に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ

本実験の目的は、ショウジョウバエの自発的活動の概日リズムを測定することで、概日リズムおよび睡眠の表現型を特性評価することである。このため、トランスジェニックフライの作製、特定の変異体の入手、または実験動物を準備するために必要な交配を行う。次に、実験中のフライの飼育環境となる、餌を入れたガラス製活動チューブを準備する。

次に、羽化後1〜5日のハエを活動チューブに入れ、DAM活動モニターにロードして、自発的な運動活動リズムをモニタリングします。DAMシステムを用いて得られた結果を、FarwakeやInsomniacなどのソフトウェアで日次運動活動リズムの解析を行うことにより、概日リズムおよび睡眠パラメータにおける欠陥や変動を明らかにします。この手法は、どのようなタンパク質や調節機構が適切なリズムの生成に関与しているのか、あるいは光や温度などの環境要因がどのような特異的な分子経路を通じて行動リズムを調節しているのかといった、概日生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

自発運動量測定システムには、専用のモニタリング装置、昼夜の光制御が可能な環境インキュベーター、データ収集装置、コンピューター、および配線などの周辺材料など、多くの設備が含まれます。インキュベーターへの過剰な負荷を避け、温度維持に失敗する可能性をなくすため、自発運動量測定システムを設置する場所には、換気が良好で温度管理された暗室を選んでください。暗室は外部光源から遮断されている必要があります。ショウジョウバエの概日リズムシステムは赤外線に反応しないため、完全に暗闇の中で作業する必要はありません。

したがって、暗室内で視認する必要がある場合は、市販の赤色フィルターで覆った標準的な懐中電灯を使用します。また、活動モニタリングシステムの構成部品を動作させるのに十分なワット数容量を持つ、無停電電源装置（UPS）の緊急バックアップユニットを使用してください。建物内でサージ電圧が発生したり停電が起こったりした場合に備え、利用可能であればUPS緊急バックアップユニットを建物の緊急バックアップ回路に接続します。インキュベーター内の照明を制御するシステムがインキュベーターによって直接制御されていない場合は、インキュベーターをUPSなしで非常用電源に接続するだけで十分です。数秒間の停電ではチャンバー温度に影響はないためです。

次に、データ収集およびインキュベーターの制御専用のコンピューター（PCまたはMacintosh）を設置します。電話回線ネットワークを、環境制御インキュベーターの棚の周囲に、機器の接続および取り外しが容易になるよう手際よく配置します。モニターの複数の電話回線が1本のメインラインに集約され、インキュベーターの外に出してコンピューターに接続されるように設定します。インキュベーター内部のモニタリングデバイスを、電源供給インターフェースユニットを介してコンピューターに接続します。このユニットは、電話回線を通じてアクティビティモニターに電力を供給する役割を果たします。

最後に、電子機器のLEDや、密閉不十分なインキュベーターの扉などの光源を、ダクトテープや黒い布で遮光します。これは、不要な光がない状態でフリーランニングリズムを測定するためです。同一の環境条件下で飼育され、同齢である適切な対照動物を用いて、これらの表現型を評価することが極めて重要です。

さらに、概日リズムには性的二型が存在します。雌のハエでは産卵活動が自発活動の正確な測定に影響を与えるため、これらのアッセイでは通常、25 °Cで飼育された生後1日から5日の成端雄ハエを使用します。特定の目的の変異体ハエの概日リズムおよび睡眠・休息パラメータを調べる際は、変異体ストックを同じ遺伝的背景を持つ野生型系統と戻し交配させることが推奨されます。

例えば、W 1118やywなどが挙げられます。ショウジョウバエのオスでは組み換えが起こらないため、変異体のメスと野生型のオスを交配させて外交雑を行うのが望ましいです。野生型コントロールと変異体のハエを同時に播種してください。運動活性リズム実験を行う約10～14日前まで、標準的なショウジョウバエ飼料で飼育します。次世代が羽化した後、1～5日齢のオスのハエを収集し、実験に使用するために分けておきます。

活性チューブはショウジョウバエの生息環境を表します。実験で使用されるチューブは、直径5 mmの細いガラス管で、片端に餌が含まれ、もう一方の端が毛糸またはプラスチックプラグで塞がれています。新しく作成した活性チューブを使用することが推奨されます。

これらは通常、実験開始の数日前から1週間前に準備します。ガラス製の活性測定チューブは繰り返し再利用できるため、以下の準備手順では、既に使用済みで洗浄されていない活性測定チューブを起点として説明します。新品の活性測定チューブを使用する場合は、後述するチューブのオートクレーブ滅菌の工程までスキップしてください。

使用済みの活性化チューブからプラグを取り外し、大きなガラスビーカーに入れます。チューブがビーカーの半分までしか満たされないようにしてください。ビーカーに水道水を満たし、チューブが完全に浸かっていることを確認します。

ガラス管が入ったビーカーを、水が完全に激しく沸騰するまで電子レンジで加熱します。ワックスとアガー餌を溶かす際、水が高温であるため注意してください。ビーカーを電子レンジから取り出し、スパチュラまたはプラスチック製の棒でチューブをかき混ぜます。

