全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

本手順では、生きた細菌細胞に対する孔辺細胞の運動を評価するために、葉のイメージングを用います。まず、グリセロールストックから細菌を培養し、接種液を調製します。次に、健康的で若い葉を採取し、プロピジウムイオダイドで染色します。

染色した葉を切り、葉の断片を細菌懸濁液の上に置いてインキュベートします。最後に、顕微鏡下で葉の表面を観察し、気孔開度を測定します。蛍光顕微鏡を用いて得られた結果から、細菌に応答した気孔開度の変化が示されます。

表皮剥離などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細菌と接触する葉が完全な状態にあり、細菌の葉への侵入における自然な条件を模倣できることです。この手順を開始するには、まずArabidopsisの種子を、成長培地、バーミキュライト、およびライトグロウを1:1:1の比率で混合したものに播種します。植物を培養室で育成し、必要に応じて水を与えます。

植物は、抽苔前の若く完全に展開した葉を持つ4〜6週間後に使用可能になります。実験開始の2日前までに、細菌培養のストリーク準備を行います。修飾LB培地を用いてグリセロールストックからPseudomonas ringeを画線し、28 °Cで24時間培養します。

接種源の調製には新鮮な培養物を使用し、培養プレートは常にグリセロールストックから開始してください。継代後の細菌は毒性が低下するため、プレート上で増殖した細菌を用いて、10 mLのPseudomonas syringae液体培養を開始します。50 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れ、600 nmでの光学密度（OD600）が0.8から1の間になるまで、28 °Cで激しく振盪しながら一晩培養してください。

600 nmでODを測定し、1,360 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。最終ODが0.2になるように、蒸留水で細胞を再懸濁します。このODは1 mLあたり10⁸ CFU（コロニー形成単位）に相当します。

細菌の準備が整ったら、葉の調製を行い、染色アッセイを実施します。まず、20 µMのプロピジウムヨウ化物（PI）水溶液を調製します。10 mLの溶液があれば、一度に3枚の小さな葉を染色するのに十分です。

植物を育成チャンバーから取り出し、ピンセットで十分に展開した若い葉を3枚採取します。葉全体をPI溶液に5分間浸します。その後、葉を取り出し、蒸留水で軽く洗浄します。

次に、葉の裏面を下にして顕微鏡スライドグラスの上に置きます。細菌を葉とともにインキュベートするため、鋭利なカミソリで葉の中肋を除いて4等分に切り、葉がスライドグラス上に平らに密着するようにします。スライドグラス上の葉の断片の下に細菌懸濁液を300 µL加え、葉の裏面が接種源に接触していることを確認します。

植物の育成に使用したものと同じ環境条件下でサンプルをインキュベートします。顕微鏡で葉を観察する際は、葉の断片を新しいスライドガラスに移し、裏面を上に向けます。なお、スライドの作製にカバーガラスは使用しません。

同一の葉のサンプルを培養中に複数回イメージングすることができ、研究目的に応じてタイムコースを設定できます。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて葉を観察し、同一の葉のサンプルを用いて葉の裏面を観察してPIの蛍光を検出し、気孔の画像を時系列でキャプチャします。気孔開度の幅を測定するために、これらの画像を保存します。

各タイムポイントの各処理について、少なくとも60個の気孔の開口幅を測定します。LSMイメージブラウザを使用して、気孔開口幅の平均値と標準誤差を算出します。結果の統計的有意性は、両側ペアt検定を用いて算出できます。

ここでは、共焦点走査型レーザー顕微鏡で観察したシロイヌナズナの葉表面の代表的な顕微鏡像を示します。明視野像では、プロピジウムヨードが生存細胞の細胞壁を染色するため、損傷のない細胞を識別できるだけでなく、孔辺細胞の視認性も向上します。これらの顕微鏡写真からは、完全に閉じた気孔から大きく開いた気孔まで、さまざまな気孔開度の範囲が確認できます。

完全に閉じた気孔は、孔辺細胞の形状によって識別されます。開いた気孔の場合、開口幅は0 µmとみなされます。表示されている開口幅は、気孔の最も広い部分に引いた直線を用いて測定されています。

これらは生葉接種アッセイの代表的な実験結果です。シロイヌナズナの葉を3種類の異なるシュードモナス属菌と共に暗所で培養したところ、細菌株あたり60個の気孔をランダムに選択して開口幅を測定した結果、P-S-T-D-C 3000のみが暗所での気孔を開口させることができました。この手法は、植物と細菌の相互作用分野の研究者が、植物種における病原体への初期応答メカニズムを探索するための道を切り開いたと言えます。