Name: 緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ HIV陽性細胞の検出法。Rev依存性レンチウイルスベクターとGFPを用いて、ヒトCD4陽性T細胞内のHIV-1複製をフローサイトメトリーで特定します。治療応用への可能性も示唆されます。

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作業は、NIAIDからYWの公衆衛生サービス助成金1R01AI081568でとM.ローゼンと2日目（株）主催の2009 NYCDCエイズライドのドナーとライダーの寛大な寄付によって部分的にサポートされていました

1。 REV -依存性のウイルス粒子の生産のためのプラスミドのトランスフェクションセットアップ：REV -依存GFPレンチウイルスベクター、PNL - GFP - RRE - SAは、以前に4,5,6に記載した。ウイルス粒子にアセンブルするために、プラスミドは、HIV - 1のパッケージ構造、pCMVΔ8.2（親切に先生Dider Tronoで提供される）、およびVSV - Gの糖タンパク質を（pHCMV - G）を有するプラスミドとHEK293 T細胞にcontransfectedした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法を用いて行った。 バッファーの調製：10 × HBSは、（HEPES緩衝生理食塩水）Hepes緩衝5gを溶解して調製した、8塩化ナトリウムのg、100 mLの中のNa 2 HPO 4（無水）のKCl、ブドウ糖1gの、0.103グラムの0.37グラムH 2 O注しthe10 X HBSの1mLのアリコートにバッファと-20℃で保存トランスフェクションの時に、H 2 O（1:5希釈）で2 X HBSに10 × HBSを変換する、と7.05の間にpHを調整する- 7.12。 （10mLの2 × HBSのために、それは通常1MのNaOHの約50μLが必要です）。 0.22μmのミリポアフィルターを通過することで2X HBSバッファーを滅菌フィルタします。 CaCl 2のバッファは、最終濃度が2Mに10mMのHEPESでCaCl 2を溶解させることにより行われた。 5.8にpHを調整し、4でバッファとストアを滅菌フィルタ℃を手順： <ol><li> 100ミリメートルペトリ皿、および37℃で10mLのDMEM + 10％FBSで一晩細胞を成長° C、5％CO 2のトランスフェクションの1日前、シード2 × 10 6 HEK293T細胞。 </li><li>翌日、細胞からの上清を除去し、5 mLの新鮮なDMEM + 10％FBS、4時間連続的に培養細胞で置き換えてください。 </li><li> 5mLのポリスチレンチューブに480μL2X HBSバッファーを添加します。 </li><li>目の5 mLのポリスチレンチューブに480μLの合計量を60μL2M CaCl 2のバッファ、プラスミドDNA、およびトランスフェクションTEバッファー（1mMトリス、25mMのEDTA、pH8.0）を加える。各ペトリ皿の場合、プラスミドはPNL - GFP - RRE - SA、pCMVΔR8.37.5μgの、とpHCMV - Gの2.5 mgの10μgの割合で添加する必要があります。 </li><li> 2 X HBSのチューブにプラスミドDNA - CaCl 2の混合物の滴下を追加し、室温で30分間インキュベートする。微細な析出物が形成されます。 </li><li>細胞にピペットで滴下して混合物の960μLを加える。 37℃、一晩5％CO 2を 。 </li><li>翌日、上清を除去し、10mLの新鮮なDMEM + 10％FBSを追加し、連続して37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 </li><li>ポストトランスフェクション48時間後に、上清を除去し、50mLの滅菌チューブにそれを転送することにより、ウイルスを収穫。各ペトリ皿に新鮮な10mLの新鮮なDMEM + 10％FBSを追加し、一晩培養し続ける。 4でウイルス上清℃にて保存してください。 </li><li>上清を収集することで、72時間後にトランスフェクションで収穫を続ける。すべての上清を組み合わせ、そしてペレットに15分間500 × gで上清を遠心し、細胞の破片を取り除く。 </li><li>上清を0.22μmのミリポアフィルターを介して収集し、ろ過した。ウイルスは、さらにサイズ排除カラムを通して濃縮した。 </li></ol> 2。ウイルス粒子を集中し、ウイルス力価を決定する<ol><li>ウイルス粒子は、サイズ排除カラム（100,000 MWカットオフ、Centricoin）により濃縮した。ウイルス上清をカラムにロードされ、4 15分間℃で6000 × gで遠心分離した。 </li><li>濃縮されたウイルス上清を回収し、分注し、-80℃で保存した。 </li><li>ウイルス力価は、TNF -治療、HIV - 1陽性ジャケットの細胞株、J1.1 7の感染によって決定した。細胞を、1ml当たり2.5 × 10 5細胞（100mLの総容積）を96ウェルプレートで培養し、週のための希釈VNL - GFP - RRE - SAの100mLで感染させた。粒子の力価（TCID50）はリードおよびMuench 8の方法に従ってGFP陽性ウェルを計数することにより推定された。 </li></ol> 3。レンチウイルスパーティクルとマーキングHIV - 1陽性細胞、VNL - GFP - RRE - SA セットアップ：ヒトCD4 T細胞株、CEM - SSは、最初のHIV - 1を感染させた。 48時間後の感染では、細胞がレンチウイルス粒子、VN​​L - GFP - RRE - SAとの重複感染した。さらに2日間の重複感染に続いて、GFP陽性細胞はフローサイトメトリーによって分析した。対照として、HIV - 1感染CEM - SS細胞は同じVNL - GFP - RRE - SAに感染させた。唯一のHIV - 1感染CEM - SS細胞はGFP陽性細胞ではなく、HIV - 1感染CEM - SS細胞をもたらした。 手順： <ol><li>感染2時間前には、最終濃度4 mg / mlにpolybraneを追加。細胞をカウントし、各感染症のために2 × 10 5細胞を取る。 2時間HIV - 1 NL4 - 3の200 ngの（P24）で細胞を感染させる。 </li><li> 10分を300 × gで遠心分離により細胞を洗浄、再懸37 2 × 10 5細胞/ mL、そして文化℃、48時間に細胞。 </li><li>細胞をカウントし、VNL - GFP - RRE - SAでの感染あたり2 × 10 5細胞を取る。 37℃で一晩VNL - GFP - RRE - SAとインキュベート100 mLを加え。細胞を洗浄し、2 × 10 5細胞/ mLに懸濁します。 </li><li> 48時間後の重感染でフローサイトメトリー分析を行います。感染細胞をペレット化し、20分間室温でインキュベート500mLの1％paraformaldehede、中に再懸濁し、そしてその後FACスキャンアナライザー（ベクトンディッキンソン）で分析した。 </li></ol> 4。代表的な結果実験が正常に実行されている場合、コントロールに、GFP陽性細胞がHIV - 1感染CEM - SSで検出されず、一方で、かなりのGFPの人口は、フローサイトメーターによるHIV - 1感染CEM - SS細胞で検出されます。細胞。 実験が正常に実行されている場合、REV -依存レンチウイルスベクター、VNL - GFP - RRE - SAは、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現の測定により、細胞集団を生体内で複製HIVの非常に特異的な検出が可能になります。この例では、収穫されたCEM - SS細胞は、マウスCD24、HSAに対するPE標識ラットモノクローナル抗体で染色し、その後、HSAとGFP発現の両方のフローサイトメーターで分析。 <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ここで示したように、かなりのGFPの人口がVNL - GFP - RRE - SA（図1c）との重複感染HIV - 1感染細胞で検出された。対照的に、GFP陽性細胞はいずれのHIV - 1感染CEM - SS細胞にレンチウイルスの重複感染（図1a）またはレンチウイルスの重複感染によるHIV - 1感染細胞（図1b）なしでは検出されなかった。

