Name: 水系でのウイルス産生率を予測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ 水生微生物群集におけるウイルス産生率の推定法。ウイルス減少・再出現技術を用いて、海洋・淡水システムの微生物死滅率を解析します。生態学研究に有用な手法です。

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この記事の出版物は、テネシー大学の研究局からの助成金によって支えられて。著者らは、これらの手順を絞り込むには働いている学生や研究者の前世代に感謝。研究は全米科学財団（NSF - 0851113、NSF - 0825405とNSF - 0550485）からの補助金によって支えられている。

1。 "ウイルスフリー"水（ヴィルヘルム＆Poorvin 2001）を生成するために海水の限外ろ過<ol><li>海水/ lakewaterの約20Lを無菌的に可能な限り収集されます。 </li><li>水はシリアル142 - mm径のポリカーボネートを通じて地域社会の分析のために-20℃で保管することができます0.8μmのフィルタをフィルタ処理されている。より大きな孔径のフィルターは、非常に生産的なシステムのためのこのステップの前に使用することができます。 </li><li> 30kDaのカットオフスパイラルカートリッジはすべてのウイルスを排除するために使用されるアミコンM12システム（ミリポア）、さらに小型のRNAウイルスから限外濾過水を得るために。 </li><li>サンプルは、背圧の〜15から16 kPaで〜25％の速度で処理し、濃縮されています。 </li><li>水の〜500mLの残りのサンプルでは、​​ウイルスのない水の残りの19.5 Lのウイルス産生のアッセイに使用される一方、濃縮ウイルスのコミュニティを（これは他の実験のために保存することができる）が含まれます。 </li><li>使用のそれぞれの一日を過ごした後、アミコンM12システムは、フィルターカートリッジの膜への損傷を防ぐために洗浄する必要があります。 </li><li>もし海水を使用している場合は、30〜45分のための0.1N NaOH溶液で洗浄した後、Milli - Q水の少なくとも6Lで膜をすすいでください。 </li><li>再びMilli - Q水の少なくとも6Lでカートリッジをすすいでください。 </li><li> M12システムの使用を終了するときに、スパイラルのカートリッジは4で0.05MH 3 PO 4水溶液℃で保存してください。 </li></ol> 2。ウイルス産生のためのウイルスの削減手法（ヴィルヘルムら、2002） <ol><li>その上に置かれた0.2μmの公称孔径の低タンパク質結合フィルター（例えば、デュラポア）で取得し、sterifilterユニットに配置され、最大ホストとウイルスの両方で海水/ lakewaterサンプルの500mlに。 </li><li>継続的にフィルターに集中するから、細菌細胞を抑制するために無菌トランスファーピペットを使用してサンプルを再懸濁しながら、サンプルを穏やかに&lt;200 mmHgの時に圧力をかけて真空されています。 </li><li>ゆっくりと限外濾過の三巻が大幅に試料中の遊離ウイルスの数を減らすために細菌懸濁液に添加されています。 </li><li>細菌の割合は、ウイルスフリーの水で500mLに戻って希釈し、3つに分割されている150mLのそれぞれの複製と透明な250ミリリットルポリカーボネートボトルに配置されます。 </li></ol> 3。ウイルス産生のためのタンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF）メソッド（Weinbauer ら、2002、ウィンゲットら、2005） TFFは、ウイルス還元法に代わるアプローチを表します。 <ol><li>上記のような天然試料の約500mLを集めています。 </li><li>このサンプルは、0.2μmの公称孔径タンジェンシャルフローろ過システムを用いて濃縮される。 </li><li>細菌の割合が約10〜15 mLに低下すると、限外濾過、ウイルスフリー水を添加し、上記のように配布されています。 </li><li>複製ボトルは、環境槽を用いてその場の条件でインキュベートする。 <ol><li>光レベルは、光強度を減少させるためにネットスクリーニングと青がかったアクリルまたは透明なアクリルを使用して表面状態に変更されます。 </li><li>周囲の表面温度は、しばしば流れる海水デッキインキュベーターを使用することによって得られる。 </li></ol></li><li>細菌とウイルスの資源量推定値のサンプルはcryovialsに追加さ2.0〜2.5パーセント滅菌グルタルアルデヒドの最終濃度で、時間0で撮影されています。これらのサンプルは、直ちに液体窒素で凍結させ、処理されるまで凍結されたフラッシュされています。 <ol><li>液体窒素が使用できない場合は、顕微鏡のスライドは、（次の手順を参照）を調製し、直ちに処理されることがあります。 </li></ol></li><li>サブサンプルは、上記の方法で少なくとも10時間毎に2.5時間を集めています。 <ol><li>この時点で水は定量的PCR解析のために収集されることがあります。最大サンプルを5 mLまで液体窒素中で即座にフラッシュの凍結と無固定剤をクライオバイアルに添加することができる。 </li></ol></li></ol> 4。ウイルスの生産顕微鏡（ノーブル＆ファーマン1998年、温家宝ら 2004） <ol><li> 0.02μmの顕微鏡用にフィルタリングされる凍結試料を氷上で融解してください。 </li><li>滅菌水で原液を1:10に希釈してSYBR Greenのストック溶液を調製。次に、ストック溶液から、滅菌水39 mLに原液の1mlを加えることによって、作業溶液を調製。 50％グリセロール、50％のリン酸塩は生理食塩水をバッファ（PBS、0.05 MのNa 2 HPO 4、0.85％のNaCl、pH7.5）およびp -フェニレンジアミンの新鮮な2.5％の原液は、開始前に準備する必要があります。 4に50％glycerol/50％PBS溶液を保持° CとP - phenylenediam-20伊根の株式△初任まで、暗所で。右の退色防止ソリューションとして使用される最終濃度0.1％を50％glycerol/50％PBSにp -フェニレンジアミンを追加フィルタリングの前に。 </li><li> 0.45μmのMicronStep、セルロース系バッキングフィルターの上に0.02μmのAnodiscフィルター25mmを置きます。完全に乾くまでに20のpKaでAnodiscと真空の上部に固定されたサンプル850μLを加える。場所100滅菌シャーレにSYBRグリーンワーキング溶液μLと、上でも、真空で、慎重にSYBRグリーン上でフィルタ塔と場所からAnodiscを削除します。 20分間室温で暗所でサンプルをインキュベートする。慎重にSYBR Green液からフィルタを削除して、すべての残留色素を除去するキムワイプとフィルターの後ろを放出する。必要に応じて、タワーにフィルターを戻し、余分な汚れを洗い流しますするフィルタを介して0.02μmのフィルタ処理された水または無菌のメディアの800μLまで渡す。 </li><li>顕微鏡のスライドに退色防止ソリューションの小滴を追加し、上にカバースリップを配置。カバーガラスを外し、退色防止ソリューションによる湿式顕微鏡のスライドに乾燥フィルタを追加します。再び、カバーガラスに退色少量の溶液を加えると徐々に形成する可能性のある気泡を取り除くために確認しながら、フィルターの上に置きます。 </li><li>必要になるまで、すぐに（これらはフェージングと低下ウイルスのカウントを防ぐために、数ヶ月以内に使用されるべきである）-20℃でスライドを凍結する</li><li>ウイルスは、広い青いフィルターセット（λ 例 = 450〜490 nmの、λ エム λにおける抑制フィルタ付き= 510 nmの= 510 nm）を（我々の場合ライカDMRXA顕微鏡）蛍光顕微鏡を使用して列挙されます。各フィルタは、フィルタ膜を通過するウイルスを均等に各フィールドのグリッドから合計ウイルスを定量化することを確認し、カウントビューの少なくとも20個のフィールドを持つことになります。 </li><li>三つの独立からのウイルスの再発の平均速度は、計算されると標準偏差は、生産率から決定される複製。 </li></ol> 5。代表的な結果研究者によって収集された生データは、ウイルスの存在量の再発率を生成するための最小限の数学的処理が必要になります。この研究から生じる主要なデータセットには、インキュベーションから二次検体中のウイルスの存在量の再発率である。これらの結果は、試料の各々のウイルスの存在量対時間の独立した回帰を形成する。各サンプルについて、個々のインキュベーションでは、その研究者が同様に変動の推定値（例えば、標準偏差）として速度を計算することができる3つの繰り返し、インキュベーションを行うことにより、一つの治療、（図1を参照。）として機能このプロセスの一つの注意点は、ウイルスの存在量不変の減少は、ウイルスの負担を運んでいるサンプルで宿主細胞の減少につながるということです。この損失を相殺するために、ソース（フィルタ処理されていない海水や湖沼の水）とT = 0インキュベーションのサンプルの両方からの細菌の存在量の列挙が必要です。この情報は、失われた細胞の割合を考慮するために使用することができます。ウイルスの存在量を減少させるプロセスは微生物コミュニティのあらゆるメンバーのためにまたはに対して選択的ではない、この因子がその後、ウイルスのその場の生産率の推定に使用することができると仮定。 <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。落射蛍光顕微鏡を用いた原位置条件下で少なくとも10時間のインキュベーションオーバーウイルス様粒子の生産。サンプルは2008年9月にニュージーランド沖の咲く植物プランクトン中に収集された。 <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ウイルス産生をアッセイするためのワークフロープロセスの模式図。プロセスは、ウイルスフリー水を生成するために、サンプル水のろ過から始まります。これは、限外ろ過システムを使用して完了します。微生物群集が（感染および非感染細胞の混合物を含有する）保たれる間、パラレル水サンプルに同じサイトから収集され、無料のウイルスがフィルターを通過。このコミュニティは、ウイルスフリーの水に再懸濁し、 その場の状況の下でインキュベートする。ウイルスの再発率は、ウイルス産生の速度を決定するために、次の10時間監視されています。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ウイルスは、海洋微生物群集にどのように影響するかを理解する上で重要な部品とは、ウイルス粒子が生成されるレートを決定することです。 （ヴィルヘルムら、1998）水生システムに迅速に存在量はほとんどのシステムでは（多かれ少なかれ）静的であることを考えると（ヴィルヘルム＆サトル1999、Weinbauer 2004）、そしてそのウイルスは、非感染性の除去またはレンダリングされ、その後、生産率は、でなければならない相対的な急速な失われた粒子を交換する。 死亡率のウイルスは微生物群集の原因と推定することは、ウイルスが細胞を（&quot;バーストサイズ&quot;）溶解するたびに、生成される多くのウイルスの知識が必要です。天然試料中のウイルスのバーストサイズは​​大きく異なる可能性があります。バーストサイズは​​、透過型電子顕微鏡（例えば、Weinbauer＆Peduzzi 1994）によって直接決定されるが、これは必ずしも現実的ではない与えられた実験室の能力を超えて多くの場合、またはすることができます。それらは経験的に決定することができない状況では、溶解イベントあたり24ウイルスの文献値は、海洋システムや淡水系（パラダほか 2006）のための34のために使用することができます。ウイルス産生の割合がこの数値によって分割されている場合、結果は毎日、ウイルスによって破壊された体積あたりの細胞の豊富さです。値を溶解微生物は、問題のシステムのためのウイルスによる死亡率をもたらす細菌の存在量の立っている株式によって分けることができます。数パーセントからほぼ全人口に既存の推計範囲及び当該のシステムではしばしば他の要因に依存しています（ヴィルヘルム＆マッテソン2008）。総死亡率の割合を決定するためにこの数は、多くの場合、両者（細胞の50％が再現するに行くことを前提で仕事をし、細胞の50％が失われ、Weinbauer 2004）によって乗算されます。 となっている栄養素や微量元素の生物学的利用能（例えば、N、P、Fe）の一次生産の速度を制限し、そのような炭素フラックスとして、水生システムを通じて、そしてこの過程でウイルス駆動型微生物の死亡率の役割を理解できることを考える海洋地球化学への関心の。いくつかの推定値は、現在（2009年、2008年、ヒギンズらロウら ）ウイルスが日常的に水の列に戻って養分の有意な濃度を放出示唆それが存在し、これらの要素が急速に微生物群集によって同化されること（Poorvin らら2004年、ミら、2005）。環境への養分フラックスの割合は、栄養素ごとのセル（&quot;クォータ&quot;と表記）の量によって破壊された細胞の数を乗じて求めることができます。この情報は、微生物食物網は、水系全体でどのように機能するかについての我々の理解に不可欠なコンポーネントを提供することができます。 継続的な開発：現在の努力の研究グループの一連では、コミュニティ内の特定のウイルスを列挙すると、次のような、ウイルスの活動によって影響を受けているどのように特定の微生物を決定するために上記の戦略を適応させる伴う。これを行うには、研究者は全体のウイルスのコミュニティの推定値に並行して特定のウイルスのグループや家族の存在量を推定する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）を使用してください。結果は、直接、特定のプランクトンのグループのためのウイルスの死亡率、栄養売上高などの推定値を提供するために適用されます。この強力な新しいアプローチは、今後数年間で研究者が実験室のシステムの制約を超えて特定のウイルス - 宿主の社会の相互作用を定量化するためにウイルスの生態学に関連するプロセスや、初めて、にはるかに深く掘ることができます。

