緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

この手順の全体的な目的は、緑色蛍光タンパク質を搭載したHIV-1 Rev依存性レンチウイルスベクターを用いて、HIV陽性細胞を同定することです。これはまず、共導入（コトランスフェクション）によってRev依存性レンチウイルス粒子を産生させることで達成されます。手順の第2段階では、ヒトCD4 T細胞にHIV-1を感染させます。

次に、HIV陽性のヒトCD4 T細胞に、GFP遺伝子を搭載したレンチウイルス粒子を超感染させます。最終ステップでは、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞を測定し、HIV陽性細胞を特定します。最終的に、フローサイトメトリーを通じてGFP陽性細胞の割合を示す結果を得ることができます。

この技術の意義はHIV感染の治療へと広がります。なぜなら、rev依存性ベクターはHIV感染細胞に治療遺伝子を導入し、選択的に発現させることで、HIV陽性細胞の死滅を誘導できるためです。本手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチ・アシスタント・プロフェッサーが担当します。rev依存性レンチウイルス粒子を産生するため、HEK 293 T細胞に3種類のプラスミド（rev依存性GFPレンチウイルスベクター、HIV-1パッケージング構成要素、およびVSVG糖タンパク質を運ぶプラスミド）をトランスフェクションします。プラスミドのトランスフェクションの1日前までに、2 × 10⁶個のHEK 293 T細胞を10 mLの培地に播種しておきます。

100 mmのペトリ皿を用いて、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩培養します。翌日、細胞の培養上清を5 mLの新鮮な培地と交換します。

その後、37°C、5%二酸化炭素条件下で細胞をさらに4時間培養します。4時間のインキュベーションが終了する前に、トランスフェクション試薬を準備します。HEK 293 T細胞に、rev依存性GFPレンチウイルスベクター10 µg、HIV-1パッケージングコンストラクト7.5 µg、およびVSVG糖タンパク質2.5 µgの比率で3種類のプラスミドをトランスフェクションします。

まず、3種類のプラスミドDNAを所望の比率でプレミックスします。次に、5 mLのポリスチレンチューブを2本用意します。1本目のチューブと2本目のチューブに、2倍濃度のHBSバッファーを480 µLずつ加えます。

2 M 塩化カルシウム緩衝液 60 µL を加え、血漿 DNA とトランスフェクション緩衝液を合わせて全量 480 µL とします。次に、血漿 DNA と塩化カルシウムの混合液を、2× HPS チューブに滴下し、室温で 30 分間インキュベートします。

微細な沈殿物が徐々に形成されます。次に、混合液960 µLすべてをピペットでHEK 2 9 3 T細胞に滴下します。37 °C、5% 二酸化炭素条件下で一晩インキュベートします。

翌日、S上清を除去し、10 mLの新鮮な培地を加えます。細胞を再び37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。トランスフェクションから48時間後、上清を除去して50 mL滅菌チューブに移し、ウイルスを回収します。

10 millilitersの新鮮な培地をペトリ皿に加え、一晩培養を継続します。ウイルス上清は4°Cで保存してください。トランスフェクションから72時間後に、再び上清を回収し、以前に回収した上清と合わせて収穫します。

次に、S上清を500 ×gで15分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化して除去します。遠心分離後、S上清を回収して新しいチューブに移します。その後、上清を0.22 µmのミリポアフィルターでろ過します。

ウイルスはサイズ排除カラムを用いてさらに濃縮されます。次に、ウイルス粒子を濃縮する手順を実演します。ウイルスの上清をサイズ排除カラムにロードし、4 °C、6,000 ×g で 15 分間遠心分離します。濃縮されたウイルスの上清を回収し、ウイルスタイターの決定用に約 100 µL を取り分けておきます。

残りを分注し、-80 °Cで保存します。ウイルスタイターの決定は、本手順において最も重要な点の一つです。GFP VIRベクターを用いて細胞にスーパーインフェクションを誘導するには、より高い感染多重度が必要となります。

フローサイトメトリーで検出可能なGFP陽性細胞の割合を算出し、ウイルスタイターを決定します。TNF処理を施したHIV-1陽性のJurkat細胞株に、ウイルスの上清を感染させます。これらのHIV-1陽性細胞を培養します。

96ウェルプレートに、細胞密度2.5 × 10⁵ cells/mL、総量100 µLで播種します。HIV-1陽性細胞に感染させるため、Rev依存性レンチウイルス粒子の10倍段階希釈系列を6段階調製します。各ウェルの細胞に、希釈したウイルス液を100 µLずつ添加します。37 °CのCO₂インキュベーターで7日間培養します。

粒子のタイターは、蛍光顕微鏡下でGFP陽性細胞を観察することで推定します。計算はReidおよびMUの方法に従って行い、GFP陽性ウェルが生じる希釈点をタイターとして決定します。rev依存性レンチウイルス粒子を用いて感染させたウェルの50%において、1つの陽性細胞が認められました。

まず、ヒトCD4 T細胞株にHIV-1を感染させます。1回あたりの感染に使用する細胞数は2×10⁵個です。感染の2時間前に、

細胞にpoly brainを最終濃度4 µg/mLとなるように添加します。37 °Cで2時間インキュベートします。次に、HIV溶液を5 mLチューブの1つにピペッティングし、細胞を感染させます。

残りの2本の細胞チューブは感染させず、コントロールとして使用します。すべての細胞を37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、細胞を300 ×gで10分間遠心分離し、上清を捨てることで細胞外ウイルスを洗浄した後、細胞を新鮮な培地で2 × 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁し、37 °Cで48時間培養します。

48時間後、HIV感染細胞が感染準備完了となります。rev依存性レンチウイルス粒子を用いて、100 µLのレンチウイルス粒子をHIV V1感染細胞に添加し、2×10⁵個の細胞で感染させます。コントロールとして、HIV V1非感染ヒトCD4 T細胞にも同様に100 µLのレンチウイルス粒子を感染させます。細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、翌日に処理を行います。

使用済みの培地を新しい培地と交換し、細胞を2 × 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁します。感染から48時間後、遠心分離により細胞をペレット化し、500 µLの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁させます。再懸濁した細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメトリー解析を行います。室温で20分間インキュベートした後、FACScanアナライザーを用いてGFP陽性細胞を解析できます。

実験が成功すれば、逆転写依存性レンチウイルスベクターV-N-L-G-F-P-R-R-E-S-Aを用いることで、緑色蛍光タンパク質GFPの発現を測定し、生存細胞集団における複製HIVを極めて特異的に検出することが可能になります。この例では、回収したC-E-M-S-S細胞を、マウスCD 24 HSAに対するPE標識ラットモノクローナル抗体で染色し、次に、ここで示すように、フローサイトメーターでHSAおよびGFPの両方の発現を解析しました。その結果、V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-Aを重複感染させたHIV 1感染細胞において、相当数のGFP陽性細胞集団が検出されました。

対照的に、レンチウイルスによるスーパーインフェクションを行っていないHIV-1未感染C-E-M-S-S細胞、およびレンチウイルスによるスーパーインフェクションを行ったHIV-1未感染細胞のいずれにおいても、GFP陽性細胞は検出されませんでした。HIVを用いる操作は極めて危険であるため、本手順を実施する際は、バイオセーフティレベルに基づく実務上の予防措置を常に講じることを忘れないでください。