Name: 完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞をフィーダーフリー培養に適応させる方法。KSR-FF培地を用いて、MEFからの継代、培養皿の準備、日常の維持管理を行い、多能性マーカーによる評価も含む。

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注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。 開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。 Geltrexコーティングした培養皿の準備注意：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください<ol><li> 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。 注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。 </li><li> Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。 </li><li>乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に 注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。 </li><li>使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。 </li></ol>完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備<ol><li> 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。 <table border="0"><tbody><tr><td>塩基性FGF </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10％BSA </td><td> 10μL </td></tr></tbody></table> 注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。 </li><li> 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。 <table border="0"><tbody><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 100mgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 mLの</td></tr></tbody></table></li><li>完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地は無菌的に以下の表に示すコンポーネントを組み合わせて100 mlを調製する。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012） </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 mLの</td></tr><tr><td>グルタミン- I（製品番号35050〜061） </td><td> 200mMの</td><td> 2mMの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028） </td><td> - </td><td> 20パーセント</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01） </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> bFGFの（カタログ番号。PHG0024） </td><td> 10μg/ mLの</td><td> 20 ng / mLの</td><td> 200μL </td></tr></tbody></table>最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。 </li><li>温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 - メルカプトエタノールの必要量（55 mMストック濃度）を追加します。例えば、KSR - FFの培地100mlを準備することは2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）あるいは55mmの182μLを追加、2 - メルカプトエタノールは、のために1X完了培地に添加し、2〜8℃で保存することができる最大1週間まで。 </li></ol> KSR - FFミディアムに性IPSCを適応<ol><li>起動する前に、フードの室温におGeltrexコートディッシュをあらかじめ平衡化します。 </li><li> MEFフィーダー細胞上の文化は性IPSC彼ら70〜80％コンフルエントになるまで。 MEFベースの文化のプロトコルのためGIBCOマウス胎児線維芽細胞のハンドブックを参照してください。 </li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 <li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li>培養皿から培地を吸引し、ディスパーゼソリューションの適切な量を追加します。 3〜5分間37℃で料理をインキュベートする。 </li><li>各培養容器からディスパーゼソリューションを吸引し、D - PBS（2〜3倍）で穏やかにMEFフィーダー細胞を洗い流してください。 </li><li>それぞれの培養容器に完全ノックアウトSR媒体の適切な量を追加。静かに培養容器の表面から細胞をこすり取る際には、セルスクレイパーまたは5 mLのピペットを使用してください。 注：iPS細胞ラインに適応するのは難しいため、代替適応プロトコルについては、付録Aを参照して、 </li><li>別の15 mLコニカルチューブに各培養皿から細胞懸濁液を収集する。完全なノックアウトSR媒体の適切な量と各培養容器をすすぎ、およびD - PBSで細胞懸濁液を含む15 mLコニカルチューブに培地をすすぎに追加します。単一の細胞に細胞塊を壊さないように注意が必要です</li><li>ペレット性IPSC〜5分間、200 xgで15 mLコニカルチューブを遠心する。 </li><li> IPSCペレットから上清を吸引除去する。スプリット比（表1）によるとKSR - FF媒体の適切な量のペレットを再懸濁する。小さな塊が表面にうまく接続していないので、小さいサイズにし、細胞塊を分割しないでください。 注：性IPSCはIPSC MEFの培養培地からKSR - FFの培地に直接継代された後、我々はまず、3継代のための1:2の分割比をお勧めします。通常は、1:3および1:5の間でスプリット比は適切ですが、1:2の継代は、フィーダーフリー文化に適応する際に必要な細胞の高密度を実現します。 </li><li> Geltrexコートディッシュ上性IPSCをめっきする前に、事前にコートしたディッシュから残留Geltrexソリューションを吸引し、ゆっくりと各培養皿に細胞懸濁液の適切な量を追加します。注：メッキの前に皿を洗っていない。 </li><li>皿の表面を横切って細胞を分散させるために側に数回に前後に培養皿を移動し、サイド。ゆっくりと空気中の4〜6％CO 2の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。 KSR - FFによる使用済み培地を毎日交換してください。 </li></ol> KSR - FFを用いてヒトiPS細胞を継代<ol start="13"><li>細胞は70〜80％コンフルエントと継代培養する準備ができていることを確認するために顕微鏡下で完全なKSR - FFに成長している人間性IPSCを守ってください。図1を参照してください。 注：コロニーがあまりにも密すぎたり大きくなり場合、増加分化が発生する。 </li><li>切り出しと文化を継代する前にあらゆる差別IPSCコロニーを削除します。 </li><li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li>ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。 </li><li>ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コー​​ト全体の細胞表面をにスワール培養容器を。 </li><li> 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。 </li><li>インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。 </li><li>優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。 </li><li>静かに切り離されていない任意のセルを"オフ噴霧"、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。 </li><li>ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。 </li><li>ゆっくりと完全にチューブの底から細胞ペレットを取り除くために、チューブをフリック。 </li><li>静かに5mLの血清学的ピペットを用いて予め平衡KSR - FFで細胞を懸濁します。粉薬しないでください。注：それは静かに損傷を避けるために、力を使わずに細胞を再懸濁するステップで非常に重要です。 </li><li>目的のスプリット比で新鮮な60 mmのGeltrex -コートしたディッシュに細胞を移し、その表面を横切って細胞を分散させる側にし、サイド前後に数回の培養皿を移動する。 </li><li>の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます4から6パーセントの空気中のCO 2。 </li><li>次の日、穏やかに細胞破片を除去するためにKSR - FFで使用済み培地を交換してください。その後毎日の使用済み培地を交換してください。 （およそ4-5日）、必要に応じてそれらを毎日通過iPS細胞を守ってください。継代は細胞が70-80％のコンフルエントに達したときに推奨されます。 iPS細胞の凍結保存および解凍の場合は、"完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingと回復"という我々のプロトコルを参照してください。 </li></ol>予想される結果<img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="顕微鏡下での細胞培養;細胞増殖の研究;顕微鏡イメージング;生物学的研究。" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="図1"> 図1下の位相コントラスト画像は、完全にノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地を使用してGeltrexコーティングした培養皿上に成長性IPSCを示しています。性IPSCは、大規模な核とわずかな細胞質を特徴とヒトES細胞への形態似て示す。 （40倍拡大） <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 35mmのディッシュ </td><td> 60ミリメートルディッシュ </td><td> 100mmディッシュ </td></tr><tr valign="top"><td>完全にノックアウトSR培地</td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr><tr valign="top"><td> Geltrexソリューション</td><td> 1 mLの</td><td> 1.5 mLの</td><td> 4〜5 mLの</td></tr><tr valign="top"><td>ディスパーゼ</td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 3〜4 mLの</td></tr><tr valign="top"><td>すすぎのためのD - PBS </td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr></tbody></table> 表1。推奨されるボリューム <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">付録を見るにはここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産Life Technologies社によって採用されています。

