Name: 弁内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶ 大動脈弁から弁内皮細胞を単離培養する方法。コラゲナーゼ溶液と綿棒を用いて内皮層を剥離し、側面特異的な細胞収集が可能です。心血管研究や細胞生物学の応用に役立ちます。

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この研究は、NSFのキャリア賞、ハートウェル財団、米国心臓協会（＃0830384N）によってサポートされています。

1。準備<ol><li>対象となる機器のトレイに以下の項目をオートクレーブ： <ol><li>鋸歯状の組織鉗子 - リーフレットの組織の処理について</li><li>組織のはさみ（8センチ） - リーフレットの組織と尖をトリミングする</li><li>綿棒 - リーフレットまたはカスプから内皮層を分離するための</li></ol></li><li>無菌コラゲナーゼ溶液を作る<ol><li> 18MΩ250mlの水に粉末DMEMの4.0グラムを追加。 </li><li>重炭酸ナトリウムの1.11グラムを追加。 </li><li> （600 U / mL）をコラゲナーゼの18万台を追加。 </li><li> 1％（3ML）ペニシリン/ストレプトマイシンを追加。 </li><li> 7.2〜溶液のpHを調整します。 </li><li> 270 mLに解決策を持ち出す。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通過することで解決策を滅菌する。 </li><li>滅菌ウシ胎児血清の10％（30ml）を追加。 </li></ol></li><li>滅菌内皮細胞の培地を作る<ol><li> 18MΩ水400mlに粉DMEMの6.7グラムを追加します。 </li><li>重炭酸ナトリウムの1.85グラムを追加。 </li><li> （50 U / mL）をヘパリンの25,000台を追加。 </li><li> 1％（5ml）をペニシリン/ストレプトマイシンを追加。 </li><li> 7.2〜溶液のpHを調整します。 </li><li> 450ml中に解決策を持ち出す。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通過することで解決策を滅菌する。 </li><li>滅菌ウシ胎児血清10％（50mLの）を追加します。 </li></ol></li><li>無菌の間質細胞の培地を作る<ol><li> 18MΩ水800mlに粉DMEMの13.37グラムを追加。 </li><li>重炭酸ナトリウムの3.7グラムを追加。 </li><li> 1％（10ml）をペニシリン/ストレプトマイシンを追加。 </li><li> 7.2〜溶液のpHを調整します。 </li><li> 900mLのためのソリューションを立ち上げます。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通過することで解決策を滅菌する。 </li><li>滅菌ウシ血清の10％（100mLの）を追加します。 </li></ol></li></ol> 2。心臓弁尖の分離<ol><li>消費税​​の犠牲の後に心臓から直ちに無菌的大動脈根。 </li><li>徹底的に冷滅菌DPBSで血液の大動脈根を洗う。それは、VECの死と細菌汚染を制限するために、できるだけ早くすべての血液成分を除去することが不可欠です。彼らはVECに潜在的に有害であるため、抗生物質と抗真菌薬は、この段階でお勧めされていません。 </li><li> 12 mLの冷DPBSで満たされた無菌の15 mLコニカルチューブのルートと場所から直接（3バルブあたり）弁尖を分離します。新鮮なDPBSで破片とリフィルを削除するには、数回振る。 </li><li>氷の上で研究室に戻って輸送する。 </li><li>実験室に到着すると、無菌フードの下で組織を持つコンテナを配置します。 </li></ol> 3。内皮層の分離<ol><li>バルブごとに寒さコラゲナーゼ溶液（3リーフレット）の3mlの滅菌35mmディッシュを埋める。 </li><li>コラゲナーゼ溶液で満たされた皿に15 mLの試験管からすべての3つのリーフレットを置きます。 </li><li> 37℃で5〜10分間組織をインキュベート℃に</li><li>ゆっくりとリーフレットの表面に乾いた滅菌綿棒を回転させることにより内皮層を取り除く。せん断応用の回転と量の方向は、試料の純度が非常に重要です。綿棒の回転が制御されたせん断を作成するあなたの手の直線運動に反対方向にする必要があります。このせん断は、組織から内皮細胞を持ち上げるものです。力の適用量は、組織の抵抗を感じるのですが、基底膜を貫通しないように十分なはずです。 </li><li>時折、軽く先端繊維から細胞を取り除くために、コラゲナーゼ溶液内に綿棒。スワブが完了すると、内皮層の質感は以前より少しスムーズに感じるはず。 </li><li>細胞懸濁液/コラゲナーゼを収集し、新しい滅菌15mlのチューブに移す。 </li><li>ペレットへ5分の任意の単離された細胞を1000 rpmでチューブを遠心し、上清を吸引除去する。同様に間質細胞を単離する場合、これらの細胞を遠心分離されている間に、そのプロトコルを実行します。 </li><li> 、15 mLの試験管に内皮ブタの培地3 mlを添加し、もう一度遠心し、吸引メディア。この第二の遠心分離は、そのような先端繊維などの不要な物質のいくつかをフィルタするのに役立ちます。 </li><li>コラーゲンをプレコートT - 25フラスコ（遠心分離管あたり1フラスコを使用）で内皮ブタの培地とプレートの細胞を5mLで遠心分離した内皮細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞は内皮培地を変更する前に、少なくとも2〜3日に成長しましょう​​。これは、細胞が回復し、分離プロセスはかなり厳しいですし、細胞の収率が低くなる可能性があるので分割するのに役立ちます。接触阻害が細胞形質転換につながる可能性があるので、それは合流の近くに継代細胞にとって非常に重要です。 </li></ol> 4。サイド特定のアイソレーション用の60 mmの培養皿の準備<ol><li>アルミ箔（leafleあたり2ガラスの皿とライン60 mmのガラスシャーレをt）を。アルミ箔は、ガラスシャーレのが、他のアイソレーションのために再利用できるように、パラフィンを除去するのに役立ちます。 </li><li>半分程度、料理中にパラフィンのビーズを配置し、オートクレーブ用カバー。 </li><li>オートクレーブが完了するとパラフィンは溶融になると、クールな平らな面に皿のアンサンブルを移動する。パラフィンは冷えると、それは硬くなりますし、針穿刺をサポートするレイヤーを作成します。 </li><li> 30分後、滅菌シャーレは、リーフレットの組織を固定するために隔離室として使用することができます。 </li></ol> 5。サイド特定の内皮層の分離<ol><li>側の特定の分離のための準備60ミリメートル培養皿上で15mlのチューブと場所からチラシを取り外します。 </li><li> ventricularis側が露出線維の側を離れるパラフィンの表面上に下向きになるようにリーフレットを操作する。内皮層を露出するリーフレットの端を固定。 </li><li>各（上向きに面した）内皮表面に冷たいコラゲナーゼの数滴を置き、37℃で5〜10分のための組織をインキュベート℃を</li><li>前と同じように、静かにリーフレットの表面に乾いた滅菌綿棒を回転させることで内皮層を取り除く。せん断応用の回転と量の方向は、試料の純度が非常に重要です。綿棒の回転が制御されたせん断を作成するあなたの手の直線運動に反対方向にする必要があります。このせん断は、組織と他には何から内皮細胞を持ち上げるものです。力の適用量は、組織の抵抗を感じるのではなく、組織内に浸透していない十分なはずです。 </li><li>時折、軽く先端繊維から細胞を取り除くために、コラゲナーゼ溶液内に綿棒。スワブが完了すると、内皮層の質感は以前より少しスムーズに感じるはず。 </li><li>細胞懸濁液/コラゲナーゼを収集し、新しい滅菌15mlのチューブに移す。ラベルのサイド特異性を示している（同じバルブからチラシを一緒にプールすることができます）。 </li><li> ventricularis側は現在公開され、繰り返し行ってください（5.3から5.6まで）されるように、新しい培養皿にリーフレットを転送する。 </li><li>一度にすべての細胞懸濁液/コラゲナーゼが収集され、任意の単離された細胞ペレットに5分間、1000 rpmでチューブを遠心し、上清を吸引除去する。同様に間質細胞を単離する場合、これらの細胞を遠心分離されている間に、そのプロトコルを実行します。 </li><li> 、チューブに内皮ブタの培地3 mlを添加し、もう一度遠心し、培地を吸引除去する。この第二の遠心分離は、そのような先端繊維などの不要な物質のいくつかをフィルタするのに役立ちます。 </li><li>コラージュをプレコートT - 25フラスコ（遠心分離管あたり1フラスコを使用）で内皮ブタの培地とプレートの細胞を5mLで遠心分離した内皮細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞は内皮培地を変更する前に、少なくとも2〜3日に成長しましょう​​。これは、細胞が回復し、分離プロセスはかなり厳しいですので、分割するのに役立ちます。あなたが収率が極めて低いことに気付いた場合、細胞間接着は、細胞増殖を促進するので、小さなフラスコやプレートに移行することを検討。接触阻害が細胞形質転換につながる可能性があるため合流点近くに通過することを忘れないでください。 </li></ol> 6。間質細胞の単離<ol><li>バルブあたりのコラゲナーゼ溶液（3リーフレット）10mLで滅菌15 ml遠心チューブを埋める。 </li><li>内皮細胞のリーフレットを拭き取り後、すぐにコラゲナーゼ溶液を用いて適切な15mlのチューブに配置します。 </li><li> （必要に応じて軽く攪拌）約12〜18時間インキュベートする。 </li><li>細胞懸濁液/コラゲナーゼが均質化になるまで血清ピペットで軽く劣化した組織を混在させる。この均質化は、組織を分割し、間質細​​胞を放出するのに役立ちます。 </li><li> 1000 rpmで5分間消化組織を遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li> 15mlの試験管に5 mLの間ブタの培地を追加し、もう一度遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li>間質ブタ媒体と板T - 75フラスコ中の細胞（遠心分離管あたり1フラスコを使用する）5mLに遠心分離した内皮細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞が間質細胞の培地を変更する前に少なくとも1〜2日に成長しましょう​​。期待されている内皮細胞が、よりもはるかに組織破片が存在します。細胞はまた、より高速なので、細胞収量とその性質の内皮細胞よりも合流して成長してください。 </li></ol> 7。代表的な画像<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 2〜3日の後の分離で単離された細胞の形態。 （A）VECは、典型的な内皮細胞形態とフォームの成長を促進するためのクラスタを示す。 （B）VICの形態は、一般に紡錘形、フラスコ全体に均等に分散している筋線維芽細胞に似ています。 図2。コンフルエントで単離された細胞の形態。 （A）VECは、一般的に石畳と成長の接触禁止されている典型的な内皮細胞形態を示す。 （B）VICの形態は、一般に紡錘形としない成長の接触禁止されている筋線維芽細胞に似ています。 <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。単離された細胞の機能特性6。 （）VECは、アセチル化LDLの取り込みの高いレベル（赤）に関連付けられています。 （B）VICは、アセチル化LDLの取り込みの低レベルに関連付けられています。 <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。単離された細胞の細胞マーカー6。 （A）VECの表現型は、von Willebrand因子（緑）、青（核）のための陽性染色に貢献しています。 （B）VICの表現型は、von Willebrand因子の負の染色に貢献しています。 <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。単離された細胞の細胞マーカー。 （A）VECの表現型は、αSMA（緑）、青（核）のためのネガティブ染色に貢献しています。 （B）VICの表現型は、アルファSMA陽性の染色に貢献しています。 <table border="1"><tbody><tr><td> 解離エージェント </td><td> 解離テクニック </td><td> 細胞コレクション </td><td> セルの数量 </td><td> セル 純度 </td><td> 汚染 </td></tr><tr><td>のCaCl 2のないEDTA（3MM） </td><td> 5、20、60分。 CaCl 2の添加前に</td><td> 20、60、120分。コレクションの前に</td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td>のCaCl 2のないEDTA（6MM） </td><td> 5、20、60分。 CaCl 2の添加前に</td><td> 20、60、120分。コレクションの前に</td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA（0.5グラム/ L） </td><td> 5、10、15分。 非活性化の前に</td><td>培地は、直ちに収集</td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td>コラゲナーゼII（300 U / mL）を</td><td> 5、10、15分。 非活性化の前に</td><td>培地は、直ちに収集</td><td> - 、+、+ + </td><td> - 、+ +、+ </td><td> + </td></tr><tr><td>コラゲナーゼII（600 U / mL）を</td><td> 5、10、15分。 非活性化の前に</td><td>培地は、直ちに収集</td><td> +、+ +、+ + + </td><td> + +、+ +、 - </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表1。予備弁膜内皮細胞の分離プロトコルの結果。

