無細胞培地でボルバキアの維持

私の名前はコートニー・ストンです。ジョンズ・ホプキンス・ブルームバーグ公衆衛生大学院のジェイソン・ラスコン博士の研究室に所属しています。本日は、培養昆虫細胞からの細菌精製を行います。

この手順は非常にシンプルです。まず細胞を回収し、ガラスビーズを用いたライシス（溶菌）によって真核生物の宿主細胞膜を物理的に破壊します。その後、分画遠心法を用いて、宿主細胞の残渣から細菌を分離します。

その後、一連のろ過工程を用いて宿主細胞の粒子をさらに除去し、最終的に精製された細菌ペレットのみが得られるようにします。これは実際的に重要な要件の一つです。こちらは細胞培養用フードであり、細胞培養は非常に汚染されやすいため、すべてを無菌状態に保つために使用されます。

また、細胞培養培地と細胞本体が必要であり、これらはプラスチックフラスコで培養します。さらに、3 mmのビーズ、50 mlコニカルチューブ、および遠心分離機が必要です。遠心分離機は、細菌をペレット化するための約18,000 Gの高速度遠心分離が可能であると同時に、宿主細胞をペレット化するための約3,000 Gまたは2,500 Gでの回転も可能なものである必要があります。それでは、まず培養した細胞から開始します。

これらは培養されていますね？これらは T 75 フラスコです。15 ml の培地と、私たちのサンプルが入っています。

まず、細胞層を剥離し、50 ml遠心チューブに回収します。細胞層をスクイジーのように上下に擦ることで、すべての細胞を培地中に分散させます。細胞が培地に懸濁したら、それらをピペットで50 mlコニカルチューブに移します。

次に、2つの細胞懸濁液に3 mmのガラスビーズを加えます。これらのビーズはオートクレーブ滅菌されており、再利用が可能です。洗浄して漂白剤に浸した後、再度オートクレーブ滅菌して使用することができます。

ガラス瓶Bの口が遠心チューブの口に触れないように注意しながら注ぎ入れます。各遠心チューブに、5 mLの目盛り量までガラスビーズを入れます。次に、細菌を懸濁液中に放出させるため、物理的に酵母細胞を破砕します。

ボルテックスミキサーを使用し、最高速度に設定して5分間撹拌します。このように、3 mmのガラスビーズと共に細胞を5分間ボルテックスし、その後、清潔なピペットを用いて上清を清潔で滅菌済みの50 mL遠心チューブに分取します。こうして、放出された細菌と溶液、および全細胞破砕物からなる懸濁液が作成されます。

次のステップでは、低速遠心分離を行い、粗い物質をペレットとして沈殿させ、細菌を懸濁液中に残します。遠心分離機を使用し、2,500 ×g で 10 分間遠心分離します。また、底部にペレットを効率よく回収するため、4 °C で遠心分離を行います。

そして、これをここにセットし、バランスが取れていることを確認して蓋を閉め、10分間遠心分離します。これで、宿主細胞の残渣と精製された細菌を含む上清の遠心分離が完了しました。条件は2,500 Gで10分間です。

ご覧の通り、チューブの底部に細胞残渣からなるペレットが形成されています。新たに遊離した細菌は、遠心分離の速度が不十分でペレット化しなかったため、まだ上清の中にあります。したがって、次に上清を取り除き、5 µmのフィルターでろ過します。

これは5 µmのフィルターで、実際にはどのような種類のシリンジにも適合します。ここでは30 mlのシリンジを使用しますが、プランジャーを引き上げ、フィルター部分、特に下側の部分には触れないようにしてください。ここは無菌状態を維持する必要があります。フィルターにシリンジをねじ込んで取り付け、プランジャーをゆっくりと押し下げて、上清をフィルターに通してチューブに回収します。

強く押しすぎるとフィルターが破損し、機能しなくなる可能性があるため注意してください。強い圧力をかけなければならない状態になった場合は、フィルターが細胞破片でひどく詰まっていることを意味するため、フィルターを取り外して交換する必要があります。この段階で、通常、採取量に応じて、非常に純度の高い細菌培養液を得るための追加手法として、フィルター滅菌済みの 250 millimolar ショ糖溶液を高速遠心管に加えます。

