 </li><li>髪が削除されると、ポビドンヨードおよびアルコール綿棒で剃毛面積を滅菌する。その後、切開の周辺手術ドレープを置きます。 </li></ol> 3。手術<ol><li>ただ手術前に、1.5％イソフルレン気化器のレベルを調整します。 </li><li>動物の足のパッドをつまんで完全に麻酔していることを確認します。 </li><li>次に、皮膚の下に脾臓を見つけます。その後、外科はさみを使用すると、脾臓の右上に1〜2センチの背側切開を行います。 </li><li>後腹膜の解剖。マウスの卵巣を取り囲むパッドが観察されます。マウスの卵巣を取り囲む脂肪パッドを把握し、公開する湾曲鉗子を使用してください。 </li><li>滅菌PBSを数滴と水和物器官。 </li><li>位置...撤回、把握することが曲がったピンセットを使用して、...して、注射のため卵巣を確保する</li><li>しっかりと鉗子で卵巣をつかんで、卵巣にMOV1 キャット腫瘍細胞の10マイクロリットルを注入。しっかり理解し、流体逆流や漏れを防止します。 </li><li>すぐに注射後、鉗子によって発揮される張力を解放する。卵巣の穿孔は、自発的に撤回し、閉じる必要があります。 </li><li>針に接続されている吸収性ポリグリコール酸縫合糸を使用して、レトロ腹膜傷を閉じます。 </li><li>ノーズコーンから動物を離します。 </li><li>皮膚をストレッチし、組織接着剤を数滴で背傷のエッジを封印。 </li><li>最後に、経口で動物に抗生物質を100マイクロリットルを管理する。その後回復のためのケージやモニターでそれを取り付けなおします。一週間のために飲料水における抗生物質の動物を保管してください。 </li></ol> （4）in vivoイメージング <ol><li> MOV1 キャット腫瘍細胞の同所性注入後一週間は、in vivoイメージングで行います。イメージング室にイソフルラン麻酔マウスを転送することから始めます。 </li><li> 2％イソフルレン気化器のレベルを下げてください。 </li><li>イメージングシステムの製造元の指示に従ってin vivoイメージングで実行します。このビデオでは、ルミナのシステムが使用されます。 </li><li>画像に、リビングの画像ソフトウェアのデスクトップのアイコンをクリックします。その後、IVISの取得コントロールパネルで、"初期化"を選択します。本器の設定は、カメラの設定に類似しています</li><li>買収のコントロールパネルに、測定器の測定パラメータを設定します。蛍光については、"蛍光灯"をオンにします。各画像と写真を取得するために写真のボックスをクリックします。 </li><li>次に、Autoとして露光時間を設定します。 "ピクセルビニングまたはCCDの解像度"の下に、"ミディアム"をチェック。その後、F /停止や開口の下で、2の値を確認してください。次に、535励起フィルターおよびDsRed発光フィルターを選択します。 </li><li>視野の下に、画像の単一のマウスのためにビューBをクリックしてください。 </li><li>その後、画像取得を開始するために取得するをクリックしてください。 </li><li>画像の取り込みが完了すると、関心領域、またはROI、信号の測定するツールを使用してください。信号の値と領域を解放するために、測定のアイコンをクリックしてください。 </li><li>最後に、ユーザーのフォルダに画像を保存する"保存"をクリックしてください</li><li>画像が保存された後、イソフルランの投与を中止し、そのケージにマウスを返します。マウスはすぐに目を覚ます必要があります。 </li></ol> 5。代表的な結果 - 使用してこのプロトコルを、同所性卵巣癌のin vivo増殖非侵襲的な手順を使用して、少なくとも3週間は監視することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2146/2146fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ネガティブコントロールとしてMOV1 キャット細胞 、またはPBSは、同所。非腫瘍傾向のあるマウス（それぞれ右動物と左動物と）の卵巣に注入し、in vivoイメージングでは 2週間後に行われた。卵巣の生着MOV1 キャット細胞によって生成された蛍光発光を測定し、陰性対照マウスからのそれと比較した。 <img src="/files/ftp_upload/2146/2146fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。MOV1 キャットの卵巣腫瘍の凍結切片をモノクローナル抗体は、腫瘍浸潤リンパ球（黒い矢印）を検出するためのDAB基質（ダークブラウン）に続いてビオチン化抗- CD4で染色した。細胞は、細胞核（青）を可視化するためにメチルグリーンで対比染色した。腫瘍細胞は、（赤矢印）、T細胞からの形態学的に異なるいた。スライドは、40倍拡大表示されます。