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

弁膜生物学の理解は、弁内皮細胞の純粋な集団を分離して培養する技術的な問題によって損なわれている。典型的な分離方法は、基礎となる基礎行列または内皮接着剤の結合2,3の化学的解離の酵素消化を伴う。予備分離実験を定性的に解離剤と潜伏期間を変化させることによって評価した。これらの実験の結果は、最大60分の場合とEDTA（またはトリプシン- EDTA）インキュベーションが外れセルで失敗したことを示した。しかし、5〜10分間collagenseの消化は、純粋な弁内皮細胞（表1）の使用可能な数を取得するための効果を発揮。他の酵素液は、ディスパーゼ、特に基本的なマトリックス4の主な成分であるコラーゲンタイプIV、フィブロネクチンを標的とすることができるメタロプロテアーゼとの補完として提案されている。遊離した細胞は、クローン性増殖や磁気の選択方法5のような追加の処理によって精製することができる。 最近の証拠は、大動脈弁は、細胞の表現型を評価する際の困難につながる可能性があります細胞型の非常に不均質な分布が含まれていることを示唆している...

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium）</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ Type 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>ラット尾コラーゲン</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>クリティカルスワブ</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>重曹（炭酸水素ナトリウム）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>T25フラスコ</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm ディッシュ</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>60x15 ガラスディッシュ</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン埋め込み用ワックス</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>Precision Glide ニードル</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Nalgene フィルター</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>1L Nalgene フィルター</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>組織鑷子（組織ピンセット）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>FSCピンセット #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

弁内皮細胞の単離

Isolation of Valvular Endothelial Cells

心臓弁は、心臓血管系を介して単方向の血流を維持する責任を持つことになります。彼らは寿命にわたって数十億回も開いたり閉じたりするように、これらの薄い、繊維状の組織が重要な機械的ストレスにさらされる。これらの組織の驚くべき耐久性は、内皮常駐弁膜（VEC）と間質細胞によるものである（VIC）は、常に地元の機械的および生物学的信号に応答して、修理および改造。ごく最近我々 は in vitro の実験において重要な役割を果たしているため、これらの細胞のユニークな行動を、理解し始めている。特に困難は、VECの分離と文化です。特別な注意を払ってその組織が、最終的なメッキを介してホストから削除された瞬間から使用する必要があります。ここでは直接分離、側面の特定のアイソレーション、文化、およびVECの純粋な集団の検証のためのプロトコルを提示する。我々は表面の細胞を取り除くために穏やかな綿棒スクレイピング技術に続いて酵素消化を使用してください。これらの細胞をチューブに回収し、ペレットに遠心分離されています。ペレットを再懸濁し、コラーゲンI、マトリックスをプレコート培養フラスコに播種しています。 VECの表現型は、接触によって確認され成長し、血管内皮特異的などPECAM1（CD31）のようなマーカー、フォンヴィレブランド因子（vWF）、及びα-平滑筋アクチン（α- SMA）の負の発現の発現を阻害した。 VECの機能的特性は、アセチル化LDLの高レベルに関連付けられています。血管内皮細胞とは異なり、VECは通常、胚弁形成1の間に発生する間充織、に変換するユニークな能力を持っている。これはまた、in vitro培養における有意に延長後の合流時に発生する可能性がありますので、注意が合流点付近で通過するためになされるべきである。 VECの単離後、VICの純粋な集団は、簡単に取得することができます。

我々は、心臓弁内皮細胞（VEC）の純粋な集団を分離して培養する方法を提供する。 VECがカスプやリーフレットのいずれかの側から分離し、直ちに以下のことができる、基本的な間質細胞（VIC）の分離は簡単です。

