Name: 使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶシュワン細胞とアストロサイトの相互作用をインビトロアッセイで解析する方法。脊髄損傷修復における細胞移動と境界形成のメカニズムを解明し、再生医療への応用を目指す研究に役立つ。

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我々は彼女の親切な助けのためにリッパウォーレンに感謝します。

1。境界アッセイ： <ol><li>基本的な準備：チャンバースライドは、ポリ- D -リジン一晩滅菌ガラススライドでコーティングされている実験を開始する前に用意されています。培地は10％ウシ胎児血清（FCS）、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン- Fungizon（PSF）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて調製される。また、カルシウム/マグネシウムフリーハンクス平衡塩溶液（HBSS）のボトルが用意されています。 </li><li>フラスコで培養したラット初代シュワン細胞は、0.1％トリプシンを用いて3分間トリプシン処理されています。初代ラットアストロサイトの培養は、0.1％トリプシンを用いて5分間トリプシン処理しています。 トリプシンは、DMEMを加えると10％FCS、1％PSFを補充によってinactivedている。 </li><li>トリプシン処理シュワン細胞と星状膠細胞を15mLファルコンチューブを分離するために移し、5分間300Gで遠心分離されています。 </li><li>シュワン細胞とアストロサイトは2 × 10 6（細胞密度の変動のための代表的な結果のセクションを参照）の密度で再懸濁する。 </li><li>シュワン細胞懸濁液50μLの低下は、PDLコーティングチャンバースライドの井戸の一端に配置されます。ガラスのストリップは、チャンバの中心に向かって降下はストレートエッジを生成するためにスメアするために使用された。 （ガラスカッターを使用して、長方形のガラス製カバースリップは、それが境界のアッセイに使用されるチャンバースライドの幅に収まるだろうと縦方向にようにカットされます） </li><li>アストロサイトの懸濁液50μLの番目のドロップは同じ井戸の反対側の端に置かれ、それらの間の小さな0.2ミリメートルのギャップを持つ最初のドロップ塗抹標本に平行なエッジを作成するために中心に向かって塗抹した。 </li><li>チャンバーは、ドロップが2時間37℃のインキュベーター内に置かれている含まれているスライド。 </li><li> 2時間後、培養物を、非添付の細胞残渣およびDMEM / 10％PSFが追加さFCS / 1％を含む新鮮な培地を除去するDMEMで洗浄した。 注：DMEM / 10％FCS / 1％PSFは、シュワン細胞の増殖を刺激するフォルスコリン（2μmの）とウシ下垂体抽出物（BPE）（10μgの/ mL）で補足することができます。 BPEは、長期的なシュワン細胞の培養を可能にするために必要な成長因子を供給し、フォルスコリンは、細胞増殖を誘導するシュワン細胞内サイクリックアデノシン一リン酸のレベルを発生させます</li><li>細胞を37 ° C、7％CO 2インキュベーターで約8-10日間培養されています。培地は3日ごとに変更する必要があります。つのセルの前線は、最終的にお互いに達し、鋭い境界は、2種類の細胞型との間で形成されます。この段階での実験は、境界形成に関与する因子を分析を行うことができます。 </li><li>共培養は4％ホルムアルデヒドとシュワン細胞を用いて固定することができる共培養中の細胞を識別するために、抗GFAP抗体と抗P75抗体およびアストロサイトを用いて免疫染色することができます。 P75抗体は、アストロサイトは欠いているシュワン細胞上の低親和性NGF受容体を認識する。抗GFAP抗体は、アストロサイトの細胞質に局在するグリアfirbrillary酸性タンパク質を認識する。 （代表的な境界については、図1Aを参照してください） </li></ol> 2。マイグレーションアッセイ： <ol><li> 4ウェルプレートには、（15mm厚井戸）アストロサイト単分子膜を作成するためのPDLコーティング晩と準備です。 </li><li>一次星状膠細胞培養は、0.1％トリプシンを用いて5分間トリプシン処理しています。トリプシンは、DMEM、10％FCS、1％PSFと5分間300Gで遠心分離し細胞を添加した添加することにより不活化される。 （図2を参照） </li><li>アストロサイトは、1 × 10 5細胞/ mLで再懸濁する。この溶液1mlは、4ウェルプレートの各ウェルPDLコートされたに追加されます。単分子層が完全にコンフルエントになるまで、アストロサイトは、24〜48時間培養する。 </li><li>アストロサイト単分子層の作成と平行状細胞単層上のシュワン細胞の遊走を、評価するために、円形のPDLコートされたガラス製カバースリップを50 mLのチューブに入れ、ガラスの小さな断片を作成するためにプラスチック製のピペットを用いて粉砕されています。 </li><li>ガラスの破片を6ウェルプレートの皿にウェルに移し、ピンセット、適切なサイズのフラグメントを使用して選択し、他のウェルに配置されている。 5ガラスの破片を6ウェルプレートの各ウェルに配置されます。 </li><li>フラスコで培養した主なシュワン細胞は、0.1％トリプシンを用いて3分間トリプシン処理されています。トリプシン処理シュワン細胞を15 mlのFalconチューブを分離するために移し、5分間300gで遠心分離されています。シュワン細胞は、DMEM/10％FCS / 1％PSFで2倍に10 6細胞/ mLに再懸濁されている。 </li><li>シュワン細胞懸濁液20μL滴を6ウェルプレートとセルに入れ、各5カバーガラスの破片で37インキュベートしている° C、7％CO 2で2時間かけて添加される。 </li><li> 2時間後、シュワン細胞は、カバーガラスの破片とDMEM/10％FCS / 1％PSF（BPEのフォルスコリン及び10μgの/ mLの2μmのがそれぞれに追加されるもので、断片が完全に培地に覆われていることを補足した）に接続されている。 </li><li>ガラスの破片が完全にCONになるまでの断片を含む6ウェルプレートは、24〜48時間インキュベーター内に配置されていますシュワン細胞と流暢。 </li><li>一度フラグメントはシュワン細胞でコンフルエントの、各断片は、慎重に鋭いピンセットを使って拾い、アストロサイトの単分子層への面を下に反転してアタッチされていない細胞を除去し、HBSS浸漬される。 </li><li>各ウェルは、FCS / 1％PSFとシュワン細胞は24から48までの期間のために移行するために許可されているDMEM/10％1mLで覆われている。この期間中にそのような増殖因子として実験的な試薬は、シュワン細胞の遊走の数と距離に与える影響を評価するために追加することができます。 </li><li>移行期間に続いて、ガラスの破片は30分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加することにより、各ウェルの底部に固定されています。固定に続いて、P75（低親和性NGF受容体を認識する）ためのシュワン細胞を免疫染色し、それらを光学顕微鏡下でシュワン細胞の可視化を可能にするためにABCストレパビジンキット - ジアミノベンジジン（DAB）を、使用して染色。 </li></ol> 3。代表的な結果： 8-10日以下のシュワン-アストロサイト共培養は、2種類の細胞型との間の鋭い境界を示す。シュワン細胞の増殖が増強されるフォルスコリンおよびBPEは、培養に使用されている場合、この境界はより顕著です。 は境界が10日間の期間中に観察されていない場合の境界が確立されるまで、文化の時間がさらに増加することができます。細胞密度の比を変更すると、境界形成を増加させる別の方法です。 3時01分シュワンの比率：細胞懸濁液8,18を準備する際にアストロサイトの細胞密度を使用することができます。 ラインを混ざりセルを評価するために、シュワン細胞やアストロサイトを識別するには、以下の免疫染色は、境界が確立されており、アストロサイトの領域に移行するシュワン細胞の数を蛍光顕微鏡下でカウントすることができますどこに描画することができます。 下の画像取得の境界、整形式のシュワン細胞とアストロサイトの分離（図1A）と細胞が悪い手法（図1B）のためにも別の地域に分離していないものと、持たないものの2つの例を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1境界アッセイ：シュワン-アストロサイト相互作用。シュワン細胞の増殖を刺激するフォルスコリンとBPEの存在下でA）10日間共培養アッセイは、2種類の細胞（赤= P75、緑= GFAP）との間の鋭い境界を示しています。 B）境界が形成されていない10日間共培養アッセイおよび二つの細胞の前線が混在。 （赤= P75、緑= GFAP）の境界の準備中に隣同士に星状膠細胞とシュワン細胞の液滴を配置しながら、これは2つの液滴の混合することによるものです。 <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。コンフルエントアストロ単層の代表画像マイグレーションアッセイは、別の細胞型の表面上で1つの細胞型の動きを評価するため、境界の形成とは異なる現象を評価する。 練習は単分子膜上にカバースリップが鋭い鉗子によるシュワン細胞に覆われたガラスの破片やアストロサイト単層に損傷が発生するしない反転確保するために必要とされる。シュワン細胞の遊走を評価するために、移行の最大距離とカバースリップの端から移行する細胞の数を光学顕微鏡下で測定することができます。 下記のアストロサイト単分子層の表面（図3）にDAB染色を用いてP75抗体で染色されたシュワン細胞のイメージがあります。 <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 逆カバースリップのアッセイを用いて図3。移行アッセイ。 A）シュワン細胞（茶色、P75抗体で免疫染色）カバースリップの端から離れて移行。離れてカバースリップから細胞移動の方向に矢印が。