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

以前開発されたTAT -依存性の発現ベクターと同様に、ここで説明するレブシステムは進化HIVプロセスの開発です。 REV -依存性を含めると、複製HIVの存在に大きく依存してLTRベースの発現ベクターをレンダリングします。ここに報告されたとして、このベクトルの応用、HIV -依存性レポーターのウイルスは、HIV陽性細胞を同定するために斬新なアプローチを提供しています。生きた細胞のベクトルの許可検査では、基本的または臨床的実験のための任意の遺伝子を発現し、擬似型付けされたレンチウイルスとして最も細胞の種類や組織へのアクセス権を持つことができる。

<table><tbody><tr><td>生物安全キャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;C 冷蔵庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;C 冷蔵庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> -80&amp;#x00B0;C 冷蔵庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞計数器</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>セロメーター&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞株</td><td>米国国立衛生研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS細胞株</td><td>アメリカ国立衛生研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat細胞株J1.1</td><td>アメリカ国立衛生研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM（ダルメクセル・イーグル培地）</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>高濃度FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>クローニングされたプロウイルスDNAを用いてHeLa細胞をトランスフェクションすることで調製した</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>pNL4-3のすべてのHIV ORFの完全欠損</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>pNL-GFP-RREへのHIV-1 A5およびD4の挿入</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>Dider Trono博士による提供</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10倍 HBS (Hepes緩衝生理食塩水)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1%パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mlファルコンチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>5mlラウンド底チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;Milliporeフィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;M Milliporeフィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>100mmペトリ皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除クロマトグラフィーカラム（分画分子量 100,000 MW）</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>2ml凍結保存チューブ</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL マイクロ遠心チューブ</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたhiv - 1陽性細胞の特定のマーキング

