Name: 全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ 全葉イメージング法による細菌応答性気孔運動の評価技術。プロピジウムヨウ化物染色と共焦点顕微鏡を用いて、傷つけない葉でリアルタイムに気孔開度変化を測定し、植物病原体相互作用を解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は国立衛生研究所からの助成金とテキサス大学アーリントン校MMに資金をセットアップすることによってサポートされていました。

1。成長する植物と準備細菌<ol><li> V：：Vの生育培地の混合物（熱地-地球のプラグと苗ミックス、サングロ）、細かいバーミキュライト、パーライトおよびこの手順を開始するには、午前1時01分01秒Vのシロイヌナズナの種子をまく。 </li><li>成長チャンバー（22℃、100μモル/ mm 2の /秒毎日の光と65の12時間± 5％湿度）及び必要に応じて水で植物を育てる。植物は、彼らが前にボルトに若い完全に展開された葉を持っている場合4-6週間で使用する準備が整いました。 </li><li>実験を始める前に二日は、細菌の培養を準備。修正されたLB培地（10g / Lのトリプトン、5g / Lの酵母エキス、5g / lの塩化ナトリウム液（pH7.0）、および1.5％寒天）と28で24時間インキュベート℃の上にグ ​​リセロールストックからストリークシュードモナスシリン接種を準備し、常に細菌が継代培養後の弱毒になるとグリセロールストックから培養プレートを開始するために新鮮な培養を使用してください。 </li><li> P. 10 mLの液体培養を開始するためにプレート上に成長した細菌を使用してください50 mLの三角フラスコにシリン 。 28で一晩培養液を振とうしながら精力的で、Cをそれが0.8と1の間の600 nmにおける光学密度またはODに達するまで。 </li><li> 600 ODを測定し、10分間1360 × gで遠心分離により細胞を収穫。最後のODが0.2になるように蒸留水で細胞を再懸濁します。このODは10 8コロニー形成単位（CFU）/ mLに相当する。準備が細菌で、葉を準備し、アッセイを行うために進んでください。 </li></ol> 2。バクテリアと葉の染色とインキュベーション<ol><li>染色するために、葉はまず水に20μMのヨウ化プロピジウムまたはPI溶液を調製。溶液10 mL、一度に3つの小さな葉を染色するのに十分です。 </li><li>成長チャンバーから植物を取得し、鉗子で3若い、完全に展開した葉を切り離します。 5分間のPI溶液中で全体の葉を浸し。その後、葉を取り除き、蒸留水で簡単にそれらを洗い流してください。 </li><li>次の場所下面は、顕微鏡スライド上に下向きに持つ葉。葉がスライド上に平らになるようにミッド静脈を除く4つの部分に鋭いカミソリの刃を持つ葉を切り取ります。 </li><li>葉で細菌を培養するために、スライド上の葉の部分の下に細菌懸濁液300μLを加える。葉の下面は、接種に接触していることを確認してください。 </li><li>植物を育てるために使用されたのと同じ環境条件でサンプルをインキュベートする。顕微鏡下で葉を観察する時に、上を向く下面との新しいスライドに葉の部分を転送する。スライドをマウントするときに、カバースリップが使用されていないことに注意してください。同じ葉の試料はインキュベーションの間に複数回撮像することができ、時間の経過は、研究目的に応じて設定することができる。 </li></ol> 3。顕微鏡、測定とデータ解析<ol><li>ここでは共焦点顕微鏡（LSM 510メタ、カールツァイス社）をスキャンするレーザーは、葉を調べるために使用されます。 PI（励起453 nmの発光543および620nm）の蛍光を検出するために、葉の下面を観察。 </li><li>同じ葉のサンプルを使用すると、時間の経過とともに気孔の画像をキャプチャ。気孔開口部の幅を測定するために画像を保存します。 </li><li> LSMの画像のブラウザを使用して、各時点における各治療のために少なくとも60気孔の気孔開口部の幅を測定します。 </li><li>気孔開口部の幅の平均と標準誤差を計算する。結果の統計的有意性は、2尾、ペアワイズスチューデントのt検定を用いて計算することができます。 </li></ol> 4。細菌とのインキュベーションに気孔応答の代表的な画像<ol><li>ここで明視野のビュー（図1）におけるレーザー走査型共焦点顕微鏡下でシロイヌナズナの葉の表面の典型的な顕微鏡画像は、（20倍対物レンズを用いて）です。 </li><li>ヨウ化プロピジウム染色生細胞の細胞壁は、データの収集（図2）のための無傷の細胞の同定を可能に加えて、孔辺細胞の可視性を高める。気孔孔開口部の範囲が広く開いている気孔に完全に閉じた気孔から、これらの顕微鏡写真で見ることができます。 </li><li>完全に閉じた気孔は孔辺細胞の形状（図3）によって識別されます。開口幅は、0μmと考えられている。 </li><li>オープン気孔（図4）で示した開口幅は、気孔孔の広い領域にわたって描かれた直線を用いて測定されます。 </li><li>これらは、この気孔アッセイの代表的な実験結果です。Arabidopisの葉は、 シュードモナスシリンの3つの異なる株で、暗所でインキュベートした。唯一の細菌は、PST DC3000は、菌株ごとにランダムに選ばれた60気孔（図5）の開口幅で測定された暗閉じた気孔を、開くことができました。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールドを変更します。気孔の開口は、ヨウ化プロピジウム染色（図2）によって支援蛍光ビューと比較して明らかなようにではないことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ヨウ化プロピジウム染色シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールド。気孔の孔の開口部の範囲に注意してください。黄色の矢印は、完全に気孔を閉じるために指摘されていると緑色の矢印が広く開いた気孔を指摘されています。 <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。の形状と孔辺細胞の間の開口部で識別される、完全に近い気孔。開口幅は、0μmと考えられている。 <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。ミクロンの開口幅を示す開いた気孔測定は、気孔の孔の広い領域にわたって引かれた直線に基づいてLSCMブラウザを使用して撮影した。 <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。 シュードモナスシリン PVの3株とインキュベートしたシロイヌナズナの葉の気孔開口トマト ：。。DC3118、DB29、およびDC3000植物は、実験時に暗闇に格納されていました。結果は平均値（N = 50から70まで）±標準誤差として示されています。統計学的有意性は、両側スチューデントt -テストで検出した。実験は、同様の結果を3回繰り返した。