心臓弁は、心血管系における血流の一方向性を維持する唯一の役割を担っています。これらの薄い線維組織は…

このビデオプロトコルでは、大動脈弁から常在性間質細胞および側特異的な内皮細胞を単離する方法を実演します。弁葉を心臓から採取し、冷生理食塩水に入れます。内皮層は、コラゲナーゼ溶液に浸した組織を綿棒で優しく擦ることで、弁葉の両側から除去できます。側特異的な単離を行う場合は、内皮表面が露出するように弁葉をパラフィンベッドにピンで固定します。次に、冷やしたコラゲナーゼを数滴、心臓弁尖に添加し、5～10分間インキュベートします。コラゲナーゼによるインキュベーション後、組織を穏やかに剥離させることで、側面特異的な内皮層を除去します。その後、遊離した内皮細胞をスワブで回収し、洗浄して播種します。その後、残りの葉末を一晩消化して間質細胞を単離し、回収して洗浄します。単離されたすべての細胞を培養することで、局所的な機械的および生物学的信号に応答した心臓弁の修復およびリモデリングにおけるこれらの細胞の役割を理解することができます。こんにちは、ラッセル・グールドです。私は現在、コーネル大学の生物医学工学科にあるブッチャー研究室におります。本日は、心臓弁内皮細胞の単離方法をご紹介します。この手法は、常在する内皮細胞が機械的および生物学的信号に応じて、どのように絶えず修復と再構築を行うかを理解することに寄与します。それでは、始めていきましょう。まず、地元の屠畜場から豚を調達し、無菌的に操作して大動脈根を摘出します。大動脈根に付着した血液を十分に洗い流してください。冷たく滅菌したDPBSを用い、心臓弁内皮細胞（VEC）の死滅および細菌汚染を制限するため、可能な限り速やかにすべての血液成分を除去することが不可欠です。この段階では、細胞に有害となる可能性があるため、抗生物質および抗真菌剤の使用は推奨されません。次に、大動脈根から直接分離します。各弁から弁葉を採取します。弁輪組織が混入すると細胞集団が汚染されるため、弁葉の分離は慎重に行ってください。分離した弁葉を、冷えたDPBS 12 mLが入った滅菌済みの15 mLコニカルチューブに入れます。数回振盪してデブリを除去し、新鮮なDPBSで満たします。最後に、弁尖を氷上で研究室まで運搬します。研究室に到着後、組織の入った容器を滅菌フード内に置き、内皮層の単離を進めます。また、鋸歯付き組織鉗子、組織鋏、および綿棒をカバー付き器具トレーに入れ、オートクレーブで滅菌します。また、付属の書面プロトコルに従い、滅菌したコラゲナーゼ溶液、内皮細胞用培地、および間質細胞用培地を準備します。滅菌済みの35 mmディッシュに、弁1枚あたり3 mLの冷えたコラゲナーゼ溶液を満たし、15 mLチューブに入っている3枚すべてのリーフレットをディッシュに移します。組織を37 °Cで5〜10分間インキュベートします。次に、乾燥した滅菌綿棒を表面で回転させ、リーフレットの両側から内皮層を慎重に除去します。回転方向と適用するせん断力は、サンプルの純度に極めて重要です。綿棒の回転方向は、綿棒を持つ手の直線的な動きとは逆方向にします。これにより、組織から内皮細胞を剥離させるための制御された剪断力が生じます。加える力は、組織の抵抗を感じる程度にし、基底膜を貫通させないようにしてください。また、綿棒を時々コラゲナーゼ溶液に浸し、先端の繊維から細胞を遊離させてください。スワッピングが完了した後、内皮層の質感は以前よりもわずかに滑らかに感じられるはずです。コラゲナーゼ溶液に懸濁した細胞を回収し、新しい滅菌済みの15 mLチューブに移します。内皮細胞をリーフレットからスワッピングで除去した後、間質細胞の単離のために、リーフレットを10 mLのコラゲナーゼ溶液が入った15 mLチューブに直ちに投入します。チューブを室温で1000 RPMで5分間遠心分離して単離細胞をペレット化し、上清を吸引します。15 mLチューブに内皮細胞培地を3 mL加えます。前述と同様に2回目を遠心分離し、培地を吸引します。この2回目の遠心分離により、チップの繊維などの不要な物質の一部を除去できます。遠心分離した血管内皮細胞を5 mLの血管内皮細胞用培地で再懸濁し、コラーゲンで事前コーティングしたT 25フラスコに播種します。遠心管1本につきフラスコ1本を使用し、血管内皮細胞用培地を交換するまで、少なくとも2〜3日間細胞を培養します。これにより、細胞の回復と分裂が促進されます。単離プロセスはかなり過酷であり、細胞収率が低くなる可能性があるため、細胞がコンフルエンスに近づいたタイミングで継代させることが極めて重要です。接触阻止によって細胞形質転換が起こる可能性があるため、血管内皮細胞は特定の部位から単離することでも対応可能です。そのために、まずパラフィン層を形成したペトリ皿を準備します。60 mmのガラス製ペトリ皿とアルミホイルを用意してください。小葉1枚あたり2枚のガラス皿を計算して準備します。