水系でのウイルス産生率を予測

この手順の全体的な目的は、水圏微生物コミュニティにおけるウイルスの産生速度を決定することです。まず、元々の微生物コミュニティを維持しながら、目的のサンプル中の遊離ウイルスの量を減少させることでこれを達成します。手順の第2ステップでは、特定の条件下でサンプルをインキュベートし、最大10時間まで2〜3時間ごとにサブサンプルを回収します。

手順の第3ステップは、各タイムポイントで回収したサブサンプル内のウイルスを計数することです。手順の最終ステップでは、サンプル内でのウイルス粒子の存在量の増加率を算出し、ウイルス産生率を決定します。最終的に、計数結果から微生物コミュニティ内でウイルスが産生される速度が得られ、これにより研究者はウイルス活性による微生物の死亡率を推論することが可能になります。

皆さん、こんにちは。私はオードリー・マディソンです。テネシー大学微生物学部のSteven Milham博士の研究室に所属しています。本日は、Charles BudoffとClaire Campbellの協力を得て、水圏システムにおけるウイルスの産生速度を分析する手順について説明します。

この目的を達成するために、サンプル中の遊離ウイルスの数を減少させ、ウイルス感染した微生物の溶菌によってそれらが再出現する速度を定量します。現在、当研究室ではウイルスの生態や、ウイルスが微生物コミュニティをどのように形成するかを研究するためにこの手順を用いています。それでは、導入を終えましたので、実際に始めていきましょう。

本手順を開始する前に、可能な限り無菌的に約20リットルの海水を採取します。サンプルを採取後、直径142 mmの0.8 µmフィルターで水をプレフィルターします。生物生産性の高い系では、あらかじめより大きな孔径のフィルターまたはガラス繊維フィルターでろ過を行う場合があります。

超ろ過水を得るために、すべてのウイルスを除去できるスパイラル状膜カートリッジを備えたAmCon M 12システムなどの超ろ過システムを設置します。次に、最大速度の約25％、逆圧15～16 kPaの条件下で、サンプル中のウイルスを除去および濃縮します。得られた約500 mLの濃縮液には濃縮されたウイルス群が含まれており、これを他の研究用に保存し、ウイルス除去後の透過液をウイルス産生アッセイに使用します。

フィルターカートリッジのメンブレンへの損傷を防ぐため、使用後は毎日Omicron M 12システムを洗浄してください。海水を使用する場合は、まず6 L以上のMilli Q水でメンブレンをすすぎ、続いて0.1 M水酸化ナトリウム溶液で30〜45分間洗浄します。その後、さらに6 L以上のMilli Q水でカートリッジをすすいでください。

完了後、スパイラルカートリッジは0.05 molarのリン酸溶液中で4°Cで保存できます。ウイルス減少法を開始するには、ウイルスフリーウォーターを作成した場所と同じ場所から採取した500 millilitersの海水サンプルを、公称孔径0.2 microの低タンパク質結合フィルターを備えたステレオフィルターユニットに入れます。この時点で、開始時の水中に含まれるウイルスと細菌の総量を決定するためのサブサンプルも採取してください。

滅菌転送ピペットを用いてサンプルを絶えず再懸濁させ、細菌細胞がフィルター上に濃縮されるのを防ぎながら、200 mmHg 未満の圧力で緩やかに真空加圧します。次に、細菌集団の密度を一定に保ちつつ、サンプル中の遊離ウイルスの量を減少させるため、細菌懸濁液に 500 mL の超ろ過液を3倍量ずつゆっくりと加えます。最後に、細菌画分をウイルス除去超ろ過水で 500 mL に希釈して戻します。その後、これを 150 mL ずつ3つの反復試料に分注し、透明な 250 mL ポリカーボネートボトルに入れます。

これがタイムゼロのサンプルセットとなります。タイムゼロのサンプルから、細菌およびウイルスの定量のためのサンプルを採取してください。これらのサンプルを、最終濃度が2.0〜2.5%の滅菌グルタラールアルデヒドとなるようにクライオバイアルに移します。