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は異なる治療に気孔応答の簡単な評価を可能に無傷の葉組織に気孔開口部を測定するためにまっすぐ進むの手順を提示している。 私たちはモデルシステムのシロイヌナズナ / シュードモナスシリンを使用して結果を提示されているが、無傷の葉気孔のアッセイは、潜在的に任意の植物-細菌の組み合わせで行うことができます。プロトコルは、簡単に他の植物や細菌の病原体の成長の必要条件に合わせて変更することができます。全体的な原則と手順は同じです。さらに、このメソッドは機能的な孔辺細胞の出力だけでなく、微生物を生きるために勉強したい研究者に有益なだけでなく、葉の自然環境を維持する条件下で、他の刺激と化学物質への可能性があります。 全体の葉は、その厚さや不均一な地形のため、画像に困難になる可能性があります。この問題は、スライド上に平らように葉の中央静脈を除去し、共焦点顕微鏡を使用することによって軽減することができます。しかし、蛍光顕微鏡の他のタイプは、葉の表面の高解像度の画像を取得するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>プロピジウムヨード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>トリプトーン</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>植物育成チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振盪インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

気孔は、植物のインテリアと環境の間でガス交換を担当し、植物の表皮の自然な開口部です。彼らは光強度、二酸化炭素濃度、および相対湿度（RH）などの外部要因の数に応じて気孔気孔を閉じたりしている孔辺細胞、のペアによって形成される。気孔の孔は、また、病気の開発のための重要なステップの葉への病原体のエントリのための主要な経路である。最近の研究では、細孔の閉鎖は、 シロイヌナズナ植物に細菌性疾患の開発を最小限に抑えるのに有効であることを明らかにした。植物自然免疫の重要な部分を。以前は、我々は細菌を（。Melottoら、2006）生きて気孔の応答を評価するために表皮の皮を使用しているが、植物表皮のピーリングと細菌の細胞の両方のために有利な環境条件を維持するには挑戦されています。葉の表皮は、孔辺細胞の電気生理学的実験のためのMES緩衝液（10mMのKCl、25mMのMES - KOH、pHは6.15）との生存と健康的に保つことができます。しかし、このバッファは、細菌懸濁液を得るためには適切ではありません。一方、細菌細胞は、倍の長時間表皮皮を維持するために、適切ではない水に保つ事が可能。水で表皮剥離フロートは、4時間以内に空気乾燥にさらされている皮の細胞は、実験を実施するタイミングを制限するとき。孔辺細胞の特定の刺激の効果を評価するための理想的な方法は、気孔生理学にし、できるだけ多くの植物の自然環境への干渉を最小限に提示する必要があります。我々は、したがって、葉の傷や操作が大幅に容易に再現性と信頼性の高い気孔アッセイを提供することを目指して最小化されている細菌を生きて気孔の応答を評価する新しい方法を開発した。プロトコルは、ヨウ化プロピジウム（PI）、細菌懸濁液を葉の染色のインキュベーション、および共焦点顕微鏡を走査型レーザーの下での葉の観察と生葉の染色に基づいています。最後に、このメソッドは、密接に、植物が病原体によって攻撃される際の自然条件を模倣する条件を使用して、長時間にわたって同じライブ葉の試料の観察が可能になります。

我々は、生菌に対する気孔の応答にアクセスするためのシンプルで再現性のプロトコルを開発しました。表皮皮の使用と比較して、この方法では、葉の傷や操作を最小限に抑えることが以前に報告した。

気孔は植物の表皮にある天然の開口部であり、植物内部と環境との間のガス交換を担っています。気孔は一対の...

