全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

この手順では、生きた細菌細胞に反応して起こる孔辺細胞の動きを評価するために、葉のイメージングを用います。まず、グリセロールストックから細菌を培養し、接種液を調製します。次に、若く健康な葉を採取し、プロピジウムヨードで染色します。

染色した葉を切断し、葉の断片を細菌懸濁液の上に置いてインキュベートします。最後に、顕微鏡で葉の表面を観察し、気孔開度を測定できます。蛍光顕微鏡を用いて得られた結果は、細菌に応答した気孔開度の変化を示しています。

表皮剥離などの既存の手法と比較した本法の主な利点は、細菌と接触させる葉が完全な状態で維持されており、細菌が葉へ侵入する自然な条件を模倣できる点にあります。この手順を開始するには、まずArabidopsisの種子を、栽培用培地、バーミキュライト、およびライトミックスを1:1:1で混合したものに播種します。植物を育成チャンバーで栽培し、必要に応じて水を与えます。

植物は、抽台前に若く完全に展開した葉が現れる4～6週間後に使用可能になります。実験開始の2日前までに、細菌培養のストリーク準備を行います。グリセロールストックからmodified LB培地でPseudomonas ringeをストリークし、28 degrees Celsiusで24時間インキュベートします。

接種源の調製には新鮮な培養物を使用し、培養プレートは常にグリセロールストックから開始してください。継代培養によって細菌の毒性が低下するため、プレート上で増殖した細菌を用いて、Pseudomonas syringaeの10 mL液体培養を開始します。50 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れ、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.8から1の間になるまで、28 °Cで激しく振盪しながら一晩培養します。

600 nmでODを測定し、1,360 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。最終ODが0.2になるように、蒸留水で細胞を再懸濁します。このOD値は10⁸ CFU/mLに相当します。

細菌の準備が整ったら、葉の準備を行い、葉を染色するためのアッセイを実施します。まず、20 µMのプロピジウムヨード（PI）水溶液を調製します。一度に3枚の小さな葉を染色する場合、溶液は10 mLで十分です。

植物を育成チャンバーから取り出し、ピンセットを用いて、十分に展開した若葉を3枚摘み取ります。葉全体をPI溶液に5分間浸漬させます。その後、葉を取り出し、蒸留水で軽くすすぎます。

次に、葉の裏面を下にして顕微鏡スライドガラスの上に置きます。細菌を葉に接種させて培養させるため、鋭利なカミソリで中肋を除いて葉を4等分に切り、スライドガラスの上に平らに密着させます。スライドガラス上の葉の断片の下に細菌懸濁液を300 µL加え、葉の裏面が接種液に接触していることを確認してください。

植物の育成に使用した環境条件と同じ条件下でサンプルをインキュベートします。顕微鏡で葉を観察する際は、葉の断片を新しいスライドグラスに移し、裏面を上に向けて配置してください。なお、スライドを準備する際にカバーガラスは使用しません。

同一の葉のサンプルをインキュベーション中に複数回イメージングすることができ、研究目的に応じてタイムコースを設定することが可能です。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて葉を検査し、同一の葉のサンプルを用いて葉の裏面を観察してPIの蛍光を検出し、気孔の経時的な画像をキャプチャします。気孔開口幅を測定するために、これらの画像を保存してください。

各タイムポイントの各処理について、少なくとも60個の気孔の開口幅を測定します。LSM画像ブラウザを用いて、気孔開口幅の平均値と標準誤差を算出します。結果の統計的有意性は、両側対応t検定を用いて算出できます。

ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したシロイヌナズナの葉表面の典型的な顕微鏡画像を示します。明視野像では、プロピジウムヨードが生存細胞の細胞壁を染色するため、損傷のない細胞を識別できるだけでなく、孔辺細胞の視認性が向上します。これらの顕微鏡写真では、完全に閉じた気孔から大きく開いた気孔まで、さまざまな気孔開口度の状態を確認できます。

完全に閉じた気孔は、孔辺細胞の形状によって識別されます。開いた気孔の場合、気孔開度は 0 µm とみなされます。表示されている気孔開度は、気孔の孔の最も広い部分に引いた直線を用いて測定したものです。

これらは生葉接種アッセイの典型的な実験結果である。Arabidopsisの葉を3種類の異なるpseudomonas属の菌株とともに暗所でインキュベートしたところ、菌株あたりにランダムに選択した60個の気孔の開口幅を測定した結果、細菌P-S-T-D-C 3000のみが暗所での気孔を開口させることができた。この手法は、植物と細菌の相互作用分野の研究者が、植物種における病原体への初期応答メカニズムを探索するための道を開いた。