Name: マウスの眼から網膜幹細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶマウス眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を単離し、血清フリー培地で培養してクローン球を形成する方法。再生医療や網膜疾患治療への応用が期待されます。

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私たちは、彼女の貴重な援助のためにローラクラークに感謝。幹細胞ネットワーク、CIHRとNIH：この作品は、NCEによってサポートされています。

1。解剖ソリューションと酵素液を準備する<ol><li>事前に人工脳脊髄液（ACSF）と無血清培地を作成し、冷蔵。 </li><li>キヌレン酸（0.2 mg / mL）を秤量し、それが容易に溶解しないので、事前に37℃の水浴中でヒロACSFを10 mLに溶かす。 </li><li>トリプシン（1.33 mg / mLの）とヒアルロニダーゼ（0.67 mg / mLの）一、15 mLの試験管内の場所を秤量し、必要になるまで-20℃で保管してください。このチューブにキヌレン酸のソリューションを追加し、使用直前に22μmのシリンジフィルターを使用してフィルタ。 </li><li>トリプシンインヒビター（Ovamucoid：1 mg / mL）を秤量し、22μmのシリンジフィルターを使用して暖かい無血清培地とフィルターで溶解する。 </li><li> FGF2（10 ng / ml）およびヘパリン（2μg/ mL）を含む無血清培地：メッキのメディアを作成します。 </li></ol> 2。マウスの眼から網膜幹細胞を単離する<ol><li>網膜幹細胞の単離は、初代培養の実験に特化した特定の無菌室で行われます。この手順を開始する前に、滅菌解剖器具をレイアウトして解剖顕微鏡と冷光源を設定し、。それぞれのフードには、ステップ間の楽器を滅菌するためのホットビーズ滅菌器を持っています。 </li><li>我々は、承認された動物の倫理のプロトコルに従って屠殺したマウスからそれを除去した後、人工脳脊髄液（ACSF）を含む滅菌ペトリ皿にすぐに配置されている眼から網膜幹細胞を分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下で、鉗子で目を洗浄：髪の毛と角膜/強膜の境界線に接続されている結合組織を取り除く。その後、ACSFを使用して新しい料理に目を移す。 </li><li>優しく鋸歯鉗子で固定目を押さえながら、眼筋を除去するために角度付きのマイクロ解剖ハサミを使う。それがまだ目に添付されている場合だけでなく、視神経を削除します。このプロセス中に目をつぶししないようにしてください。 ACSFを使用して新しい料理に目を移す。 </li><li>次の使用は、はさみが半分に目をカットするためのマイクロ解剖湾曲：カットが開始された視神経を振り返っ満たし、角膜の中央を通る視神経とカットから始まります。これは次のステップを容易にするため、眼の2つのサイズがほぼ同等である場合、それは理想的です。 </li><li>離れて2つのアイ半分剥離優しく、二つの鉗子を使用して角膜を開催。レンズ、内臓、および目のシェルから神経網膜を取り外して廃棄。 ACSFで新しい皿にシェルを転送する。 </li><li>今、私たちは、毛様体上皮を分離する準備が整いました。開始するには、東洋の目のシェルでは、その角膜があなたの右と網膜色素上皮（RPE）になっていることを左手にあります。ゆっくりとRPE側のストレートピンセットで目のシェルを突き止める。 </li><li>次に、静かにメスを押し下げはなく、製材の動きを使って、眼の毛様体上皮から角膜と虹彩をカットするためにメスを使用してください。 </li><li>その後、離れてRPEから毛様体上皮をカット。 ACSFを含む新しい35 - mmディッシュに毛様体上皮のストリップを転送するために、非鋸歯状の鉗子を使用してください。 </li><li>同じように、他の眼のシェルから毛様体上皮を分離する。 </li><li>両方の毛様体上皮細片を収集したら、ディスパーゼの2 mLを含む、35 mmディッシュにストリップを移す。 