この手順では、生きた細菌細胞に反応して起こる孔辺細胞の動きを評価するために、葉のイメージングを用います。まず、グリセロールストックから細菌を培養し、接種液を調製します。次に、若く健康な葉を採取し、プロピジウムヨードで染色します。染色した葉を切断し、葉の断片を細菌懸濁液の上に置いてインキュベートします。最後に、顕微鏡で葉の表面を観察し、気孔開度を測定できます。蛍光顕微鏡を用いて得られた結果は、細菌に応答した気孔開度の変化を示しています。表皮剥離などの既存の手法と比較した本法の主な利点は、細菌と接触させる葉が完全な状態で維持されており、細菌が葉へ侵入する自然な条件を模倣できる点にあります。この手順を開始するには、まずArabidopsisの種子を、栽培用培地、バーミキュライト、およびライトミックスを1:1:1で混合したものに播種します。植物を育成チャンバーで栽培し、必要に応じて水を与えます。植物は、抽台前に若く完全に展開した葉が現れる4～6週間後に使用可能になります。実験開始の2日前までに、細菌培養のストリーク準備を行います。グリセロールストックからmodified LB培地でPseudomonas ringeをストリークし、28 degrees Celsiusで24時間インキュベートします。接種源の調製には新鮮な培養物を使用し、培養プレートは常にグリセロールストックから開始してください。継代培養によって細菌の毒性が低下するため、プレート上で増殖した細菌を用いて、Pseudomonas syringaeの10 mL液体培養を開始します。50 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れ、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.8から1の間になるまで、28 °Cで激しく振盪しながら一晩培養します。600 nmでODを測定し、1,360 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。最終ODが0.2になるように、蒸留水で細胞を再懸濁します。このOD値は10⁸ CFU/mLに相当します。細菌の準備が整ったら、葉の準備を行い、葉を染色するためのアッセイを実施します。まず、20 µMのプロピジウムヨード（PI）水溶液を調製します。一度に3枚の小さな葉を染色する場合、溶液は10 mLで十分です。植物を育成チャンバーから取り出し、ピンセットを用いて、十分に展開した若葉を3枚摘み取ります。葉全体をPI溶液に5分間浸漬させます。その後、葉を取り出し、蒸留水で軽くすすぎます。次に、葉の裏面を下にして顕微鏡スライドガラスの上に置きます。細菌を葉に接種させて培養させるため、鋭利なカミソリで中肋を除いて葉を4等分に切り、スライドガラスの上に平らに密着させます。スライドガラス上の葉の断片の下に細菌懸濁液を300 µL加え、葉の裏面が接種液に接触していることを確認してください。植物の育成に使用した環境条件と同じ条件下でサンプルをインキュベートします。顕微鏡で葉を観察する際は、葉の断片を新しいスライドグラスに移し、裏面を上に向けて配置してください。なお、スライドを準備する際にカバーガラスは使用しません。同一の葉のサンプルをインキュベーション中に複数回イメージングすることができ、研究目的に応じてタイムコースを設定することが可能です。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて葉を検査し、同一の葉のサンプルを用いて葉の裏面を観察してPIの蛍光を検出し、気孔の経時的な画像をキャプチャします。気孔開口幅を測定するために、これらの画像を保存してください。各タイムポイントの各処理について、少なくとも60個の気孔の開口幅を測定します。LSM画像ブラウザを用いて、気孔開口幅の平均値と標準誤差を算出します。結果の統計的有意性は、両側対応t検定を用いて算出できます。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したシロイヌナズナの葉表面の典型的な顕微鏡画像を示します。明視野像では、プロピジウムヨードが生存細胞の細胞壁を染色するため、損傷のない細胞を識別できるだけでなく、孔辺細胞の視認性が向上します。これらの顕微鏡写真では、完全に閉じた気孔から大きく開いた気孔まで、さまざまな気孔開口度の状態を確認できます。完全に閉じた気孔は、孔辺細胞の形状によって識別されます。開いた気孔の場合、気孔開度は 0 µm とみなされます。表示されている気孔開度は、気孔の孔の最も広い部分に引いた直線を用いて測定したものです。これらは生葉接種アッセイの典型的な実験結果である。Arabidopsisの葉を3種類の異なるpseudomonas属の菌株とともに暗所でインキュベートしたところ、菌株あたりにランダムに選択した60個の気孔の開口幅を測定した結果、細菌P-S-T-D-C 3000のみが暗所での気孔を開口させることができた。この手法は、植物と細菌の相互作用分野の研究者が、植物種における病原体への初期応答メカニズムを探索するための道を開いた。