10 millimeter ピペットを用いて、閉じ込められたワックスが上部に浮上するようにします。その後、電子レンジでの加熱ステップを繰り返します。ビーカーを電子レンジから取り出し、冷却されるまで待ちます。

ビーカーを低温室に入れることで、プロセスを早めることができます。水が冷えると、ワックスが水面に集まり、徐々に凝固します。凝固したワックスを手で取り除いてください。

これにより、チューブ上のワックスの大部分が除去されます。活性チューブを新しい水道水を入れたビーカーに移し、電子レンジ加熱とワックス除去の工程を繰り返します。前のステップでワックスの大部分が除去されているため、ワックスが凝固するまで待つ必要はありません。

ビーカーから水を捨て、チューブを新しいビーカーに移します。水がまだ熱いため、注意して操作してください。電子レンジでの加熱工程を最後にもう一度繰り返します。

ビーカーから水を捨て、アクティビティチューブを冷却させます。次に、アクティビティチューブを250 mLまたは500 mLのガラスビーカーに垂直に立てて入れます。この際、チューブを詰め込みすぎないように注意してください。

乾熱サイクル付きのオートクレーブで滅菌するか、あるいはチューブを乾燥機で乾燥させ、活性チューブに充填する培地を準備します。蒸留水または水道を用いて、5% sucroseおよび2% bact to agar溶液を作製し、オートクレーブで滅菌します。滅菌後の培地はすぐに使用するか、4 °Cで長期間保存することが可能です。

理想的には、活性化チューブに充填する餌の温度は約65 °Cであるべきです。10 mLピペットを使用して、ガラスビーカーの内壁に沿って液状の餌溶液を分注し、チューブの下端から3分の1まで満たします。ビーカーをゆっくりと軽く揺らし、すべてのチューブに餌溶液が均等に充填されていることを確認してください。

室温または4°Cで、餌が完全に凝固するまで待ちます。ガラス管内部の結露が消えたら、ビーカーから管を取り出すことができます。活性測定用の管をビーカーから取り出す際は、管をビーカーの底方向に押し込みながら同時にひねり、管内部で凝固した餌とビーカーの底を分離させます。

チューブをビーカーから取り出します。この際、できるだけまとめて取り出してください。次に、ペーパータオルを用いてチューブを一本ずつ拭き、チューブ外表面に付着した余分な餌を除去します。拭き取ったチューブは、清潔な容器に置いておきます。

チューブホルダーを取り外した汎用のラボ用ブロックヒーターを使用し、加熱ウェルを慎重に覆います。丈夫なアルミホイルを数層重ねて加熱ウェルの内側を覆い、そこにパラフィンペレットを入れて溶かします。チューブの非食品末端側を持ち、食品末端側を溶けたワックスに浸します。ワックス部分を冷水で満たしたガラスビーカーに浸し、ワックスの凝固を早めます。この操作を繰り返します。

ワックスチューブを一度水に浸すと、チューブ同士の癒着を防ぐことができます。チューブはすぐに使用することも、密閉容器に入れて4 °Cで保存して使用することも可能です。1週間を超えて長期保存すると、食品が過度に乾燥してしまいます。

チューブを4°Cで保存していた場合は、使用前にベンチトップに置いて室温まで温めてください。活性チューブにハエを導入する前に、アクティビティモニターを設置するインキュベーターの電源を入れます。インキュベーターの操作パネルで温度を調整し、実験デザインに応じて、DAMシステムのライトコントローラーまたはインキュベーター自体の光制御システムを用いて明暗サイクルを設定してください。

次に、二酸化炭素でショウジョウバエを麻酔させます。その後、細い絵筆を用いて、1匹のハエを活動チューブに慎重に移動させます。約0.5インチの毛糸1本の中心を精密ピンセットで掴み、活動チューブの餌のない側の端に毛糸を挿入して開口部を塞ぎ、実験中にハエが脱出するのを防ぎます。

チューブ内に空気が入るようにしながら、ハエが目覚めるまでチューブを横にしたまま保持します。ハエが餌に張り付くのを防ぐため、チューブをアクティビティモニターに挿入します。Tri Kinetics社製モニターのより小型で新しいモデルを使用する場合は、赤外線ビームがチューブの中心位置を通過するように、ゴムバンドでチューブを固定する必要があります。最後に、アクティビティモニターをインキュベーターに入れ、電話線経由でデータ収集システムに接続し、確認してください。

DAMシステムの収集ソフトウェアを使用して、すべてのモニターが正しく接続され、それぞれからデータが収集されていることを確認します。ショウジョウバエをアクティビティチューブに導入し、運動活性モニタリングシステムの準備が整えば、データの記録を開始できます。ショウジョウバエを、目的の明期、暗期、または明暗周期（LD）および温度条件下に2～5日間完全にさらすことで、同調および誘引させます。