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

HIV -応答発現ベクターのほとんどは、HIVのプロモーター、長い末端反復（LTR）に基づいています。初期のHIVタンパク質に応答しながら、タット、LTRはまた、細胞の活性化状態へと統合が行われたローカルクロマチンの活性に応答する。これは、高いHIV -自主的な活動につながることができる、そしてHIV陽性細胞1,2,3をマークするLTRベースのレポーターの有用性が制限されています。ここで、我々は、タット応答LTR、REV -応答エレメントとHIVのスプライシング部位4,5,6を含む多数のHIVのDNA配列に加えて、所有している発現レンチウイルスベクターを構築した。ベクトルは、生きている細胞集団における複製HIVの非常に特異的な検出を可能にして、レンチウイルスレポーターのウイルスに組み込まれた。ベクトルの活動は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を測定した。ここに報告されたとして、このベクトルのアプリケーションは、HIV陽性細胞を識別するために、そのような現場 PCRやHIV抗原染色のような既存の方法、に新たな別のアプローチを提供しています。ベクターはまた、HIV陽性の細胞を標的とする基本的または臨床実験のために治療遺伝子を発現することができる。

我々はTAT -応答LTR、HIV - 1 TAT -とRev依存的にレポーター遺伝子の発現を調節することができるREV -応答エレメント（RRE）に加えて、所有しているレンチウイルスベクターを開発した。ベクトルは、GFPの発現を介して、生細胞における複製HIVの特異的検出を可能にする。

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

HIV応答性発現ベクターの多くは、HIVプロモーターであるロングターミナルリピート（LTR）に基づいています。これらはHIVの初期タンパク質であるTatに反応しますが、...