ボトルに少なくとも80%程度まで満たします。通常はネック（口）まで満たします。高速遠心機内での内破を防ぐため、チューブを十分に満たす必要があります。

それでは、この高速遠心機を用いて、上清を18,000 ×gで遠心分離し、精製した細菌を回収します。もちろん、チューブがバランスよく配置されていることを確認し、蓋を閉めます。時間は10分間に設定します。

この操作は10°C以下で行うことが望ましく、こちらの温度設定で管理しています。また、遠心機に使用するこの特定のローターの角速度は12.5 revolutions per minuteに設定します。換算表に基づくと、回転数は約18,670 ×gになります。これで、精製した細菌をペレット化するための高速遠心分離が完了しました。

ご覧の通り、高速遠心管の底に細菌のペレットが形成されました。ここで、上清をすべて液体廃棄物容器に除去します。次に、細菌を再懸濁させる必要があります。

これを2 mLの培養液（10%熱不活化胎児ウシ血清を添加したSchneider's insect medium）で再懸濁します。ピペッティングを繰り返し、すべての細菌が溶液に戻るまでペレットを再懸濁させます。細菌が再懸濁されましたので、ホスト細胞の残渣を完全に取り除くため、さらにもう一段階の精製工程を行います。

ここでは、2.7 µmのフィルターを使用します。私は、5 µmフィルターのプラスチックケースをホルダーとして利用する方法を推奨しています。溶液を吸い上げ、シリンジを2.7 µmフィルターに取り付け、長期保存用チューブにろ過します。

前のフィルターと同様に、プランジャーをゆっくりと押します。これで精製された細菌溶液が得られました。次に、生存率を測定する方法について説明します。

Molecular Probes社のBacLight生死判定細菌生存率キットを使用します。このキットには、プロピジウムヨードとSYTO 9の2種類の染色剤が含まれています。プロピジウムヨードは赤色蛍光を発し、細菌膜が完全に維持されていない細菌のみを染色します。一方、SYTO 9はすべての細菌を染色します。

蛍光光学系を備えた顕微鏡でこれらの細菌を観察すると、すべての細菌が緑色に蛍光を発し、そのうち死滅した細菌のサブセットが赤色に蛍光を発します。精製サンプルから少量のアリコートを採取します。今回はスライド1枚分に十分な量である10 µLのみを採取し、それをさらに2つのチューブに分注します。

次に、プロピジウムヨードとSYTO 9の混合液を1 µL、細菌懸濁液に加えます。そのまま暗所で15分間インキュベートしてください。ただし、実際にはすぐに封入して観察しても、結果を確認できることがわかっています。

それでは、live/dead染色剤で染色した細菌を含むスライドを顕微鏡で観察します。スライドに染色液を分注し、カバーガラスをかけてから観察を行います。細菌の生存率を評価するため、赤緑混合フィルターを使用します。

シャッターを開けると、細菌が見えます。それらはほぼ点のように見えます。ここで見ると、細菌の約90%から95%が緑色であるのに対し、赤色は約5%であると言えます。したがって、生存率は非常に高いということになりますね。

以上で、培養昆虫細胞からの生存可能なAkiaの精製について解説しました。このプロトコルには、真核生物のホスト細胞の物理的破壊と、それに続く分画遠心法による精製細菌の単離が含まれていました。また、ホスト細胞の成分を完全に取り除き、精製細菌の品質を確保するための一連のろ過工程についても説明しました。そして最後に、2種類の染色剤を用いて細菌の生存率を評価する、バックライト生存・死滅アッセイについて解説しました。

精製した細菌は、特定の系の感染率を高めるために他の培養細胞系に感染させるなど、さまざまなアプリケーションに使用できます。また、生存した精製細菌を用いて、代謝研究やその他数多くの研究を行うことも可能です。