10分間、37℃インキュベーターでストリップで皿を置きます。 </li><li> 10分後、フィルタ処理されたトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびキヌレン酸2 mLを含む皿にディスパーゼからストリップを転送する。 37皿を置き° Cで1​​0分間。 </li><li>今解剖顕微鏡に戻ります。ストレートピンセットで強膜を押しながら、静かに離れて強膜から毛様体上皮の傷が付かないように湾曲した非鋸歯状の鉗子の底を使用してください。 </li><li>皿から強膜を取り除く。皿に残されるべきものは、現在の関心と酵素液の細胞である。 </li><li>ファイアーポリッシュ綿プラグのピペットを使用して、14 mlのチューブにこのソリューションを転送する。ピペットのinとoutソリューションを強制することにより上皮細胞を分解するために、このソリューションを30回ひいて粉にする。 </li><li> 1500rpmで5分間、チューブを遠心する。細胞はこの段階でチューブの底を抜けになりやすいので、遠心分離が終了すると、慎重に遠心機からチューブを取り外します。 </li><li>ゆっくりとファイアーポリッシュピペットを用いて上清の大部分を吸引し、細胞に無血清培地でトリプシンインヒビターの1 mLを加える。それは、単一細胞懸濁液になるまで、約50倍のサンプルをひいて粉にするために小さな孔綿栓したピペットを使用してください。 </li><li> 1500rpmで5分間再びチューブを遠心する。 </li><li>上清を除去し、メッキの培地1mLに交換してください。細胞を再懸濁するためにファイアーポリッシュガラスピペットを用いて軽く砕いて粉にする。 </li><li>カウントの後板その24 - ウェルプレートにおける所望の密度で、細胞を優先します。通常我々平板培地で最初のウェルの各項目を入力して、メディアの500μLの最終的な音量を得るために細胞懸濁液を追加することにより、10細胞/μL。 </li><li>それはあなたが7日後に発生する球をカウントするまで移動されない37℃CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol> 3。網膜幹細胞を単離するの結果<ol><li>この手順が正常に実行されると、解剖毛様体上皮細胞は低密度（図1）で解離し、メッキされた後、次のようになります。 </li><li>培養中の7日後、生じた網膜幹細胞の球がカウントされます。球体は、直径および幹細胞由来の球としてカウントされるフリーフローティングでは75μm以上にしてください。 （図2）。ただし、一部の細胞は大きさの基準を満たしていないと幹細胞由来の球としてカウントされず限られた増殖とフォームの回転楕円体を持つことになります。このような回転楕円体の例は（図2）ここに示されています。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは1-3マウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離する方法について説明します。毛様体上皮の細片を単離するための方法論は、しかしながら、単一細胞懸濁液を達成するための酵素と方法論は、このプロトコルに最適化されている、変えることができます。それは、これらは各々の眼から単離することができる球の総数にマイナスの影響を持っているように見えるので、分離されている毛様体上皮のストリップはRPEまたは角膜を大量に含まれていないことも重要です。さらに、我々は、もともとbrainニューロスフェアを13日に策定され、その作成 ​​することを無血清培地は、網膜幹細胞の球を成長させるための理想的です。一つは、また、それらが成長している球が一緒に14を集計しないように播種し、インキュベータ内に配置された後、細胞に障害が発生していないことを確認する必要があります。 網膜幹細胞がクローン性の球を形成した後、それらは眼あたりの幹細胞の見込み数を得るためにカウントすることができます。球体は、その後、単一細胞に解離さと把握自己再生能力に継代または成長因子および/またはタンパク質の異なる組み合わせを使用して神経網膜とRPEの異なる細胞型に分化することができます。

