イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで

本実験の目的は、細胞表面におけるタンパク質間相互作用の存在を評価することである。これは、関心のある2つの受容体を、放出スペクトルが重複する2つの蛍光タンパク質の末端にクローニングすることで達成される。受容体を発現させるため、これら2つのベクターを血管内皮細胞に同時にトランスフェクションする。

この時点で、蛍光色素を用いて発現の全体的な程度および受容体の局在を評価します。次に、共焦点顕微鏡を用いて、単一転写物をコントロールとしてイメージングパラメータを設定します。その後、受容体の発現レベルと局在に基づき、個々の転写細胞を選択します。

その後、これらの細胞内の領域をイメージングし、FRETの結果が得られた範囲を評価します。これにより、FRETおよび共焦点顕微鏡を用いて、血管内皮細胞表面におけるTie1およびTie2の相互作用が示されます。こんにちは、バージニア・コモンウェルス大学生化学・分子生物学部のWilliam Barton博士の研究室のTom Segerです。

本日は、FRETベースの共焦点顕微鏡を用いた血管内皮細胞におけるタンパク質間相互作用の評価手順について解説します。当研究室では、この手法を用いて血管新生時の受容体相互作用の研究を行っています。それでは始めましょう。

FRETベースの近接アッセイを用いてタンパク質間相互作用をイメージングするには、まず目的の受容体を、monomeric CFPまたはYFPを含むpCDA3.1 hydroまたはneoベクターのNhe IおよびEco R Iサイトにクローニングします。FRETの判定は経験的なものであり、膜貫通領域と蛍光タンパク質の開始点との間のリンカーの長さに決定的に依存します。したがって、調査対象となる各受容体ペアについて、さまざまな長さのリンカーを検討する必要があります。付属のプロトコルに従ってベクターを形質転換し、増幅させてください。

次に、付属のプロトコルに従ってトランスフェクショングレードのDNAを調製し、ベクターを形質転換および増幅させます。その後、トランスフェクショングレードのDNAを調製し、作業濃度が1 µg/µLになるように希釈します。組織培養フード内でトランスフェクションの準備を行うため、完全DMEMで培養したEAHY 92 6細胞を、2 mLの培地とともにカバースリップ付き35 mmディッシュに分割して播種します。個々の受容体の発現を評価するためのディッシュを1枚ずつ、および各受容体ペアにつき1枚のディッシュを用意します。

翌日、細胞を37°C、95%二酸化炭素雰囲気下でインキュベートします。トランスフェクション当日の培養細胞のコンフルエンシーは、約70〜90%である必要があります。2 µgのキメラ受容体ベクターDNAを8 µLのFuji N HDと、200 µLの予熱したOpti-MEMで混合し、核脂質複合体を調製します。受容体ペアをトランスフェクションする場合は、各受容体を1 µgずつ、計2 µg使用します。これを転倒混和により穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション期間中に、トランスフェクション用の細胞準備を行います。新鮮な培地を吸引し、2 mLの抗生物質を含まない加温済みの完全DMEMを加える前に、各プレートを温めたPBSで穏やかに短時間洗浄します。治療中の細胞にとってペニシリンおよびストレプトマイシンは毒性がかなり強いため、これらが含まれないようにすることが重要です。FU gene HD複合体を細胞に滴下し、さらに20〜24時間インキュベートします。24時間後、細胞から培地を慎重に吸引し、トランスフェクション後の新鮮な抗生物質含有完全DMEMをピペットで加えます。

細胞生存率は比較的高く維持されるべきです。浮遊細胞はほとんど、あるいは全く観察されないはずです。生細胞イメージングを行うために、青色ダイオードアルゴンおよび緑色、橙色、赤色のヘリウムネオンレーザーを備えたA-T-C-S-P two A OBS共焦点レーザ走査顕微鏡、H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NAグリセリン浸液対物レンズ、電動XYステージ、および温度、湿度、二酸化炭素を制御するステージインキュベーターを使用します。