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は浸潤性封入剤としてperfluorodecalinの使用を説明しています。これは、撮像の深さを改善するための簡単​​な方法です。...

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

出典: Lee、H. ら、 感染中に細菌から送達されるエフェクターを視覚化するための緑色蛍光タンパク質システムの分割。 J. Vis. 経験。...

植物細胞における細菌感染とエフェクタータンパク質送達のモニタリング

病原体の成長の定量化は、様々なシロイヌナズナ(以下:シロイヌナズナ)の免疫応答を特徴づける強力なツールです。ここで説明する方法は、Pseudomonas syringae...

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

葉緑体の表面から伸びる間質で満たされた細管である葉緑体ストロミュールの動態を調査するためのプロトコルが説明されています。...

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

拡張期間にわたってシロイヌナズナ葉の蛍光ライブ...

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。...

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

本プロトコルは、植物アポプラスト内で増殖した シュードモナス・シリンガエ...

植物組織における シュードモナス・シリンガエ 遺伝子発現の単一細胞解析

ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。...

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

ここでは、 シロイヌナズナの細菌侵入に対する気孔応答の直接観察と自動測定のための簡単な方法を紹介します。この方法では、ポータブル気孔イメージングデバイスと、デバイスによってキャプチャされた葉の画像用に設計された画像解析パイプラインを活用します。...

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

このプロトコルは、同じサンプル内で植物イオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース生成を評価するためのハイスループットアプローチを記述しています。...

高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

本プロトコルは、表皮ピーリング、クリアリング技術、AI支援画像解析を用いて、2つの異なる種の気孔および表皮形質を比較評価する方法を提示します。この目的は、農業応用および広範な植物研究において、気孔機能の基盤となる細胞構造を高スループットかつ再現性のある定量化を可能にすることです。...

ピーリング、クリアリング、AI画像解析を用いた気孔および表皮の特徴の特徴づけ

学ぶ 全葉イメージング法による細菌応答性気孔運動の評価技術。プロピジウムヨウ化物染色と共焦点顕微鏡を用いて、傷つけない葉でリアルタイムに気孔開度変化を測定し、植物病原体相互作用を解析する方法です。

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

さらに動画を探す