弁内皮細胞の単離

このビデオプロトコルでは、大動脈弁から常在性間質細胞および側特異的な内皮細胞を単離する方法を実演します。弁葉を心臓から採取し、冷生理食塩水に入れます。内皮層は、コラゲナーゼ溶液に浸した組織を綿棒で優しく擦ることで、弁葉の両側から除去できます。側特異的な単離を行う場合は、内皮表面が露出するように弁葉をパラフィンベッドにピンで固定します。

次に、冷やしたコラゲナーゼを数滴、心臓弁尖に添加し、5～10分間インキュベートします。コラゲナーゼによるインキュベーション後、組織を穏やかに剥離させることで、側面特異的な内皮層を除去します。その後、遊離した内皮細胞をスワブで回収し、洗浄して播種します。

その後、残りの葉末を一晩消化して間質細胞を単離し、回収して洗浄します。単離されたすべての細胞を培養することで、局所的な機械的および生物学的信号に応答した心臓弁の修復およびリモデリングにおけるこれらの細胞の役割を理解することができます。こんにちは、ラッセル・グールドです。

私は現在、コーネル大学の生物医学工学科にあるブッチャー研究室におります。本日は、心臓弁内皮細胞の単離方法をご紹介します。この手法は、常在する内皮細胞が機械的および生物学的信号に応じて、どのように絶えず修復と再構築を行うかを理解することに寄与します。

それでは、始めていきましょう。まず、地元の屠畜場から豚を調達し、無菌的に操作して大動脈根を摘出します。大動脈根に付着した血液を十分に洗い流してください。

冷たく滅菌したDPBSを用い、心臓弁内皮細胞（VEC）の死滅および細菌汚染を制限するため、可能な限り速やかにすべての血液成分を除去することが不可欠です。この段階では、細胞に有害となる可能性があるため、抗生物質および抗真菌剤の使用は推奨されません。次に、大動脈根から直接分離します。

各弁から弁葉を採取します。弁輪組織が混入すると細胞集団が汚染されるため、弁葉の分離は慎重に行ってください。分離した弁葉を、冷えたDPBS 12 mLが入った滅菌済みの15 mLコニカルチューブに入れます。

数回振盪してデブリを除去し、新鮮なDPBSで満たします。最後に、弁尖を氷上で研究室まで運搬します。研究室に到着後、組織の入った容器を滅菌フード内に置き、内皮層の単離を進めます。また、鋸歯付き組織鉗子、組織鋏、および綿棒をカバー付き器具トレーに入れ、オートクレーブで滅菌します。

また、付属の書面プロトコルに従い、滅菌したコラゲナーゼ溶液、内皮細胞用培地、および間質細胞用培地を準備します。滅菌済みの35 mmディッシュに、弁1枚あたり3 mLの冷えたコラゲナーゼ溶液を満たし、15 mLチューブに入っている3枚すべてのリーフレットをディッシュに移します。

組織を37 °Cで5〜10分間インキュベートします。次に、乾燥した滅菌綿棒を表面で回転させ、リーフレットの両側から内皮層を慎重に除去します。回転方向と適用するせん断力は、サンプルの純度に極めて重要です。

綿棒の回転方向は、綿棒を持つ手の直線的な動きとは逆方向にします。これにより、組織から内皮細胞を剥離させるための制御された剪断力が生じます。加える力は、組織の抵抗を感じる程度にし、基底膜を貫通させないようにしてください。また、綿棒を時々コラゲナーゼ溶液に浸し、先端の繊維から細胞を遊離させてください。

スワッピングが完了した後、内皮層の質感は以前よりもわずかに滑らかに感じられるはずです。コラゲナーゼ溶液に懸濁した細胞を回収し、新しい滅菌済みの15 mLチューブに移します。内皮細胞をリーフレットからスワッピングで除去した後、間質細胞の単離のために、リーフレットを10 mLのコラゲナーゼ溶液が入った15 mLチューブに直ちに投入します。

チューブを室温で1000 RPMで5分間遠心分離して単離細胞をペレット化し、上清を吸引します。15 mLチューブに内皮細胞培地を3 mL加えます。前述と同様に2回目を遠心分離し、培地を吸引します。

この2回目の遠心分離により、チップの繊維などの不要な物質の一部を除去できます。遠心分離した血管内皮細胞を5 mLの血管内皮細胞用培地で再懸濁し、コラーゲンで事前コーティングしたT 25フラスコに播種します。遠心管1本につきフラスコ1本を使用し、血管内皮細胞用培地を交換するまで、少なくとも2〜3日間細胞を培養します。

これにより、細胞の回復と分裂が促進されます。単離プロセスはかなり過酷であり、細胞収率が低くなる可能性があるため、細胞がコンフルエンスに近づいたタイミングで継代させることが極めて重要です。接触阻止によって細胞形質転換が起こる可能性があるため、血管内皮細胞は特定の部位から単離することでも対応可能です。