この手順の全体的な目的は、緑色蛍光タンパク質を搭載したHIV-1 Rev依存性レンチウイルスベクターを用いて、HIV陽性細胞を同定することです。これはまず、共導入（コトランスフェクション）によってRev依存性レンチウイルス粒子を産生させることで達成されます。手順の第2段階では、ヒトCD4 T細胞にHIV-1を感染させます。次に、HIV陽性のヒトCD4 T細胞に、GFP遺伝子を搭載したレンチウイルス粒子を超感染させます。最終ステップでは、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞を測定し、HIV陽性細胞を特定します。最終的に、フローサイトメトリーを通じてGFP陽性細胞の割合を示す結果を得ることができます。この技術の意義はHIV感染の治療へと広がります。なぜなら、rev依存性ベクターはHIV感染細胞に治療遺伝子を導入し、選択的に発現させることで、HIV陽性細胞の死滅を誘導できるためです。本手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチ・アシスタント・プロフェッサーが担当します。rev依存性レンチウイルス粒子を産生するため、HEK 293 T細胞に3種類のプラスミド（rev依存性GFPレンチウイルスベクター、HIV-1パッケージング構成要素、およびVSVG糖タンパク質を運ぶプラスミド）をトランスフェクションします。プラスミドのトランスフェクションの1日前までに、2 × 10⁶個のHEK 293 T細胞を10 mLの培地に播種しておきます。100 mmのペトリ皿を用いて、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩培養します。翌日、細胞の培養上清を5 mLの新鮮な培地と交換します。その後、37°C、5%二酸化炭素条件下で細胞をさらに4時間培養します。4時間のインキュベーションが終了する前に、トランスフェクション試薬を準備します。HEK 293 T細胞に、rev依存性GFPレンチウイルスベクター10 µg、HIV-1パッケージングコンストラクト7.5 µg、およびVSVG糖タンパク質2.5 µgの比率で3種類のプラスミドをトランスフェクションします。まず、3種類のプラスミドDNAを所望の比率でプレミックスします。次に、5 mLのポリスチレンチューブを2本用意します。1本目のチューブと2本目のチューブに、2倍濃度のHBSバッファーを480 µLずつ加えます。2 M 塩化カルシウム緩衝液 60 µL を加え、血漿 DNA とトランスフェクション緩衝液を合わせて全量 480 µL とします。次に、血漿 DNA と塩化カルシウムの混合液を、2× HPS チューブに滴下し、室温で 30 分間インキュベートします。微細な沈殿物が徐々に形成されます。次に、混合液960 µLすべてをピペットでHEK 2 9 3 T細胞に滴下します。37 °C、5% 二酸化炭素条件下で一晩インキュベートします。翌日、S上清を除去し、10 mLの新鮮な培地を加えます。細胞を再び37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。トランスフェクションから48時間後、上清を除去して50 mL滅菌チューブに移し、ウイルスを回収します。10 millilitersの新鮮な培地をペトリ皿に加え、一晩培養を継続します。ウイルス上清は4°Cで保存してください。トランスフェクションから72時間後に、再び上清を回収し、以前に回収した上清と合わせて収穫します。次に、S上清を500 ×gで15分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化して除去します。遠心分離後、S上清を回収して新しいチューブに移します。その後、上清を0.22 µmのミリポアフィルターでろ過します。ウイルスはサイズ排除カラムを用いてさらに濃縮されます。次に、ウイルス粒子を濃縮する手順を実演します。ウイルスの上清をサイズ排除カラムにロードし、4 °C、6,000 ×g で 15 分間遠心分離します。濃縮されたウイルスの上清を回収し、ウイルスタイターの決定用に約 100 µL を取り分けておきます。残りを分注し、-80 °Cで保存します。ウイルスタイターの決定は、本手順において最も重要な点の一つです。GFP VIRベクターを用いて細胞にスーパーインフェクションを誘導するには、より高い感染多重度が必要となります。フローサイトメトリーで検出可能なGFP陽性細胞の割合を算出し、ウイルスタイターを決定します。TNF処理を施したHIV-1陽性のJurkat細胞株に、ウイルスの上清を感染させます。これらのHIV-1陽性細胞を培養します。96ウェルプレートに、細胞密度2.5 × 10⁵ cells/mL、総量100 µLで播種します。HIV-1陽性細胞に感染させるため、Rev依存性レンチウイルス粒子の10倍段階希釈系列を6段階調製します。各ウェルの細胞に、希釈したウイルス液を100 µLずつ添加します。37 °CのCO₂インキュベーターで7日間培養します。粒子のタイターは、蛍光顕微鏡下でGFP陽性細胞を観察することで推定します。計算はReidおよびMUの方法に従って行い、GFP陽性ウェルが生じる希釈点をタイターとして決定します。rev依存性レンチウイルス粒子を用いて感染させたウェルの50%において、1つの陽性細胞が認められました。まず、ヒトCD4 T細胞株にHIV-1を感染させます。1回あたりの感染に使用する細胞数は2×10⁵個です。感染の2時間前に、細胞にpoly brainを最終濃度4 µg/mLとなるように添加します。37 °Cで2時間インキュベートします。次に、HIV溶液を5 mLチューブの1つにピペッティングし、細胞を感染させます。残りの2本の細胞チューブは感染させず、コントロールとして使用します。すべての細胞を37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、細胞を300 ×gで10分間遠心分離し、上清を捨てることで細胞外ウイルスを洗浄した後、細胞を新鮮な培地で2 × 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁し、37 °Cで48時間培養します。48時間後、HIV感染細胞が感染準備完了となります。rev依存性レンチウイルス粒子を用いて、100 µLのレンチウイルス粒子をHIV V1感染細胞に添加し、2×10⁵個の細胞で感染させます。コントロールとして、HIV V1非感染ヒトCD4 T細胞にも同様に100 µLのレンチウイルス粒子を感染させます。細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、翌日に処理を行います。使用済みの培地を新しい培地と交換し、細胞を2 × 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁します。感染から48時間後、遠心分離により細胞をペレット化し、500 µLの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁させます。再懸濁した細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメトリー解析を行います。室温で20分間インキュベートした後、FACScanアナライザーを用いてGFP陽性細胞を解析できます。実験が成功すれば、逆転写依存性レンチウイルスベクターV-N-L-G-F-P-R-R-E-S-Aを用いることで、緑色蛍光タンパク質GFPの発現を測定し、生存細胞集団における複製HIVを極めて特異的に検出することが可能になります。この例では、回収したC-E-M-S-S細胞を、マウスCD 24 HSAに対するPE標識ラットモノクローナル抗体で染色し、次に、ここで示すように、フローサイトメーターでHSAおよびGFPの両方の発現を解析しました。その結果、V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-Aを重複感染させたHIV 1感染細胞において、相当数のGFP陽性細胞集団が検出されました。対照的に、レンチウイルスによるスーパーインフェクションを行っていないHIV-1未感染C-E-M-S-S細胞、およびレンチウイルスによるスーパーインフェクションを行ったHIV-1未感染細胞のいずれにおいても、GFP陽性細胞は検出されませんでした。HIVを用いる操作は極めて危険であるため、本手順を実施する際は、バイオセーフティレベルに基づく実務上の予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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学ぶ HIV陽性細胞の検出法。Rev依存性レンチウイルスベクターとGFPを用いて、ヒトCD4陽性T細胞内のHIV-1複製をフローサイトメトリーで特定します。治療応用への可能性も示唆されます。

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

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