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<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

上記のアッセイは、シュワン-アストロサイトとアストロサイトの環境に限定されたシュワン細胞の遊走との間の境界形成に関与する複数の要因の役割を示す様々な研究で使われてきました。 それは戦略の開発を最適化できると移植後のシュワン細胞移植の統合を強化し、そうすることで可能に宿主組織に移植片の背面からの再生軸索の出口を促進するとして、これらのイベントの根底にあるメカニズムを理解することは不可欠であるコネクションの形成宿主組織を持つ。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>フォルスコリン</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス（長方形）</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルプレート、6ウェルプレート</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>4ウェルプレート6ウェルプレート</td></tr><tr><td>ラットp75抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体（Alexa結合）</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>ヤギ抗マウス 568ヤギ抗ウサギ 488</td></tr><tr><td>二次抗体（ビオチン標識）</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>DABタブレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>ABC eliteキット</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

シュワン細胞は、脊髄損傷、以下の修復方法で一般的に使用される細胞の一つです。シュワン細胞は軸索再生をサポートしていると分泌成長因子の1,2により、発芽と接着分子3と細胞外マトリックス分子4を成長促進を提供することが可能です。さらに、彼らは怪我5部位で脱髄軸索をmyelinate。 しかし移植後、シュワン細胞は、インプラントのサイトから移行しないと、ホストアストロ6,7と混合しないでください。シュワン細胞とアストロサイトとの間の鋭い境界の形成にこの結果、近位および遠位宿主組織に移植バックを終了しようとして成長する軸索のための障害物を作成する。シュワン細胞と接触するアストロサイトはまた、肥大とアップレギュレーション阻害分子8-13を受ける。 in vitroアッセイモデルシュワン細胞-アストロサイト相互作用するために使用されており、細胞挙動の根底にあるメカニズムを理解する上で重要な役割を演じてきた。 in vitroアッセイこれらは、共培養は、2つのセルの前線を分離するだけの小さなギャップと異なる地域を占める各セルのタイプと二つの異なる細胞を用いて作られている境界のアッセイを、含まれています。細胞が分裂と移行するように、2つの細胞の前線が近づくごとに、他に取得し、最終的に衝突する。これは2つの細胞集団の振る舞い​​が境界で分析することができます。同技術のもう一つの変化は、文化の2つの細胞集団を混合し、時間をかけて2種類の細胞型は、シュワン細胞と分離するとともに、複数のシュワン-アストロサイトの境界を作成するアストロサイトとの間の島々として一緒に凝集することです。 2種類の細胞型の相互作用を研究に使用される第二のアッセイは、細胞の動きが他の細胞型単層14,15の表面に追跡することができます遊走アッセイです。このアッセイは、一般的に反転したカバースリップのアッセイとして知られています。シュワン細胞は、小さなガラスの破片上で培養され、それらは、アストロサイト単分子膜の表面に顔を下に反転していると、移行はカバースリップの端から評価される。 両方のアッセイは、細胞の排除と境界形成に関与する根本的なメカニズムの研究に尽力されている。これらの手法を用いて同定された分子の一部はN -カドヘリン15、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPGs）16,17、FGF /ヘパリン18、エペソ/エフリン19を含む。 この記事では、段階的に境界の分析および移行のアッセイを記述すると発生する可能性のある技術的な問題を解明していきます。

この記事では、段階的に記述しようとする、一般的に使用される<em&gt; in vitroで</emシュワン細胞asrtocyte相互作用を研究に使用される&gt;アッセイ。

シュワン細胞は、脊髄損傷後の修復戦略において一般的に用いられる細胞の一つである。シュワン細胞は、軸索の支持を可能とする能力を持っており...