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光光源</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>デュアルアーム光学ライト</td></tr><tr><td>湾曲ミニVannas剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>角度付きVannas剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumontピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>非セレーション</td></tr><tr><td>#5 Dumontピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>ストレート</td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>セレーション付き湾曲</td></tr><tr><td>#3 メスハンドル</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 メス刃</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>ホットビード滅菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Trypsin阻害剤</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>綿栓付きピペット</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>火炎研磨済み</td></tr><tr><td>14 mL チューブ</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>無血清培地</td><td></td><td></td><td>処方は Ref# 13 を参照</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

成体マウスの網膜幹細胞（RSC）は、哺乳類の目1,2,3の毛様体上皮（CE）に見られる珍しい静止細胞です。 CEは、非色素内側と色素外側の細胞層から構成され、そしてCEからの単一色素細胞から生じるクローンRSCコロニーはすべて形成するために区別することができます両方の色素と非色素細胞で構成されています神経網膜とRPEの細胞型。球内のすべての細胞はすべて、少なくともいくつかの顔料4を含むかどうかについてのいくつかの論争があり、しかし細胞はまだ1月3日神経網膜内に存在する異なる種類の細胞を形成することができる。このような両生類や魚類などのいくつかの種においては、彼らの目はしかし、怪我の5の後の再生が可能です。哺乳類の目にはそのような再生特性を示していない。我々は、in vivoで幹細胞を識別し、目のけがの修復物理的または遺伝的モデルを助けるために、細胞の潜在的なソースとして使用しているだけでなく、さらに損傷後、6-8静止哺乳類の網膜幹細胞を維持するメカニズムを理解しよう9月12日移植による。ここでは、クローン網膜幹細胞の球体を形成するために、マウスの眼から毛様体上皮細胞を分離し、文化の中で、それらを成長させる方法について説明します。 in vivoで幹細胞の既知のマーカーが存在しないため、これらの球はプロスペクティブに眼の毛様体上皮内に幹細胞集団を識別するための唯一の知られている方法です。

このビデオでは、我々はマウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離し、クローン網膜球体を形成する文化の中で、それらを成長させる方法を紹介します。分離されている球は、幹細胞の枢機卿性質を有している：自己再生および多能。

成体マウスの網膜幹細胞（RSC）は、哺乳類の眼の毛様体上皮（CE）内に存在する希少な静止期細胞である1,2,3。CEは、...