そのために、まずパラフィン層を形成したペトリ皿を準備します。60 mmのガラス製ペトリ皿とアルミホイルを用意してください。小葉1枚あたり2枚のガラス皿を計算して準備します。

アルミホイルを使用することで、ペトリ皿を再利用するためのパラフィン除去が容易になります。次に、ペトリ皿の約半分までパラフィンビーズを入れ、蓋をしてオートクレーブにかけます。オートクレーブが完了し、パラフィンが融解したら、ペトリ皿一式を平らで涼しい場所に移動させてください。

パラフィンが冷えると硬化し、針の刺入を支持する層が形成されます。60分後、滅菌済みのディッシュを弁尖組織の固定に使用できます。15 milliliterチューブから分離した弁尖を取り出し、パラフィンのベッド上に配置します。

弁尖を操作し、心室側をパラフィン表面に向けて下に向け、線維化側を露出させます。弁尖の端をピンで固定し、内皮層を露出させます。次に、上を向いている各内皮表面に冷えたコラゲナーゼを数滴滴下し、組織を37 °Cで5〜10分間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、前回と同様に、乾いた滅菌綿棒をリーフレットの表面で回転させて、内皮層を穏やかに除去します。時折、綿棒をコラゲナーゼ溶液に浸し、先端の繊維から細胞を脱落させます。スワブ操作が完了した後、内皮層の質感は以前よりもわずかに滑らかに感じられるはずです。

細胞懸濁液を回収し、新しい滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。ラベルに側性の特定を記載してください。同一のバルブから得られた葉片はまとめて回収することが可能です。固定化したバルブを少量の冷DPBSでリンスし、残存している細胞やデブリを洗浄します。

リーフレットを新しい培養皿に移し、心室側を上に向けて配置して、示した通りに内皮細胞を採取します。Gリーフレットからの内皮細胞のスワブ採取が完了したら、直ちにリーフレットを10 mLのコラゲナーゼ溶液が入った15 mLチューブに入れます。細胞を洗浄して再懸濁し、内皮細胞の非部位特異的単離の手順に従って培養します。

細胞収量が非常に低い場合は、より小さなフラスコへの変更またはウェルプレートの使用を検討してください。細胞接着は細胞増殖を促進するため、コンフルエンスに近い状態で細胞を継代させるようにしてください。接触阻止は細胞形質転換を引き起こす可能性があるため、内皮細胞を遠心分離しながら間質細胞の単離を開始し、弁尖を入れたチューブを約12〜18時間インキュベートします。

必要に応じて緩やかに撹拌しながら、コラゲナーゼ溶液に入れます。インキュベーション期間の終了後、セロロジカルピペットを使用して、細胞懸濁液が均質になるまで消化組織を緩やかに混合します。この均質化により、組織が崩壊し、間質細胞が放出されます。内皮細胞の手順と同様に、細胞を遠心分離し、洗浄します。

5 mLの間質培地で再懸濁する代わりに、遠心分離した間質細胞を15 mLの間質培地に懸濁し、遠心分離チューブ1本につき1枚のT 75フラスコを用いて細胞を播種します。間質培地を交換する前に、少なくとも1〜2日間細胞を培養してください。なお、内皮細胞よりも多くの組織片が含まれることが予想されます。また、間質細胞は本来、内皮細胞よりも早くコンフルエンスに達し、これらの代表画像に示されているように、より高い細胞回収率が得られます。

培養されたV Cs心臓弁内皮細胞と、それに対する心臓弁間質細胞の形態を2〜3日後に示します。Becsは、細胞が石畳状のパターンを呈し、クラスターを形成し始めるという、典型的な内皮細胞の形態を示します。

VS.Exhibitの形態は筋線維芽細胞に類似しており、コンフルエントにまで培養した際に細胞は概して紡錘形で疎に分布しています。ECSは典型的な内皮細胞の形態を示し、細胞は敷石状のパターンを形成し、増殖は接触抑制されます。VI CSは筋線維芽細胞に類似した形態を示し、細胞は概して紡錘形で接触抑制されません。VECとVICの両方の機能的特性は、染色の結果から推測できます。標識LDLの取り込みについて。

VEC細胞は、高いレベルのアセチル化LDL取り込みを伴います。一方でVIC細胞は、低いレベルのアセチル化LDL取り込みを伴いますが、ここではVECおよびVICの細胞マーカーを示しています。VECはvon Willebrand factorに対して陽性に染色されますが、VICは...

フォン・ヴィレブランド因子の染色は認められません。さらに、V CS染色はα平滑筋アクチンに対して陰性である一方、V CS染色はα平滑筋アクチンに対して陽性です。さて、本日の分離操作から多くのことを学んでいただけたかと思います。

ただし、内皮細胞の基底膜は非常に脆弱であり、下層のマトリックスに乱れが生じると、組織の他の部分から不純な細胞が遊離することが多い点に注意してください。分離が成功したかを確認するには、分離した細胞の純度を評価する特性解析が極めて重要になります。それでは、頑張ってください。