ミトコンドリアは密結合のラットの心臓の準備

Dr.Skaです。今日は、赤い心臓のミトコンドリアを分離する方法を紹介します。組織からミトコンドリアを単離する際の重要なステップは、まず機械的または酵素的処理によって組織と細胞を破壊することです。

第二に、低速での示差遠心分離により、破片や壊れた細胞や核を除去します。そして第三に、ミトコンドリアを収集するためのより高速な遠心分離。機器と溶液は、事前に冷蔵室で準備され、保管されていました。

隔離中は、いくつかの条件を維持する必要があります。まず、ミトコンドリアはミトコンドリアの収量に直接影響するため、組織を徹底的に破壊します。次に、すべてのステップで温度を低く保ちますが、特に遠心分離中は、溶液を過度に凍結しないように注意してください。

第三に、操作が速くなればなるほど、得られるミトコンドリアの品質が向上します。動物は英国動物科学手続き法に従って終了し、以下のすべての操作は冷蔵室で行われました。40ミルの洗浄バッファーを含む3つのビーカーを準備します。

これを氷売りのお風呂で3〜5分間冷やしてから、次のステップに進みます。それらを過度に凍結しないように注意し、氷の結晶の雲が急速に現れ始めた直後に使用し、斬首された赤の胸部を開き、心臓を抽出します。小さな切開を行い、その後すぐに心臓を氷冷溶液に移します。

最初のビーカーでは、心臓を絞って血液を取り出し、2番目のビーカーに入れます。各心臓に対してこの操作を繰り返します。切除した心臓の急速な冷却と洗浄は、ヘモグロビンや赤血球、アダスを含まない標準的な調製物を得るために不可欠です。

濾紙でハートを乾かします。すべての脂肪、凝固した血液を速く動脈を取り除きます。そして、心室組織を引っ張ります。

次に、ペトリ皿に小さな湾曲したハサミでティッシュを引っ張ることを意味します5分間、MITのティッシュをティッシュに入れます。を押して通過させます。ティッシュプレス後、50mlの洗浄バッファーとステアで材料をビーカーに移します。

次に、アイランドフィルターでサスペンションをろ過します。フィルターの上の男性用ティッシュを洗浄バッファーで3回洗い、フィルターを廃棄します。洗浄ティッシュを20ミルの洗浄バッファーに移し、磁気外装の氷浴に入れます。

一定のステアリングの下で溶液にトリップを追加し、インキュベーションの4分でタイマーを開始します。懸濁液を少しずつ、緩く取り付けた小型のガラス製テフロンホモジナイザーを使用して、少しずつ簡単に均質化しました。均質化後、懸濁液を2番目のステアで別のビーカーに移します。

この手順を9分目に繰り返して、2回目の均質化の後に合計2回均質化を行います。インキュベーションの15分目に、トリプシン阻害剤を含む分離バッファー10mlを加え、さらに1分間インキュベートし、ナイロンフィルターで懸濁液を再度ろ過します。しかし、その場合は、濾液を保存し、残りの組織をホモジナイザーに移して均質化します。

さらに1分間、ホモジネートと濾液を遠心分離チューブで混合します。チューブのバランスが均等に保たれていることを確認し、低速遠心分離を15分間行います。600 Gで、得られた上清を新しい遠心分離チューブに慎重にろ過します。

ペレットによる汚染を避け、8、500 G.After高速遠心分離後、上澄みを捨て、白いふわふわの外縁層を捨てようとする緩衝液でペレットをすすぎ、8、500 Gで再度遠心分離してください。アイソレーションバッファのオスを1つ追加します。チューブを左右に傾け、バッファーの残りの部分を取り外します。

底部の赤血球の赤い斑点を避けようとしているulaでペレットを分解し、小さなホモジナイザーでペレットを懸濁するか、または穏やかなineで、懸濁液をより分離する緩衝液で希釈し、8、500 G.Discardで15分間再び遠心分離しますS上清Resusを廃棄します。Resus懸濁緩衝液でペレットを懸濁し、8, 500 G.Theで再度遠心分離機に、得られた茶色のペレットは洗浄された無傷のミトコンドリアを含んでいます。Resusは、非常に少量のresus懸濁バッファーにペレットを懸濁します。

使用する量が少ないほど、ミトコンドリアの調製はより安定します。通常、心臓あたり1つの200マイクロリットルのバッファーで十分です。調製されたミトコンドリアの予想収量は、心臓あたり約10〜15ミリグラムのミトコンドリアタンパク質です。

そして、そのような調製物の複雑な1つの基質上の呼吸制御比は、8〜12であるべきです。あなたの準備に幸運を祈ります。