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<li>Connolly, D. C., Hensley, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+and+Transgenic+Mouse+Models+of+Epithelial+Ovarian+Cancer+and+Non+Invasive+Imaging+Modalities+to+Monitor+Ovarian+Tumor+Growth+In+situ+-Applications+in+Evaluating+Novel+Therapeutic+Agents.+Current+Protocols+in+Pharmacology+45%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45.</a> , 1-36 Forthcoming.</li>
<li>Milne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+immune+infiltrates+in+high-grade+serous+ovarian+cancer+reveals+CD20%2C+FoxP3+and+TIA-1+as+positive+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors.</a> , (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

手術と同所注射卵巣嚢における同所性注入は、トレーニングと精度が要求されます。このように<ol><li>貧しい手術経験の場合、最初の死体との練習。 </li><li>彼らは未経産の雌と比較して注入し、増加の生存を容易に時間をかけて大きな卵巣を開発するように優先的に初産の女性を（1つまたは2つのリットル）を使用してください。 </li><li>マウス卵巣嚢の小さなサイズのため、可能な最小の針サイズの使用が強く推奨されています。 </li></ol> 生体内撮像<ol><li>例えばPBS 1mlの100μlに6月 10 日〜7月 10 日 MOV1 KAT細胞で満たさ1.5ミリリットルependorfチューブとして、蛍光の基準を常に使用します。 </li><li>蛍光バックグラウンドを減らすためにアルファルファを含まない食事で動物を餌。 </li><li>バックグラウンドを減らすためにin vivoイメージン...

<table><tbody><tr><td>DMEM-GLUTAMAX</td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>ヒートパッド</td><td>Deltaphase</td><td>39 DP</td><td></td></tr><tr><td>ポビドンパッド</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>アルコールパッド</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液軟膏</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>17845-153</td><td></td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3cc インスリン用注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>ポリグリコール酸縫合糸/針 (3/8 19mm)</td><td>Syneture</td><td>9612-31</td><td></td></tr><tr><td>組織接着剤</td><td>Vetbond</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Vet Bactrim/経口懸濁液</td><td>Hi-tech Pharmacal</td><td>840823</td><td></td></tr><tr><td>IVIS-Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>J108013</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (Qualified)</td><td>Invitrogen</td><td>10437036</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>TurboFP635 哺乳類用ベクター</td><td>Evrogen</td><td>FP721</td><td></td></tr><tr><td>T175 フラスコ</td><td>cellstar</td><td>660-190</td><td></td></tr></tbody></table>

のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

背景：卵巣がんは一般的にケース/致死率が高いため、米国の女性は1,2,3の間で、すべての婦人科悪性腫瘍の最も致命的なまま進行した段階で診断されます。漿液性腫瘍は卵巣癌の最も広く普及している形ですと4,5 TG - MISIIR - TAGトランスジェニックは、自発的に腫瘍のこのタイプを開発する唯一のマウスモデルを表しています。ミュラー阻害物質II型受容体（MISIIR）遺伝子のプロモーター6の制御下TG - MISIIR - TAGマウス急行SV40形質転換する地域。追加のトランスジェニック系統は、発現するSV40タグの導入遺伝子を同定されているが、卵巣腫瘍を発症しない。非腫瘍傾向のあるマウスは、C57BL / 6マウスの一般的な寿命を示し、肥沃です。これらのマウスは、TG - MISIIR - TAG - DR26マウスから単離した腫瘍細胞に対する同系移植のレシピエントとして使用することができます。 目的：腫瘍イメージングは7可能ですが、深い腫瘍の早期発見が小さい生きている動物に挑戦する。漿液性卵巣癌の免疫学的に無傷の動物モデルにおける前臨床試験を有効にするには、我々はin vivoイメージング、腫瘍微小環境と腫瘍免疫応答の研究で可能に卵巣癌のこのタイプの同系マウスモデルを説明します。 方法：我々は最初の26週齢のDR26 TG - MISIIR - TAGの女性で収穫された自発的な卵巣腫瘍からTAG +マウスの癌細胞株（MOV1を）派生。その後、我々は安定Katushka、635分の588 nmの8,9,10での励起/発光極大を持つイソギンチャクEntacmaea quadricolorから赤色蛍光タンパク質の遠赤変異体をコードTurboFP635レンチウイルス哺乳類ベクターとMOV1細胞を形質導入。我々は、同所の非腫瘍が発生しやすいTG - MISIIR - TAG雌マウスの卵巣11,12,13,14でMOV1 キャットを注入。腫瘍の進行は 、in vivo光イメージングおよび腫瘍微小環境で続いていた免疫組織化学により解析した。 結果：同所移植MOV1 キャット細胞は漿液性卵巣腫瘍を開発した。 MOV1 キャットの腫瘍は最大3週間注入後in vivoイメージングで可視化することができる（図1）とのようなヒト卵巣癌15（図2）で観察された白血球、で浸潤した。 結論：我々は、深部組織のKatushkaの高いpH安定性と光安定性のために早期の腫瘍のin vivoイメージングに適した卵巣癌の同所性モデルを記述する。我々は、腫瘍免疫応答と免疫療法のin vivoイメージングの研究とモニタリングのための漿液性卵巣癌のこの小説同系モデルの使用を提案する。