<table><tbody><tr><td>2.5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>抗退色剤のストック溶液</td></tr><tr><td>Amicon Proflux M12 システム</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>このステップでは、任意の限外ろ過装置を使用可能</td></tr><tr><td>SYBR Green I 核酸ゲル染色剤</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>Helicon S10 30kDa フィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>Pelicon XL フィルター 0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>GE 0.2 &amp;mu;m PCTE メンブレンフィルター (47mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>Millipore ラボスケール接線流ろ過（TFF）システム</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>このステップでは、他のTFFシステムを使用可能</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m Micronstep セルロース製白色プレーンフィルター (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>GE Whatman 0.02 &amp;mu;m Anodisc フィルター (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA 顕微鏡</td><td></td><td></td><td>青色フィルターセットを備えた任意の蛍光顕微鏡を使用可能</td></tr><tr><td>20L ポリカーボネート製カーボイ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0.05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL クライオバイアル 外ネジ ポリプロピレン製</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>任意のクライオバイアルを使用可能</td></tr><tr><td>Corning 5 mL クライオバイアル 外ネジ ポリプロピレン製</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>任意のクライオバイアルを使用可能</td></tr><tr><td>85% H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>スパイラルメンブレンの保存用</td></tr><tr><td>NaOH ペレット</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>M12の洗浄用</td></tr><tr><td>メスシリンダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopore 0.8-&amp;mu;m 孔径メンブレンフィルター (142mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>Millipore ステンレス製圧力フィルターホルダー (142mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

水系でのウイルス産生率を予測

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

ウイルスは、海洋および淡水システムの広範な成分であり、微生物の死亡率の重要な薬剤であることが知られている。我々はその後、微生物群集の構造と機能の優れたモデルを開発するだけでなく、ウイルスが水生生物地球化学サイクルを変更する仕組みについての我々の理解を進めることができるように、このプロセスの定量的な推定を開発することが重要です。ウイルスの低減技術は、研究者は、ウイルス粒子が風土病微生物群集から放出される速度を見積もることができます。微生物群集が付近の周囲の濃度に維持しながら簡単に言えば、フリー（細胞外）ウイルスの存在量は、サンプルに低減されます。微生物群集は、その後、フリーのウイルスや落射蛍光顕微鏡または、特定のウイルスの場合で、定量的で定量化することができるウイルスサンプルの再発（コミュニティのすでに感染しているメンバーの溶解を通じて）レートの存在下でインキュベートするPCR。これらのレートは、その後、ウイル​​ス媒介細胞溶解に起因する微生物の死亡率を推定するために使用することができます。

海洋および淡水系におけるウイルスの離職率は低下し、再発の手法によって推定することができる。データは、研究者は、水系におけるウイルス媒介微生物の死亡率を推測することができます。

ウイルスは海洋および淡水系の至る所に存在する構成要素であり、微生物の死亡における重要な要因であることが知られている。定量的な手法を開発することは、...