シュワン細胞は末梢神経系のグリア細胞であり、脊髄損傷の修復に利用されてきました。基本的に、これらの細胞は軸索再生をサポートし、成長を促進する接着分子や細胞外マトリックス分子を提供します。さらに、損傷部位において軸索を髄鞘化します。残念ながら、移植されたswan細胞は移植部位から移動せず、宿主のアストロサイトと混在しません。これにより明確な境界が形成され、伸長する軸索が宿主組織に統合されることが妨げられます。このビデオでは、swan細胞とアストロサイトの相互作用をin vitroで研究するための2つの手法を用いています。まず、スライド上でシュワン細胞とアストロサイトの領域を構築し、培養する境界アッセイについて実演します。次に、異なる試薬をスライドに添加し、さらに培養を行います。その後、スライドの画像を撮影・解析し、試薬がシュワン細胞のアストロサイト領域への遊走、あるいはその逆の遊走に及ぼす影響を判定します。次に、シュワン細胞の集落を載せたカバーガラス片をアストロサイト単層の上に反転させて配置する遊走アッセイについて説明します。ここでも、培地に異なる試薬を添加し、その後、培養イメージングを行うことで、アストロサイト単層上におけるシュワン細胞の遊走範囲と距離を評価します。最終的に、この種のアッセイは、移植後のシュワン細胞グラフトの統合を最適化および促進するための戦略開発に寄与することが期待されます。純粋な基質上の移動を評価する既存の手法と比較して、これらのin vitroアッセイの利点は、移植された細胞がアストロサイトと接触するin vivoアッセイにより近い状況を再現できる点にあります。さらに、これらのin vitroアッセイは、細胞生物学などの他の分野においても、腫瘍細胞の浸潤や移動といった重要な疑問を解決するために利用可能です。アッセイを開始する前に、ポリDリシンコート済みのチャンバースライド、滅菌済みガラススライド、細胞培養培地、およびカルシウムボトルを用意してください。マグネシウム不含ハンクス平衡塩溶液を用い、まず一次培養ラットシュワン細胞を3分間、一次培養ラットアストロサイトを5分間、トリプシン処理します。細胞が剥離したら、細胞培養培地を加えてトリプシンを不活化させます。次に、シュワン細胞とアストロサイトをそれぞれ別の15 mLファルコンチューブに移し、300 ×gで5分間遠心分離します。その間に、ガラスカッターを用いて長方形のガラスカバースリップを縦方向に切り、境界アッセイに使用するチャンバースライドの幅に合わせ、細胞懸濁液の滴を塗り広げやすくします。スピン再懸濁後、シュワン細胞とアストロサイトを 2×10⁶ cells/mL の密度で懸濁します。ポリリシンコートされたチャンバースライドの一端に、シュワン細胞懸濁液 50 µL を1滴、慎重に滴下します。ガラスストリップを使用して、液滴をチャンバーの中央に向かって塗り広げ、直線的なエッジを作成します。次に、同じウェルの反対側にアストロサイト懸濁液を50 µL滴下し、同様に中央に向かって塗り広げます。1つ目のエッジと平行な直線エッジを作成するため、両者の間に0.2 mmの間隔を空けてください。液滴を載せたチャンバースライドを37 °Cのインキュベーターに入れ、2時間置きます。2時間後、DMEMで培養物を洗浄し、付着していない細胞残渣を除去します。シュワン細胞の増殖を刺激するため、チャンバースライドに培地を加えます。この培地には、フォーガリンおよび牛下垂体抽出物（BPE）が添加されています。フォーガリンはシュワン細胞内のcyclic AMPレベルを上昇させて増殖を誘導し、BPEは長期培養に必要な成長因子を供給します。スライドを8～10日間インキュベートします。最終的に2つの細胞前線が互いに到達し、2種類の細胞間に明瞭な境界が形成されます。この段階で、実験を行うことができます。境界形成に関与する因子を分析して境界を検討するため、4% formaldehydeで共培養系を固定します。シュワン細胞とアストロサイトを区別するために、それぞれ抗P75抗体および抗GFAP抗体を用いて免疫染色を行います。P75抗体はシュワン細胞上の低親和性NGF受容体を認識し、これはアストロサイトには存在しません。抗GFAP抗体は、アストロサイトに局在するグリア線維性酸性タンパク質を認識します。これを移動アッセイに用います。播種を開始します。15 mmウェルの4ウェルプレートの各ウェルに、1 mLの培地で調製した1×10⁵個のアストロサイトを分注します。プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、単層が完全にコンフルエントになるまで24〜48時間培養します。一方、アストロサイト単層上での遊走を評価するためにスワン細胞を準備するには、ポリリシンコート済みの円形ガラスカバースリップを 50 milliliter チューブに入れ、プラスチックピペットで砕いて小さなガラス片を作成します。ピンセットを用いて、ガラス片を 6ウェルプレートの1つのウェルに移します。直径約 5 millimeters の破片を選び、他の各ウェルに 5枚ずつ移します。トリプシンでシュワン細胞を3分間処理します。その後、細胞を15 mLチューブに移し、300 ×gで5分間遠心分離します。シュワン細胞を培養液を用いて2 × 10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、各断片の上にシュワン細胞懸濁液を20 µLずつ加え、37 °C、7% CO2条件下で2時間インキュベートします。2時間後、シュワン細胞をインキュベーターから取り出します。各ウェルに、2 µMの4-scale-inおよび10 µg/mLのBPEを添加した培養液を十分な量加えます。細胞が付着した断片が培地で完全に覆われていることを確認し、ガラス断片がシュワン細胞で完全に満たされるまで24から48時間インキュベートします。断片がシュワン細胞で満たされたら、シュワン細胞とアストロサイトの両方をインキュベーターから取り出します。ピンセットを使用して、シュワン細胞が付着した各断片を慎重に拾い上げます。断片をHBSSに浸して付着していない細胞を除去し、アストロサイト単層の上に裏返して載せます。すべての断片を移し替えたら、各ウェルに細胞培養液を1 mL加えます。成長因子などの実験試薬の効果を評価する場合は、それらを培地に添加してください。プレートをインキュベーターに戻し、遊走期間として24〜48時間、シュワン細胞を遊走させます。固定の手順として、4%パラホルムアルデヒドを30分間添加し、ガラス片を各ウェルの底面に固定します。シュワン細胞をP 75で免疫染色し、次いで付属のABC Strept ADINキットを用いて染色し、DIAM benadineを添加して、10日後に光学顕微鏡下でシュワン細胞を可視化します。シュワン細胞とアストロサイトの共培養では、2つの細胞型の間に明確な境界が認められます。ここでは、シュワン細胞がP 75によって同定されています。低親和性NGF受容体の染色は赤色で示され、アストロサイトはGFAP染色により緑色で識別されます。培養にフォルスコリンとBPEを使用するとシュワン細胞の増殖が促進されるため、これらの細胞間の境界がより明確になります。対照的に、この10日間の共培養アッセイでは、細胞は異なる領域に十分に分離していません。これは、2種類の細胞型の不適切な手技および混合によるものでした。境界アッセイを準備する際、遊走アッセイではある細胞型が別の細胞型の表面上を移動する様子を評価するため、境界形成とは異なる現象を評価することになります。この画像は、カバーガラスの端から離れて遊走するスワン細胞を示しており、矢印は細胞の遊走方向を指しています。これらのin vitroアッセイを試みる際は、試薬の効果がアストロサイトまたはシュワン細胞のいずれかに作用している可能性があることを念頭に置くことが重要です。したがって、観察された遊走の増加または減少のどちらの細胞タイプが責任を負っているかを正確に証明するためには、後続の実験が必要となります。さらに、免疫化学などの他の手法、特に境界アッセイにおいて、シュワン細胞とアストロサイトの境界でどの分子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされているかを示すために実施することが可能です。

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Biology

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学ぶシュワン細胞とアストロサイトの相互作用をインビトロアッセイで解析する方法。脊髄損傷修復における細胞移動と境界形成のメカニズムを解明し、再生医療への応用を目指す研究に役立つ。

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

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