勉強する<em&gt; in vivoで</em&gt;腫瘍の増殖と腫瘍微小環境、我々は、免疫動物の卵巣癌の同系と同所性マウスモデルを使用。我々はKatushka蛍光タンパク質（MOV1でマウスの腫瘍細胞株（MOV1）を形質導入<sup&gt; KAT</sup&gt;）と、ここでは、卵巣での同所移植を示し、<em&gt; in vivoで</em&gt;イメージング。

背景：卵巣がんは一般的に進行した段階で診断されるため、致死率が高く、あらゆるがんの中で最も致死的なままである...

卵巣がんは一般的に進行した段階で診断されるため、致死率が高くなります。そのため、米国における女性の婦人用腫瘍の中で、卵巣がんは依然として最も致死率の高い悪性腫瘍となっています。本稿では、in vivoイメージングと腫瘍微小環境の研究の両方が可能な、漿液性卵巣がんの同系マウスモデルについて説明します。C nmy由来の蛍光タンパク質kakaを安定的に形質導入した、MIS two R tagトランスジェニックDR 26マウス由来の卵巣がん細胞株を用いました。MOV one catと名付けられたこれらの細胞を、非腫瘍好性のTG MIS two R tagトランスジェニックマウスの卵巣内に注入し、蛍光性の漿液性卵巣がんへと成長・進展させます。腫瘍の進行をモニタリングするために、in vivoイメージングを実施します。その後、卵巣を解剖し、腫瘍微小環境を調べるために免疫組織化学染色を行います。この動物モデルは、既存の遺伝子モデルと比較して主に3つの利点があります。第一に、マウスにヒトの漿液性卵巣がん（患者において最も頻度の高い組織学的型である）に類似した腫瘍が形成されることです。2つ目の腫瘍細胞は蛍光標識されています。これにより、生体内（in vivo）イメージングによって腫瘍の進行を追跡することができます。3つ目に、マウスは免疫能を有しているため、宿主白血球による腫瘍浸潤を研究することが可能です。以上の特性により、この動物モデルは前臨床研究に最適となりました。MUおよび抑制物質タイプ2受容体（tgm MIS S two R tag）の転写制御下でSB 40大腫瘍抗原を発現するトランスジェニックマウスは、Fox Chase Cancer CenterのConnelley博士とHamilton博士によって開発されました。雌のtgm IS two R tagマウスは、ヒトの漿液性卵巣癌に類似した両側性の上皮性卵巣癌を自然発症しました。IS two R プロモーターは、SV 40 T 抗原の発現を、卵巣を含む雌マウス生殖管の上皮に限定させます。外来遺伝子の発現は子宮および卵管でも検出されますが、腫瘍は卵巣にのみ発生します。TG MIS two R tag マウスの独立した系統が分離・同定されました。特異的な表現型を示すこれらのマウスは、transgeneの発現により、tgm IS two R tag DR 26 MICEにおいて形質転換が起こり、100%の浸透率で両側性卵巣腫瘍が形成されます。DR 26マウスの寿命は6ヶ月ですが、卵巣腫瘍の早期発現により不妊となります。SB 40タグトランスジェンを発現しているが、卵巣腫瘍を発現しない追加のトランスジェニック系統が同定されました。これらのマウスはC 57 black sixマウスに典型的な寿命を示し、生殖能を有しています。これ

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免疫学と感染症

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生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

このビデオでは、腫瘍の発生と腹膜転移を研究するためのマウス実験モデルを作成するためのプロトコルについて説明しています。この卵巣がんモデルは、ヒト上皮性卵巣がん細胞を雌マウスの卵巣に同所性接種することによって生成されます。...

マウス卵巣への卵巣癌細胞の同所性接種:細胞の腹膜播種を研究するための卵巣癌マウスモデルを確立する手順

卵巣癌の成長と再発の検出、定量化、モニタリングを可能にする非侵襲的な動物イメージングプラットフォームについて説明します。この腹腔内異種移植モデルは、卵巣がん患者の臨床プロファイルを模倣しています。...

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オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移<em&gt;経由で</em卵巣癌細胞で&gt;同所接種

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マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

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