この手順の全体的な目的は、水圏微生物コミュニティにおけるウイルスの産生速度を決定することです。まず、元々の微生物コミュニティを維持しながら、目的のサンプル中の遊離ウイルスの量を減少させることでこれを達成します。手順の第2ステップでは、特定の条件下でサンプルをインキュベートし、最大10時間まで2〜3時間ごとにサブサンプルを回収します。手順の第3ステップは、各タイムポイントで回収したサブサンプル内のウイルスを計数することです。手順の最終ステップでは、サンプル内でのウイルス粒子の存在量の増加率を算出し、ウイルス産生率を決定します。最終的に、計数結果から微生物コミュニティ内でウイルスが産生される速度が得られ、これにより研究者はウイルス活性による微生物の死亡率を推論することが可能になります。皆さん、こんにちは。私はオードリー・マディソンです。テネシー大学微生物学部のSteven Milham博士の研究室に所属しています。本日は、Charles BudoffとClaire Campbellの協力を得て、水圏システムにおけるウイルスの産生速度を分析する手順について説明します。この目的を達成するために、サンプル中の遊離ウイルスの数を減少させ、ウイルス感染した微生物の溶菌によってそれらが再出現する速度を定量します。現在、当研究室ではウイルスの生態や、ウイルスが微生物コミュニティをどのように形成するかを研究するためにこの手順を用いています。それでは、導入を終えましたので、実際に始めていきましょう。本手順を開始する前に、可能な限り無菌的に約20リットルの海水を採取します。サンプルを採取後、直径142 mmの0.8 µmフィルターで水をプレフィルターします。生物生産性の高い系では、あらかじめより大きな孔径のフィルターまたはガラス繊維フィルターでろ過を行う場合があります。超ろ過水を得るために、すべてのウイルスを除去できるスパイラル状膜カートリッジを備えたAmCon M 12システムなどの超ろ過システムを設置します。次に、最大速度の約25％、逆圧15～16 kPaの条件下で、サンプル中のウイルスを除去および濃縮します。得られた約500 mLの濃縮液には濃縮されたウイルス群が含まれており、これを他の研究用に保存し、ウイルス除去後の透過液をウイルス産生アッセイに使用します。フィルターカートリッジのメンブレンへの損傷を防ぐため、使用後は毎日Omicron M 12システムを洗浄してください。海水を使用する場合は、まず6 L以上のMilli Q水でメンブレンをすすぎ、続いて0.1 M水酸化ナトリウム溶液で30〜45分間洗浄します。その後、さらに6 L以上のMilli Q水でカートリッジをすすいでください。完了後、スパイラルカートリッジは0.05 molarのリン酸溶液中で4°Cで保存できます。ウイルス減少法を開始するには、ウイルスフリーウォーターを作成した場所と同じ場所から採取した500 millilitersの海水サンプルを、公称孔径0.2 microの低タンパク質結合フィルターを備えたステレオフィルターユニットに入れます。この時点で、開始時の水中に含まれるウイルスと細菌の総量を決定するためのサブサンプルも採取してください。滅菌転送ピペットを用いてサンプルを絶えず再懸濁させ、細菌細胞がフィルター上に濃縮されるのを防ぎながら、200 mmHg 未満の圧力で緩やかに真空加圧します。次に、細菌集団の密度を一定に保ちつつ、サンプル中の遊離ウイルスの量を減少させるため、細菌懸濁液に 500 mL の超ろ過液を3倍量ずつゆっくりと加えます。最後に、細菌画分をウイルス除去超ろ過水で 500 mL に希釈して戻します。その後、これを 150 mL ずつ3つの反復試料に分注し、透明な 250 mL ポリカーボネートボトルに入れます。これがタイムゼロのサンプルセットとなります。タイムゼロのサンプルから、細菌およびウイルスの定量のためのサンプルを採取してください。これらのサンプルを、最終濃度が2.0〜2.5%の滅菌グルタラールアルデヒドとなるようにクライオバイアルに移します。固定剤として、これらのサンプルを液体窒素で直ちに急速冷凍し、処理まで−80°Cで保存します。あるいは、タンジェンシャルフローろ過（TFF）システムを用いて海洋微生物を濃縮することも可能です。