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. no. 12660-012</td><td>注：代替のDMEM製品の使用については付録を参照してください</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic、ヒト組換えタンパク質、10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td><td>注：代替のbFGFパックサイズについては付録を参照してください</td></tr><tr><td>2-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td></td><td>Cat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. no. 17105-041</td><td>注：代替の継代方法については付録を参照してください</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムおよびマグネシウム不含 Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td></td><td>Cat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>滅菌組織培養フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター（37&amp;#x00B0;Cに設定）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス（37&amp;#x00B0;Cに設定）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌セロロジカルピペット (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm 組織培養処理済みディッシュ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトips細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。 GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。 従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンはまだノックアウトSRの使用を維持しながら、フィーダーフリーへの移行、お尻の細胞培養を容易にできるようにノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。

以下のプロトコルは、完全なノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地（KSR - FF）を使用して、フィーダーフリー文化に人間の人工多能性幹（iPS）細胞を適応させるための命令が用意されています。適応一度、継続的に維持するための手順も記載されています。

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

2006年、ヒトおよびマウスの線維芽細胞をリプログラミングすることで、胚性幹細胞と極めて類似した特性を持つiPS細胞を生成できることが発見されました1-3。

この手順の全体的な目的は、完全ノックアウト血清代替物を含むフィーダーフリー培地を用いて、ヒト人工多能性幹細胞をフィーダーフリー培養に適応させ、維持することです。まず、Gelt、TRX、またはCell Startでコーティングしたプレートを準備します。次に、ディスクスペースを用いて、iPS細胞をMEFからフィーダーフリー培地へと継代します。本手順の最終ステップは、iPS細胞を常にフィーダーフリー状態で維持することです。最終的に、多能性マーカーを用いた免疫染色により、mTeSR培養で見られるものと同様の細胞増殖と幹細胞性が示される結果を得ることができます。こんにちは、Life Technologies社のGIB共同サイトのKate Wagnerです。この手法の既存の手法に対する主な利点は、ワークフロー全体を通じてノックアウト血清代替物（KnockOut Serum Replacement）を使用することで、細胞培養における時間の節約と一貫性の向上が図れることです。現在、ノックアウト製品ファミリーには、ヒト胚性幹細胞、マウス胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞のための、フィーダー依存的、フィーダーフリー、およびゼノフリー条件に対応した培地と試薬の全リストが含まれています。KSRは、誘導、増殖、拡大、凍結保存、および分化の初期段階に使用できます。このビデオでは、フィーダーフリー条件下でKSRを用いて細胞を適応させ、継代する方法を説明します。フィーダーフリー条件下でヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を適応および継代させるには、Gel TRXコーティング済みの培養皿が必要です。コーティング皿を準備する前日に、Gel TRX 1本を冷蔵庫に一晩置いてゆっくりと融解させてください。翌日、融解したGel TRXを基礎培地で100倍に希釈します。具体的には、基礎培地 99 mLが入ったボトルにGel TRX 1 mLを移します。溶液を静かに混ぜ合わせてください。基礎培地にはKnockOut DMEM/F12の使用を推奨しますが、その他の選択肢についてはプロトコルの本文をご参照ください。