放出チャネル間の蛍光クロストークを排除し、発現の問題や非特異的な蛍光標識を評価するためには、実験的コントロールが不可欠です。そのため、CFPとYFPの放出チャネル間のクロストークを排除するために、すべてのイメージングセッションのセットアップにおいて単一蛍光色転換体が利用されます。白色光を用いて、CFP発現コントロールをステージインキュベーター内に配置します。

Zプレートを調整して細胞に焦点を合わせます。CFPの放出検出用のSPウィンドウ設定を465〜505 nmに、YFPを525〜600 nmに設定し、両方の放出チャネルをモニタリングしながら、CFPを458 nmで励起させます。A OTFを用いてレーザー出力を調整し、CFPからYFP放出チャネルへの顕著なブリードオーバーを排除します。

この設定を保存します。514 nanometersの励起強度を調整することで、CFPチャンネルにおけるYFPクロストークについても同様のコントロールを行います。YFPのみを発現している細胞について、この設定を保存します。

次に、CFPとYFPを発現している細胞をステージインキュベーターに配置します。LICO共焦点ソフトウェアのシーケンス設定を使用します。ソフトウェアのアクセプター光退色プログラムを除き、LICOソフトウェアを用いて、適切な膜局在を示し、かつ同程度のレベルでCFPとYFPを発現している細胞を特定します。

ドナーおよびアクセプターの設定を、それぞれ保存済みのCFPおよびYFPの設定に設定します。細胞をズームし、細胞膜上でYFPの光破壊を行う関心領域（ROI）を指定して、アクセプターの光破壊プログラムを開始します。AOTFを514 nmの100%に調整し、YFPの放出が70%減少するまでレーザーブリーチングを継続させます。

漂白を加速させるため、通常、フォトブリーチング中はレーザーのラスタースキャン軸に沿ってROIを選択します。細胞の動きを監視し、XY平面で顕著な動きが認められた測定値は除外してください。これらの測定値は誤ったFRET効率を示す可能性があるため、ドナーとアクセプターの両方について漂白前後の画像を記録し、Dpost > Dpreとなるすべてのケースについて、FRET効率を（post - DLO）/ depostとして算出します。ここで、DpreおよびDpostは、それぞれフォトブリーチング前後のドナー強度です。

実験的なばらつきの程度を決定するためにJMPを使用します。個々の受容体は、異なる長さの膜近傍配列を介してCFPおよびYFPの両方に融合させる必要があります。最適な受容体FRETパートナーのペアを特定するため、他者の以前の知見にかかわらず、通常、トランスフェクション効率は30から40%の間になります。

あるベクターのトランスフェクションおよび発現が、もう一方のベクターの発現を促進させることは認められませんでした。実際、一方の蛍光タンパク質のみが排他的に発現することが頻繁に観察されます。これらの代表的な画像は、EAHY 9 26細胞においてCFPとYFPの間で発生したFRETのアクセプター光退色分析の結果を示しています。

光退色前後にCFPおよびYFPの放出チャネルを個別にモニタリングし、計算をその領域に限定した。赤枠内では、T受容体システムの方向確認用として提示したA-C-F-P-Y-F-Pマージ画像の拡大オーバーレイ上に、FRET効率を1.0（赤色）の高値から0（紫色）の低値までの絶対範囲で表示している。ここに示すように、典型的なFRET効率の値は、上皮細胞で20〜28%、血管内皮細胞で19〜23%である。

この手法を習得すれば、適切に実施した場合、通常3〜4日で完了します。この手順を行う際は、標的タンパク質と融合蛍光タンパク質との間のリンカー長、およびそれらの発現レベルと細胞内移動が、手法実施後のFRET測定に直接影響することを覚えておくことが重要です。さらに、構築後には、シグナル伝達経路に関する知見を得るために、シグナル活性化に関する生化学的アッセイを実施することが可能です。

この手法は、弱く、あるいは一過性のタンパク質間相互作用を研究するためのアッセイを提供します。このビデオを視聴することで、生細胞を用いたFRETベースの近接アッセイを自身で実施する方法について十分に理解できるはずです。また、組織培養細胞を扱う際は、常に適切な安全上の注意事項に従うことを忘れないでください。

ご視聴ありがとうございました。今後のFRET実験の成功をお祈りしております。