TFF法を用いる場合は、天然サンプルを約500 mL用意してください。ウイルス減少法の説明に従い、超ろ過済みウイルスフリー水を用いて細菌画分が約 10 to 15 milliliters になるまで、公称孔径 0.2 micron のタンジェンシャルフローろ過システムでこのサンプルを濃縮し、得られた複製ボトルを現場条件でインキュベートします。SEAの環境チャンバーでは、周囲温度を維持する表層水供給装置に接続された流動海水インキュベーターを使用しています。光レベルは、青色着色アクリルまたはニュートラル密度スクリーンネットを使用して光強度を下げることで、表層条件に合わせることができます。フィールドステーションや研究室で作業する場合、または海水が利用できない場合は、照明付きの培養インキュベーターを使用できます。0時間目のサンプルに対して行った方法と同様に、少なくとも10時間は2.5時間ごとにサブサンプルを採取し続けてください。また、研究者によっては、特定のウイルスの定量PCR分析用に水を採取する場合もあります。qPCRサンプルについては、固定剤を含まないクライオバイアルにサンプルを5 mL加え、ウイルス産生顕微鏡観察の準備として、直ちに液体窒素で急速冷凍します。凍結サンプルは氷上で融解させ、書面によるプロトコルに従って溶液を調製してください。次に、孔径0.02 µm、直径25 mmのディスクフィルターを、0.45 µmのセルロース製バッキングフィルターの上に配置します。その後、固定したサンプル850 µLをアナディフィルターの上に追加し、完全に乾燥するまで20 kPa未満の圧力で吸引ろ過を行います。アノディスクフィルターが乾燥したら、サイバーグリーン（CYBER Green）作業溶液 100 µL を滅菌ペトリ皿にピペッティングします。真空状態を維持したまま、フィルタータワーからアノディスクを慎重に取り出し、サイバーグリーンの上に置きます。サンプルを室温の暗所で 20 分間インキュベートします。サイバーグリーン溶液からフィルターを慎重に取り出し、フィルターの背面をキムワイプで吸い取るように拭いて、残留した染料をすべて除去します。次に、顕微鏡スライドにAntifa溶液を少量滴下し、その上にカバーガラスを載せます。カバーガラスを取り除き、乾燥させたフィルターを顕微鏡スライド上に配置します。再度、少量のAntifa溶液をカバーガラスに加え、気泡が入らないように注意しながらフィルターの上にゆっくりと載せます。蛍光顕微鏡とワイドブルーフィルターを用いてウイルスの計数を行い、各フィルターにつき少なくとも20視野をカウントします。この際、フィルター膜全体にウイルスが均一に分布していることを確認するため、各フィールドグリッドから全ウイルス数を定量してください。3つの独立した反復試行からウイルスの再出現率の平均値を算出し、生産率から標準偏差を求めます。最後に、開始時の菌数からウイルス減少サンプル中の希釈後の菌数までの微生物の希釈率に基づいて、これらの率を補正します。本研究から得られた主要なデータセットは、培養サブサンプルにおけるウイルスの存在量の回帰率です。これらの結果は、各サンプルについて、ウイルスの存在量に対する時間の独立した回帰曲線を形成します。ウイルス様粒子の産生は、in situ 条件下での10時間の培養にわたり、エピ蛍光顕微鏡を用いてモニタリングされました。これらのサンプルは、2008年9月にニュージーランド沖で発生した植物プランクトンのブルーム（大増殖）時に採取されました。これまで、ウイルス生産速度の推定方法について説明しました。これには、異なる限外ろ過システムの利用や、ウイルス生産速度を測定するための実験の実施が含まれます。また、エピ蛍光顕微鏡を用いてこれらのウイルスを数え上げる方法について説明しました。この手順を行う際は、清潔な器具を使用すること、染色したウイルスを適切に扱うこと、光を遮断して迅速にサンプルを処理すること、そして使用後に必ず超ろ過カートリッジを適切に洗浄することを忘れないでください。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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