固定剤として、これらのサンプルを液体窒素で直ちに急速冷凍し、処理まで−80°Cで保存します。あるいは、タンジェンシャルフローろ過（TFF）システムを用いて海洋微生物を濃縮することも可能です。TFF法を用いる場合は、天然サンプルを約500 mL用意してください。

ウイルス減少法の説明に従い、超ろ過済みウイルスフリー水を用いて細菌画分が約 10 to 15 milliliters になるまで、公称孔径 0.2 micron のタンジェンシャルフローろ過システムでこのサンプルを濃縮し、得られた複製ボトルを現場条件でインキュベートします。SEAの環境チャンバーでは、周囲温度を維持する表層水供給装置に接続された流動海水インキュベーターを使用しています。光レベルは、青色着色アクリルまたはニュートラル密度スクリーンネットを使用して光強度を下げることで、表層条件に合わせることができます。

フィールドステーションや研究室で作業する場合、または海水が利用できない場合は、照明付きの培養インキュベーターを使用できます。0時間目のサンプルに対して行った方法と同様に、少なくとも10時間は2.5時間ごとにサブサンプルを採取し続けてください。また、研究者によっては、特定のウイルスの定量PCR分析用に水を採取する場合もあります。

qPCRサンプルについては、固定剤を含まないクライオバイアルにサンプルを5 mL加え、ウイルス産生顕微鏡観察の準備として、直ちに液体窒素で急速冷凍します。凍結サンプルは氷上で融解させ、書面によるプロトコルに従って溶液を調製してください。次に、孔径0.02 µm、直径25 mmのディスクフィルターを、0.45 µmのセルロース製バッキングフィルターの上に配置します。その後、固定したサンプル850 µLをアナディフィルターの上に追加し、完全に乾燥するまで20 kPa未満の圧力で吸引ろ過を行います。

アノディスクフィルターが乾燥したら、サイバーグリーン（CYBER Green）作業溶液 100 µL を滅菌ペトリ皿にピペッティングします。真空状態を維持したまま、フィルタータワーからアノディスクを慎重に取り出し、サイバーグリーンの上に置きます。サンプルを室温の暗所で 20 分間インキュベートします。

サイバーグリーン溶液からフィルターを慎重に取り出し、フィルターの背面をキムワイプで吸い取るように拭いて、残留した染料をすべて除去します。次に、顕微鏡スライドにAntifa溶液を少量滴下し、その上にカバーガラスを載せます。カバーガラスを取り除き、乾燥させたフィルターを顕微鏡スライド上に配置します。

再度、少量のAntifa溶液をカバーガラスに加え、気泡が入らないように注意しながらフィルターの上にゆっくりと載せます。蛍光顕微鏡とワイドブルーフィルターを用いてウイルスの計数を行い、各フィルターにつき少なくとも20視野をカウントします。この際、フィルター膜全体にウイルスが均一に分布していることを確認するため、各フィールドグリッドから全ウイルス数を定量してください。3つの独立した反復試行からウイルスの再出現率の平均値を算出し、生産率から標準偏差を求めます。最後に、開始時の菌数からウイルス減少サンプル中の希釈後の菌数までの微生物の希釈率に基づいて、これらの率を補正します。

本研究から得られた主要なデータセットは、培養サブサンプルにおけるウイルスの存在量の回帰率です。これらの結果は、各サンプルについて、ウイルスの存在量に対する時間の独立した回帰曲線を形成します。ウイルス様粒子の産生は、in situ 条件下での10時間の培養にわたり、エピ蛍光顕微鏡を用いてモニタリングされました。

これらのサンプルは、2008年9月にニュージーランド沖で発生した植物プランクトンのブルーム（大増殖）時に採取されました。これまで、ウイルス生産速度の推定方法について説明しました。これには、異なる限外ろ過システムの利用や、ウイルス生産速度を測定するための実験の実施が含まれます。

また、エピ蛍光顕微鏡を用いてこれらのウイルスを数え上げる方法について説明しました。この手順を行う際は、清潔な器具を使用すること、染色したウイルスを適切に扱うこと、光を遮断して迅速にサンプルを処理すること、そして使用後に必ず超ろ過カートリッジを適切に洗浄することを忘れないでください。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。