Name: 無細胞培地でボルバキアの維持 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 学ぶ、Anopheles gambiae細胞からWolbachia pipientisを精製し、無細胞培地で培養する方法。ガラスビード破砕と遠心分離を用いた細菌生存性アッセイの確立により、昆虫共生細菌研究に貢献します。

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無細胞培地でボルバキアの維持

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

このビデオプロトコルで、手順は（1）、培養蚊細胞のボルバキアの共生を浄化（2）精製ボルバキアの生存を確認する蛍光アッセイを使用し、（3）細胞を含まない培地で今外ボルバキアを維持することが実証されています。精製ボルバキアは、細胞外相で生きているままですが、真核細胞に再接種するまで複製されません。この方法で精製された細胞外ボルバキアは、室温で少なくとも1週間実行可能なままであり、おそらく長くなります。精製ボルバキアは、マイクロインジェクション、DNAの抽出および他のアプリケーションに適しています。

このビデオは、ハ​​マダラカの細胞株とし、無細胞培地で培養endosymbiontをからボルバキアpipientisを精製する方法を説明します。細菌の生存のためのアッセイは、示されている。

このビデオプロトコルでは、(1) 培養した蚊の細胞からボルバキア共生細菌を精製し、(2) 蛍光アッセイを用いて…するための手順を実演します。

私の名前はコートニー・ストンです。ジョンズ・ホプキンス・ブルームバーグ公衆衛生大学院のジェイソン・ラスコン博士の研究室に所属しています。本日は、培養昆虫細胞からの細菌精製を行います。この手順は非常にシンプルです。まず細胞を回収し、ガラスビーズを用いたライシス（溶菌）によって真核生物の宿主細胞膜を物理的に破壊します。その後、分画遠心法を用いて、宿主細胞の残渣から細菌を分離します。その後、一連のろ過工程を用いて宿主細胞の粒子をさらに除去し、最終的に精製された細菌ペレットのみが得られるようにします。これは実際的に重要な要件の一つです。こちらは細胞培養用フードであり、細胞培養は非常に汚染されやすいため、すべてを無菌状態に保つために使用されます。また、細胞培養培地と細胞本体が必要であり、これらはプラスチックフラスコで培養します。さらに、3 mmのビーズ、50 mlコニカルチューブ、および遠心分離機が必要です。遠心分離機は、細菌をペレット化するための約18,000 Gの高速度遠心分離が可能であると同時に、宿主細胞をペレット化するための約3,000 Gまたは2,500 Gでの回転も可能なものである必要があります。それでは、まず培養した細胞から開始します。これらは培養されていますね？これらは T 75 フラスコです。15 ml の培地と、私たちのサンプルが入っています。まず、細胞層を剥離し、50 ml遠心チューブに回収します。細胞層をスクイジーのように上下に擦ることで、すべての細胞を培地中に分散させます。細胞が培地に懸濁したら、それらをピペットで50 mlコニカルチューブに移します。次に、2つの細胞懸濁液に3 mmのガラスビーズを加えます。これらのビーズはオートクレーブ滅菌されており、再利用が可能です。洗浄して漂白剤に浸した後、再度オートクレーブ滅菌して使用することができます。ガラス瓶Bの口が遠心チューブの口に触れないように注意しながら注ぎ入れます。各遠心チューブに、5 mLの目盛り量までガラスビーズを入れます。次に、細菌を懸濁液中に放出させるため、物理的に酵母細胞を破砕します。ボルテックスミキサーを使用し、最高速度に設定して5分間撹拌します。このように、3 mmのガラスビーズと共に細胞を5分間ボルテックスし、その後、清潔なピペットを用いて上清を清潔で滅菌済みの50 mL遠心チューブに分取します。こうして、放出された細菌と溶液、および全細胞破砕物からなる懸濁液が作成されます。次のステップでは、低速遠心分離を行い、粗い物質をペレットとして沈殿させ、細菌を懸濁液中に残します。遠心分離機を使用し、2,500 ×g で 10 分間遠心分離します。また、底部にペレットを効率よく回収するため、4 °C で遠心分離を行います。そして、これをここにセットし、バランスが取れていることを確認し

maintaining-wolbachia-in-cell-free-medium

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JoVE Journal

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生物学

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学ぶ、Anopheles gambiae細胞からWolbachia pipientisを精製し、無細胞培地で培養する方法。ガラスビード破砕と遠心分離を用いた細菌生存性アッセイの確立により、昆虫共生細菌研究に貢献します。

無細胞培地でボルバキアの維持

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