本手順の全体的な目的は、眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を単離することである。まず、眼を洗浄し、視神経から始めて角膜を通り、再び視神経に戻るように眼を半分に切断し、その後、神経網膜と水晶体を除去することでこれを達成する。手順の第2段階では、角膜、虹彩、および網膜色素上皮を切除して、毛様体上皮を切り出す。手順の第3段階では、毛様上皮を酵素処理し、強膜を除去して、上皮を機械的に分散させて単一細胞にします。手順の最終段階では、細胞を無血清培地で再懸濁し、成長因子を含む無血清培地が入った組織培養プレートに播種します。最終的に、in vitroでのクローナルスフィア形成を通じて、眼の毛様上皮に存在する幹細胞数を予測的に示す結果を得ることができます。こんにちは、ブレンダ・コールズです。私たちの研究室では、両生類や魚類の眼における再生能に関する論文を研究していた際、哺乳類の眼にも同様の能力を持つ細胞が存在するのではないかという仮説を立て、この手法を考案しました。網膜幹細胞の単離は、一次培養実験専用の特定の無菌室で実施します。本手順を開始する前に、解剖顕微鏡と冷光光源を設置し、滅菌済みの解剖器具を準備します。各クリーンベンチには、工程間で器具を滅菌するための高周波滅菌器が備わっています。承認された動物倫理プロトコルに従って屠殺したマウスから摘出した眼球を、人工脳脊髄液を含む滅菌ペトリ皿に直ちに配置し、そこから網膜幹細胞を分離します。本手順において最も困難な点は、顕微鏡下で球状の物体を解剖することです。目的の組織を破壊しないよう、細心の注意を払う必要があります。解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて眼球を洗浄します。角膜強膜境界に付着している毛および結合組織を取り除きます。その後、鋸歯状ピンセットで眼球を固定しながら、A CSFが入った新しいディッシュに眼球を移します。角度付きマイクロ解剖用鋏を用いて眼筋を除去します。視神経がまだ眼球に付着している場合はそれも除去しますが、この過程で眼球を押しつぶさないように注意してください。眼球をCSFが入った新しいディッシュに移します。次に、曲がった微細解剖用鋏を使用して、眼球を半分に切断します。視神経から切り始め、角膜の中央を通って、切断を開始した視神経の位置まで戻るように切ります。次の工程を容易にするため、2つの眼球片がほぼ同等なサイズになるように切断するのが理想的です。2本のピンセットで角膜を保持し、眼球の2つの半分をゆっくりと剥がします。眼球殻から水晶体、硝子体、および神経網膜を取り除き、廃棄します。その後、眼球殻をA CSFが入った新しいディッシュに移します。それでは、繊毛上皮を単離します。まず、角膜が右側に、網膜色素上皮が左側にくるように眼球殻を配置します。RPE側を直線ピンセットで軽く押さえ、眼球殻を固定してください。次に、メスを用いて、のこぎり状に動かすのではなく、メスを優しく押し下げるようにして、角膜と虹彩を眼の毛様上皮から切り離します。その後、毛様上皮をRPEから切り離します。非鋸歯式ピンセットを使用して、毛様上皮のストリップをA CSFを含む新しい35 millimeterディッシュに移します。同様の手順で、もう一方の眼殻から毛様上皮を分離します。毛様上皮のストリップを回収したら、2 mLのdis spaceを含む35 mmディッシュにストリップを移します。ストリップを入れたディッシュを37 °Cのインキュベーターに10分間置きます。10分後、ストリップをディッシュから、フィルター済みのHanks balanced salt solutionおよびcitric acidを含む2 mLの溶液が入ったディッシュに移します。このディッシュを37 °Cで10分間保持します。次に、直鉗子で強膜を押し下げながら、解剖顕微鏡での観察に戻ります。カーブ型の非滅菌鉗子の先端を使用して、毛様体上皮を強膜からそっと掻き出します。強膜をディッシュから取り除きます。ディッシュ内には毛様体上皮のみが残っているはずです。ここに対象の細胞と酵素溶液を用意します。火炎滅菌し綿栓をしたピペットを用いて、溶液を14 literチューブに移します。この溶液をピペットで緩やかに吸い込み、出しすることを30回繰り返し、上皮細胞を分散させます。その後、チューブを1500 RPMで5分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、チューブを慎重に遠心機から取り出します。細胞がチューブの底から剥がれやすいためです。この段階で、火炎滅菌したピペットを用いてSuperNetの大部分を緩やかに吸引し、その後、細胞に無血清培地で調製したトリプシンインヒビターを1 mL添加します。小口径のボーアホール綿詰めピペットを使用して、サンプルが単一細胞懸濁液になるまで約50回トリチュレーション（撹拌）を行います。チューブを再度5分間遠心分離します。1500 RPMで遠心し、上清を除去して、1 mLのプレーティング用培地と置換します。火炎滅菌したガラスピペットを用いて培地を穏やかにピペッティングし、細胞を再懸濁させます。細胞数をカウントした後、目的の密度で播種します。24ウェルプレートの場合、通常は各ウェルに先に培地を満たし、その後、細胞懸濁液を加えて最終液量を500 µLとし、1 µLあたり10個の細胞が播種されるようにします。プレートを37 °CのCO₂インキュベーターに入れ、本手順が正常に行われた場合に7日後に形成されるスフィアを計数するまで、移動させないようにします。解離させ低密度で播種した後の繊毛上皮細胞は、このように見えるはずです。培養から7日後、形成された網膜幹細胞スフィアを計数します。幹細胞由来のスフィアとしてカウントされるためには、直径が75 microns以上であり、かつ浮遊状態でなければなりません。しかし、一部の細胞は増殖が限定的であり、サイズ基準を満たさないPHEを形成するため、これらは幹細胞由来のスフィアとしてはカウントされません。このようなアステロイドの発達後の例をここに示します。この手法により、視覚科学分野の研究者が、網膜疾患の治療に網膜幹細胞を利用する可能性を探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。...

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マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。...

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