細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

本実験の全体的な目的は、植物の表皮における蛍光タグ付きタンパク質の細胞間移動の程度を解析することです。これは、目的の融合タンパク質を植物表皮に一過性に発現させるために、DNAをコーティングした金粒子を用意することで達成されます。第2段階として、DNAを植物表皮に導入し、これにより試験対象の融合タンパク質の発現と移動を可能にします。

次に、蛍光タグ付きの試験タンパク質の発現と局在をモニタリングするため、発現させた融合タンパク質を共焦点顕微鏡で観察します。共焦点顕微鏡による蛍光シグナルの分布解析に基づき、蛍光タグ付きタンパク質の細胞間輸送の程度を示す結果が得られます。こんにちは、私はニューヨーク州立大学ストーニーブルック校 生化学・細胞生物学部のKY研究室のBen Myersです。

本日は、植物の表皮における細胞間移動、または蛍光標識タンパク質の移動範囲を解析する手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて、さまざまな植物系統における植物ウイルス移動タンパク質の細胞間輸送を研究したり、異なる種類のタンパク質の細胞間移動能を比較したりしています。それでは、始めていきましょう。

本プロトコルを開始するために、まずPromix bxでシロイヌナズナを1株育てます。適切なサイズのポットを使用し、短日条件および相対湿度40〜65%に制御された環境チャンバーで育成してください。ニコチアナ・ハマナおよびタバコの植物については、より大きなポットのPromix BXで各個体を育てます。同様に、長日条件および相対湿度40〜65%に制御された環境チャンバーを提供してください。

既述の通り、市販の製品を用いて適宜植物に施肥します。Opsisの植物を6～8週間育成した後、サイズが15 millimeter × 35 millimeter以上の葉を実験用に選別します（長さの測定にはpeoleを含みます）。n benannaおよびNACの植物については、7～10週間育成してください。その後、end benannaについては50 millimeter × 70 millimeter以上、nacについては100 millimeter × 125 millimeter以上の葉を選別します。

これらのケースでは、長さの測定にペオレ（peole）は含まれません。BICによるDNAコーティング微粒子の導入を開始する前に、既報の通り詳細にDNAコーティング金微粒子を用いてジーンガンカートリッジを準備します。次に、鋭利なカミソリ刃で同じ発達段階の葉を切り取り、AAL側を上にして直ちに平らな発泡スチロール表面に置きます。

葉のABA側は、トリコーム密度が低くクチクラ層が薄いため、パーティクル銃法におけるより優れた基質となります。Raphanus sativusのような小さな葉は、窓用スクリーンメッシュで覆い、そのメッシュをプッシュピンで発泡スチロールの表面に固定することで固定できます。パーティクルの導入効率を高め、マイクロボンバードメント中の組織への損傷を最小限に抑えるため、葉は平らに保ってください。

次に、DNAコーティングしたマイクロパーティクルが入ったカートリッジをガンに挿入します。ウサギの眼球の場合、0.6 micronのマイクロパーティクルを用いて、140から160 PSIの圧力で射出を行います。

葉1枚につき1つのカートリッジを使用し、直径10～12 mmの表面積にマイクロパーティクルを分散させるようにサンプルをbombardします。end benannaおよびend baumの場合、また、より大きなend benannaおよびend tobaccoの葉を用いて0.6 micronのマイクロパーティクルを使用する場合は、160～180 PSIの圧力でshootingを行ってください。

同一の葉に対して複数回の粒子銃照射を行うことが可能ですが、同じ発達段階にある葉の領域を標的とするため、中脈の両側に対称的な位置で実施する必要があります。一過性に発現したタグ付きタンパク質の蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡で可視化します。試験する各タンパク質の検出に最適な顕微鏡設定を見つけるよう注意してください。

タバコモザイクウイルス移動タンパク質（T-M-V-M-P）の原形質膜への局在のように、シグナル強度が弱く細胞内蓄積が限定的なタンパク質を観察する場合は、40倍の対物レンズを使用します。これにより、より高い解像度と向上した感度が得られます。一方、遊離黄色蛍光タンパク質（YFP）のように、シグナル強度が高く細胞質に分布するタンパク質をより迅速にイメージングする場合は、共焦点ズーム機能を備えた10倍の対物レンズを使用できます。蛍光シグナルを含む多細胞クラスターの出現から、単純な輸送が行われていることが推測されます。

このようなクラスターの数および各クラスター内の細胞数は、細胞間輸送の程度を示す指標となります。信頼性の高いデータを得るために、実験系あたり少なくとも100個の発現クラスターを記録し、実験は同時に行うように注意してください。

比較を行う際の手順について説明します。ここでは、蛍光タグ付きタンパク質の単純な輸送を検出しました。TMV mp YFP発現コンストラクトをハナマナの葉の先端にマイクロボンバードメントした後に得られた、代表的な共焦点画像を示します。

YFP信号の多細胞クラスターの出現に基づき、TMV MP YFPの単純な移動が観察されます。しかしながら、一部のマイクロボンバードメントにおいて、単一細胞の信号が見られることから、一過性に発現したすべてのTMV MP YFPが移動できるわけではないことが示されています。

統計的に、カウントされたシグナルのクラスターの40%未満において、TMV MP YFPは細胞間を移動できませんでした。一方、60%以上のクラスターでは、タンパク質が2個から5個の細胞間で移動しています。2細胞への拡散が最も頻繁に見られたことから、固有の移動活性を持たない比較的分子サイズの小さいタンパク質は、原形質連絡（SMA）を通じて拡散し、細胞間を移動できると考えられます。

例えば、遊離YFPまたは1つのXYFPは、複数の細胞間およびカウントされたクラスターの30%以上に拡散します。対照的に、翻訳されたYFPダイマーまたは2つのXYFPではこのような非特異的拡散は起こらず、これはTMV MP YFP融合タンパク質と同等のサイズであり、完全に細胞自律的です。以上で、ジーンガンシステムを用いた植物表皮への一過性発現により、蛍光タグ付きタンパク質の細胞間移動を解析する方法について説明しました。

本手順を実施する際は、健全で強健な植物を準備すること、DNA導入用に高品質なDNAコーティング金粒子を用意すること、そして統計的に信頼できる結果を得るために十分な数の発現クラスターを解析することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。