最も一般的に用いられる同調条件は、25 °Cにおける12時間の明期と12時間の暗期からなる明暗サイクルです。本プロトコルに基づく概日リズムの研究では、インキュベーターの点灯時間をZT 0と定義し、その他の時間はすべてこの値を基準として設定します。標準的な12:12 LD条件下において、野生型のDrosophila melanogasterは通常、ZT 0を中心とする「モーニングピーク」と、ZT 12を中心とする「イブニングピーク」と呼ばれる2回の活動ピークを示します。フリーランニングの自発運動活動リズムは、同調期間後の恒常暗および恒温条件下で測定します。

光サイクルの設定は、LD（明暗サイクル）の最終日の暗相においていつでも変更可能であり、これにより実験の翌日がDD（恒暗条件）の1日目となります。ショウジョウバエの概日周期および振幅、またはリズムの強度を算出するには、7日間のDDデータ収集で十分です。一般的に、特定の遺伝子型について信頼性の高いフリーランニング周期を得るには、少なくとも16匹以上のサンプルサイズが必要です。

実験の終了後、DAMシステムソフトウェアを用いて収集した生のバイナリデータを、ポータブルデータストレージデバイス（例：USBメモリ）にダウンロードします。この生のバイナリデータはDAM file scan 1 0 2 xを用いて処理され、概日リズムパラメータを解析する場合は15分および30分のビンに、睡眠を解析する場合は1分から5分のビンに合算されます。

静止パラメータ。現在、ショウジョウバエにおける睡眠静止の標準的な定義は、5分間連続した不活動状態とされています。本プロトコルの完了後、同一のデータセットを用いて、実験群と対照群の動物における概日リズムパラメータおよび睡眠パラメータの比較を行うことができます。

LD（明暗周期）またはDD（常暗）条件下における、ショウジョウバエの1日あたりの運動活性または数日間の平均活性を示す誘導グラフは、fast x ophを用いて作成できます。melanogasterは通常、ZT 0を中心とする「モーニングピーク」と、ZT 12を中心とする「イブニングピーク」という2回の活性ピークを示します。これら2回の活性ピークは内因性時計によって制御されており、フリーランニング状態のDD条件下でも観察されます。これらの活性ピークのタイミングの変化は、誘導グラフで容易に観察でき、内因性時計の特性の変化を示唆している可能性があります。

時計機能が適切に働いていることを示すもう一つの特性は、LDサイクルにおいて、実際の暗期から明期、または明期から暗期への移行前に観察される、自発的な運動活性の先取り的な上昇です。この行動は野生型ショウジョウバエでは明確に観察されますが、per zero変異体では消失し、非周期的なリズムとなります。この変異体において、

LD条件下で観察される朝および夕方のピークは、明暗条件の急激な変化による単純な驚愕反応です。時計遺伝子を欠損したショウジョウバエは環境変化を予測せず、単にそれらに反応します。行動リズムの喪失はDD条件下でより顕著に現れ、per zero個体に見られるように、一般的に自発的運動活動の朝または夕方のピークが完全に消失します。

誘導グラフに加えて、自発的活動量データは、個々のハエまたはハエの遺伝子型ごとにダブルプロットグラムとして表現することもできます。ここでは、2日分のデータが各行に連続してプロットされますが、最終日のプロファイルが次の2日分の活動量を示す行の起点となります。例えば、ACTOグラムの1行目にはLD 1日目と2日目がプロットされます。次の行はLD 2日目の繰り返しから始まり、続いてLD 3日目がプロットされ、以降も同様に繰り返されます。

この形式に従い、実験期間全体の自発活動データがACTOグラムに示されています。レダクショングラフと比較したACTOグラムの利点の一つは、日々の活動リズムの周期性の変化が容易に観察できることです。また、レダクショングラフとACTOグラムの生成も行われます。

DD条件下で得られた自発運動量データをfar Xに送信し、さまざまなプログラムを用いて周期長を算出できます。その中には、5分間連続して活動がない状態と定義される睡眠や休息パラメータの解析に用いられるcycle Pなどが含まれます。また、MATLABベースのプログラムであるinsomniacを用いて、自発運動量アッセイから記録されたデータを解析し、複数の睡眠パラメータを検討することが可能です。これにより、1時間ごとや12時間ごとなど、異なる時間間隔におけるショウジョウバエの睡眠時間の割合を算出できます。

他に検討可能な一般的ないない睡眠パラメータには、睡眠の統合度を測定し、睡眠の質を示す平均休息期間（mean rest bout length）があります。もう一つは覚醒活動回数（wake activity count）で、これはハエが覚醒しているときの活動率を測定するものです。このパラメータは、睡眠や休息行動に真の影響を受けている個体と、疾患がある個体や過活動の個体とを区別するのに役立ちます。

例えば、単に病気であるハエは、活動性が低下するため、より多く睡眠をとっているように見える場合があります。これらのハエでは、対照群の個体と比較して覚醒時の活動量が低くなります。このビデオを視聴することで、アッセイを用いてショウジョウバエの概日リズムおよび睡眠表現型をどのように特性評価するかについて、十分な理解を得ることができます。自発的活動の概日リズム。