マウスの眼から網膜幹細胞の単離

このビデオでは、我々はマウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離し、クローン網膜球体を形成する文化の中で、それらを成長させる方法を紹介します。分離されている球は、幹細胞の枢機卿性質を有している：自己再生および多能。

この手順の全体的な目標は、目の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離することです。これは、最初に視神経から始めて、角膜を切断して視神経で合流し、次に神経網膜と水晶体を切除して、目を半分に切断することによって達成されます。手順の2番目のステップは、角膜虹彩と網膜色素上皮を切除することにより、毛様体上皮を切り取ることです。

手順の3番目のステップは、毛様体上皮を酵素的に治療し、強膜を取り除き、上皮を機械的に解離して単一細胞にすることです。手順の最終ステップは、細胞を無血清培地に再懸濁し、成長因子を含む無血清培地を含む組織培養プレートにプレートすることです。最終的には、クローン球を介して眼の毛様体上皮に見出される幹細胞の数を前向きに示す結果を得ることができ、in vitroで形成されます。

こんにちは、私の名前はブレンダ・コールズです。私たちの研究室では、両生類や魚類の目の中での再生能力に関する論文を研究していたときに、哺乳類の目にも同じ能力を持つ細胞があるのではないかという仮説を立てたのがきっかけで、この方法を思いつきました。網膜幹細胞の単離は、初代培養実験専用の特定の無菌室で行われます。

この手順を開始する前に、解剖顕微鏡と冷光源をセットアップしてから、滅菌解剖器具をレイアウトします。各フードには、ステップ間で器具を滅菌するためのホットビート滅菌器があります。人工脳脊髄液を含む滅菌ペトリ皿にすぐに置かれた目から網膜幹細胞を分離します 承認された動物倫理プロトコルに従って犠牲にされたマウスからの除去後、この手順の最も難しい側面は、顕微鏡下で丸い物体を解剖することです。

関心のある組織を破壊しないように細心の注意を払う必要があります 解剖顕微鏡の下で、鉗子で目をきれいにします。角膜強膜の境界に付着している髪の毛と接続された組織を取り除きます。次に、鋸歯状の鉗子で目を静止させたまま、CSFを使用して目を新しい皿に移します。

角度のついたマイクロ解剖ハサミを使用して、眼の筋肉を取り除きます。視神経がまだ目に付着している場合は、視神経も取り除き、この過程で目をつぶさないようにしてください。CSFのある新しい皿に目を移します。

次に、湾曲したマイクロ解剖ハサミを使用して、目を半分に切りました。視神経から開始し、角膜の中央を切断し、切断が開始された視神経で合流します。2つの目のサイズがほぼ同等であれば、次のステップが容易になるため理想的です。

2つの鉗子を使用して角膜を保持し、2つの目の半分をそっと剥がします。水晶体、内臓、神経網膜を目の殻から取り出して廃棄します。シェルをA CSFの新しい皿に移します。

これで、毛様体上皮を分離する準備が整いました。まず、角膜が右側に、網膜色素上皮が左側になるように、アイシェルを向きます。RPE側のまっすぐな鉗子でアイシェルをそっと固定します。

次に、のこぎりの動きを使用するのではなく、メスをそっと押し下げることにより、メスを使用して角膜と虹彩を目の毛様体上皮から切断します。その後、毛様体上皮をRPEから切り離します。非鋸歯状鉗子を使用して、毛様体上皮のストリップをA CSFを含む新しい35ミリメートル皿に移します。

同様に、毛様体上皮をもう一方の眼殻から分離します。毛様体上皮ストリップが収集されたら、ストリップを2ミリリットルのディススペースを含む35ミリメートルの皿に移します。ストリップ付きの皿を摂氏37度のインキュベーターに10分間置きます。

10分後、disスペースからハレの濾過されたドリップの2ミリリットルを含む皿にストリップを移します ハレ あなたのhaaseと親切なレイ酸。皿を摂氏37度に10分間置きます。次に、まっすぐな鉗子で強膜を押さえながら、解剖顕微鏡に戻ります。

湾曲の未評価鉗子の底部を使用して、毛様体上皮を強膜からそっとこすり落とします。皿から強膜を取り除きます。すべて皿に残すべきです。

今目的の細胞と酵素溶液です。ファイヤーポリッシュされた綿栓ピペットを使用して、溶液を14リットルのチューブに移します。この溶液を30回三量して上皮細胞をバラバラにします。溶液をピペットに優しく出し入れし、チューブを1500 RPMで5分間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。細胞はチューブの底から剥がれやすいためです。この段階で、ファイヤーポリッシュピペットを使用してSuperNetの大部分を穏やかに吸引し、次に無血清培地中のトリプシン阻害剤1ミリリットルを細胞に加えます。

小さなボアホール綿栓ピペットを使用して、サンプルがシングルセル懸濁液になるまで約50回トライします。チューブを再度5分間遠心分離します。1500 RPMで上清を取り除き、1ミリリットルのメッキと交換します。

中速 ファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して穏やかに冷蔵し、細胞を再懸濁します。細胞をカウントした後、それらを所望の密度でプレートする。24ウェルプレートでは、通常、最初に各ウェルに培地を充填し、次に細胞懸濁液を添加して最終容量の500マイクロリットルの培地を得ることにより、マイクロリットルあたり10個の細胞をプレートします。

プレートを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに入れ、この手順が正常に実行される7日後に発生する球を数えるまでプレートを動かしません。解剖された毛様体上皮細胞は、解離して低密度でプレーティングされた後、このように見えるはずです。培養で7日後、発生した網膜幹細胞球がカウントされます。

球体は、幹細胞由来の球体としてカウントされるためには、直径が75ミクロンを超え、自由に浮かんでいる必要があります。ただし、一部の細胞は増殖が制限されており、サイズ基準を満たさないPHEを形成し、幹細胞由来の球としてカウントされません。このような小惑星の例を、その開発後に示します。

この技術は、視覚科学の分野の研究者が網膜疾患の治療に網膜幹細胞を使用する可能性を探求する道を開きました。