アルミホイルを使用することで、ペトリ皿を再利用するためのパラフィン除去が容易になります。次に、ペトリ皿の約半分までパラフィンビーズを入れ、蓋をしてオートクレーブにかけます。オートクレーブが完了し、パラフィンが融解したら、ペトリ皿一式を平らで涼しい場所に移動させてください。パラフィンが冷えると硬化し、針の刺入を支持する層が形成されます。60分後、滅菌済みのディッシュを弁尖組織の固定に使用できます。15 milliliterチューブから分離した弁尖を取り出し、パラフィンのベッド上に配置します。弁尖を操作し、心室側をパラフィン表面に向けて下に向け、線維化側を露出させます。弁尖の端をピンで固定し、内皮層を露出させます。次に、上を向いている各内皮表面に冷えたコラゲナーゼを数滴滴下し、組織を37 °Cで5〜10分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、前回と同様に、乾いた滅菌綿棒をリーフレットの表面で回転させて、内皮層を穏やかに除去します。時折、綿棒をコラゲナーゼ溶液に浸し、先端の繊維から細胞を脱落させます。スワブ操作が完了した後、内皮層の質感は以前よりもわずかに滑らかに感じられるはずです。細胞懸濁液を回収し、新しい滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。ラベルに側性の特定を記載してください。同一のバルブから得られた葉片はまとめて回収することが可能です。固定化したバルブを少量の冷DPBSでリンスし、残存している細胞やデブリを洗浄します。リーフレットを新しい培養皿に移し、心室側を上に向けて配置して、示した通りに内皮細胞を採取します。Gリーフレットからの内皮細胞のスワブ採取が完了したら、直ちにリーフレットを10 mLのコラゲナーゼ溶液が入った15 mLチューブに入れます。細胞を洗浄して再懸濁し、内皮細胞の非部位特異的単離の手順に従って培養します。細胞収量が非常に低い場合は、より小さなフラスコへの変更またはウェルプレートの使用を検討してください。細胞接着は細胞増殖を促進するため、コンフルエンスに近い状態で細胞を継代させるようにしてください。接触阻止は細胞形質転換を引き起こす可能性があるため、内皮細胞を遠心分離しながら間質細胞の単離を開始し、弁尖を入れたチューブを約12〜18時間インキュベートします。必要に応じて緩やかに撹拌しながら、コラゲナーゼ溶液に入れます。インキュベーション期間の終了後、セロロジカルピペットを使用して、細胞懸濁液が均質になるまで消化組織を緩やかに混合します。この均質化により、組織が崩壊し、間質細胞が放出されます。内皮細胞の手順と同様に、細胞を遠心分離し、洗浄します。5 mLの間質培地で再懸濁する代わりに、遠心分離した間質細胞を15 mLの間質培地に懸濁し、遠心分離チューブ1本につき1枚のT 75フラスコを用いて細胞を播種します。間質培地を交換する前に、少なくとも1〜2日間細胞を培養してください。なお、内皮細胞よりも多くの組織片が含まれることが予想されます。また、間質細胞は本来、内皮細胞よりも早くコンフルエンスに達し、これらの代表画像に示されているように、より高い細胞回収率が得られます。培養されたV Cs心臓弁内皮細胞と、それに対する心臓弁間質細胞の形態を2〜3日後に示します。Becsは、細胞が石畳状のパターンを呈し、クラスターを形成し始めるという、典型的な内皮細胞の形態を示します。VS.Exhibitの形態は筋線維芽細胞に類似しており、コンフルエントにまで培養した際に細胞は概して紡錘形で疎に分布しています。ECSは典型的な内皮細胞の形態を示し、細胞は敷石状のパターンを形成し、増殖は接触抑制されます。VI CSは筋線維芽細胞に類似した形態を示し、細胞は概して紡錘形で接触抑制されません。VECとVICの両方の機能的特性は、染色の結果から推測できます。標識LDLの取り込みについて。VEC細胞は、高いレベルのアセチル化LDL取り込みを伴います。一方でVIC細胞は、低いレベルのアセチル化LDL取り込みを伴いますが、ここではVECおよびVICの細胞マーカーを示しています。VECはvon Willebrand factorに対して陽性に染色されますが、VICは...フォン・ヴィレブランド因子の染色は認められません。さらに、V CS染色はα平滑筋アクチンに対して陰性である一方、V CS染色はα平滑筋アクチンに対して陽性です。さて、本日の分離操作から多くのことを学んでいただけたかと思います。ただし、内皮細胞の基底膜は非常に脆弱であり、下層のマトリックスに乱れが生じると、組織の他の部分から不純な細胞が遊離することが多い点に注意してください。分離が成功したかを確認するには、分離した細胞の純度を評価する特性解析が極めて重要になります。それでは、頑張ってください。

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