各培養皿の表面全体をGelrex溶液で覆います。60 mmディッシュ1枚につき、Gelrex溶液を1.5 mL添加してください。ディッシュを37 °Cで1時間インキュベートします。予備のプレートはパラフィルムで密閉し、冷蔵庫で最大4週間保存できます。希釈したgelt TRXの余剰分は分注して-20 °Cから-80 °Cで保存可能ですが、使用前の繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。TRXコーティング済みのゲル皿をクリーンベンチまたはフローフードに移し、室温に馴化させます。あわせて、必要となる他のすべての試薬を準備し、すべての培地が37 °Cに馴化され、適切にガス置換されていることを確認してください。ヒトIPCをフィーダーフリー培地に適応させるための一次培養を行います。iPS細胞をメス feeder 細胞上で 70 〜 80% コンフルエントになるまで培養します。各 60 mm 培養皿から培地を吸引し、1 mL の適量の Dispa 溶液を加えます。この状態で、培養皿を 37 °C で 3 〜 5 分間インキュベートします。各培養皿からdispa溶液を吸引し、DPBSを用いてmethフィーダー細胞を2〜3回そっと洗い流します。次に、各培養皿に適切な量の完全血清代替培地を加えます。セルスクレーパーを用いて、皿の表面から細胞を優しく剥離させます。各ディッシュから細胞懸濁液を回収し、別々の15 mLコニカルチューブに入れます。各培養ディッシュを適量の完全血清代替培地で洗浄し、その洗浄液を細胞懸濁液の入った15 mLコニカルチューブに加えます。15 mLコニカルチューブを室温で200 Gにて5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、廃棄します。チューブを軽く叩き、チューブ底から細胞ペレットを完全に剥離させます。希望する継代比に応じて、適切な量の完全血清代替フィードフリー培地を加えます。そして、ペレットを緩やかに再懸濁させます。小さな凝集塊は表面にうまく接着しないため、細胞の塊をそれ以上小さく砕かないでください。あらかじめ準備したgel Rexコーティング済み培養皿から、残っているgel TRE溶液を吸引し、適切な量の細胞懸濁液を各培養皿にゆっくりと加えます。培養皿を前後左右に数回動かし、細胞を皿の表面全体に分散させます。培養皿を、37 °C、4～6% CO2 湿潤環境のインキュベーターにそっと入れます。その後、細胞が約70～80% コンフルエントになるまで、毎日古い培地を交換します。完全血清代替物およびフィーダーフリー培地で培養したヒト人工多能性幹細胞が70～80%コンフルエントになった時点で、継代準備が整ったことになります。分化した細胞が存在する場合は、継代前にそれらを除去してください。ピペットを用いて60 mm培養皿から使用済みの培地を吸引し、細胞を2回洗浄します。DPBSを用いて、あらかじめ温めておいたディスクベース溶液 1 mL を培養皿に緩やかに加えます。培養皿を揺らし、細胞表面全体をコーティングします。37 °C で 3 ～ 5 分間インキュベートします。次に、細胞分散液を吸引し、DPBSで細胞を2回静かに洗浄します。完全血清代替物およびフィーダーフリー培地を加え、培養皿の表面から細胞を静かに掻き取ります。セルスクレーパーを用いて、細胞を滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。培養皿を完全血清代替物で2回すすぎます。フィーダーフリー培地を緩やかに散布し、剥離していない細胞を洗い流します。2回の洗浄で回収した培地と細胞を15 milliliterチューブに回収します。細胞ペレットを乱さないように、室温で200 G、5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を注意深く吸引して廃棄します。チューブを軽く弾き、チューブ底部から細胞ペレットを完全に剥離させます。完全血清代替液を用いて、細胞を穏やかに再懸濁します。5 mL セロロジカルピペットを用いて、フィーダーフリー培地を加えます。トリプシン処理は行わないでください。目的の分割比で、細胞を新しい 60 mm Geltrex コーティング済ディッシュに移します。培養皿を前後左右に数回動かし、細胞を表面全体に分散させます。翌日、培養皿を37 °C、4～6% CO2加湿環境のインキュベーターに入れます。使い切った培地を完全血清代替物で慎重に交換してください。細胞残渣を除去するため、新鮮な培地を添加します。その後は、毎日使用済みの培地を交換してください。この位相差像は、完全血清代替品を含むフィーダーフリー培地を用い、gelt TRXコート培養皿で培養したヒト人工多能性幹細胞を示しています。IPCは、大きな核と少ない細胞質を特徴とするヒト胚性幹細胞に類似した形態を示します。免疫染色の結果、ノックアウト血清代替培地と成長因子カクテルを用いて培養したIPCは、多能性マーカーであるOCT4およびSSEA4を発現していました。このビデオを視聴することで、ノックアウト血清代替培地およびフィーダーフリー条件下でのIPCの順化および維持方法について十分に理解できるはずです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

学ぶ ヒトiPS細胞をフィーダーフリー培養に適応させる方法。KSR-FF培地を用いて、MEFからの継代、培養皿の準備、日常の維持管理を行い、多能性マーカーによる評価も含む。

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

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