完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

この手順の全体的な目的は、完全ノックアウト血清代替物を含むフィーダーフリー培地を用いて、ヒト人工多能性幹細胞をフィーダーフリー培養に適応させ、維持することです。まず、Gelt、TRX、またはCell Startでコーティングしたプレートを準備します。次に、ディスクスペースを用いて、iPS細胞をMEFからフィーダーフリー培地へと継代します。

本手順の最終ステップは、iPS細胞を常にフィーダーフリー状態で維持することです。最終的に、多能性マーカーを用いた免疫染色により、mTeSR培養で見られるものと同様の細胞増殖と幹細胞性が示される結果を得ることができます。こんにちは、Life Technologies社のGIB共同サイトのKate Wagnerです。

この手法の既存の手法に対する主な利点は、ワークフロー全体を通じてノックアウト血清代替物（KnockOut Serum Replacement）を使用することで、細胞培養における時間の節約と一貫性の向上が図れることです。現在、ノックアウト製品ファミリーには、ヒト胚性幹細胞、マウス胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞のための、フィーダー依存的、フィーダーフリー、およびゼノフリー条件に対応した培地と試薬の全リストが含まれています。KSRは、誘導、増殖、拡大、凍結保存、および分化の初期段階に使用できます。

このビデオでは、フィーダーフリー条件下でKSRを用いて細胞を適応させ、継代する方法を説明します。フィーダーフリー条件下でヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を適応および継代させるには、Gel TRXコーティング済みの培養皿が必要です。コーティング皿を準備する前日に、Gel TRX 1本を冷蔵庫に一晩置いてゆっくりと融解させてください。翌日、融解したGel TRXを基礎培地で100倍に希釈します。具体的には、基礎培地 99 mLが入ったボトルにGel TRX 1 mLを移します。溶液を静かに混ぜ合わせてください。

基礎培地にはKnockOut DMEM/F12の使用を推奨しますが、その他の選択肢についてはプロトコルの本文をご参照ください。各培養皿の表面全体をGelrex溶液で覆います。60 mmディッシュ1枚につき、Gelrex溶液を1.5 mL添加してください。

ディッシュを37 °Cで1時間インキュベートします。予備のプレートはパラフィルムで密閉し、冷蔵庫で最大4週間保存できます。希釈したgelt TRXの余剰分は分注して-20 °Cから-80 °Cで保存可能ですが、使用前の繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。

TRXコーティング済みのゲル皿をクリーンベンチまたはフローフードに移し、室温に馴化させます。あわせて、必要となる他のすべての試薬を準備し、すべての培地が37 °Cに馴化され、適切にガス置換されていることを確認してください。ヒトIPCをフィーダーフリー培地に適応させるための一次培養を行います。

iPS細胞をメス feeder 細胞上で 70 〜 80% コンフルエントになるまで培養します。各 60 mm 培養皿から培地を吸引し、1 mL の適量の Dispa 溶液を加えます。この状態で、培養皿を 37 °C で 3 〜 5 分間インキュベートします。

各培養皿からdispa溶液を吸引し、DPBSを用いてmethフィーダー細胞を2〜3回そっと洗い流します。次に、各培養皿に適切な量の完全血清代替培地を加えます。セルスクレーパーを用いて、皿の表面から細胞を優しく剥離させます。

各ディッシュから細胞懸濁液を回収し、別々の15 mLコニカルチューブに入れます。各培養ディッシュを適量の完全血清代替培地で洗浄し、その洗浄液を細胞懸濁液の入った15 mLコニカルチューブに加えます。15 mLコニカルチューブを室温で200 Gにて5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、廃棄します。チューブを軽く叩き、チューブ底から細胞ペレットを完全に剥離させます。希望する継代比に応じて、適切な量の完全血清代替フィードフリー培地を加えます。

そして、ペレットを緩やかに再懸濁させます。小さな凝集塊は表面にうまく接着しないため、細胞の塊をそれ以上小さく砕かないでください。あらかじめ準備したgel Rexコーティング済み培養皿から、残っているgel TRE溶液を吸引し、適切な量の細胞懸濁液を各培養皿にゆっくりと加えます。

培養皿を前後左右に数回動かし、細胞を皿の表面全体に分散させます。培養皿を、37 °C、4～6% CO2 湿潤環境のインキュベーターにそっと入れます。その後、細胞が約70～80% コンフルエントになるまで、毎日古い培地を交換します。

完全血清代替物およびフィーダーフリー培地で培養したヒト人工多能性幹細胞が70～80%コンフルエントになった時点で、継代準備が整ったことになります。分化した細胞が存在する場合は、継代前にそれらを除去してください。ピペットを用いて60 mm培養皿から使用済みの培地を吸引し、細胞を2回洗浄します。

DPBSを用いて、あらかじめ温めておいたディスクベース溶液 1 mL を培養皿に緩やかに加えます。培養皿を揺らし、細胞表面全体をコーティングします。37 °C で 3 ～ 5 分間インキュベートします。

次に、細胞分散液を吸引し、DPBSで細胞を2回静かに洗浄します。完全血清代替物およびフィーダーフリー培地を加え、培養皿の表面から細胞を静かに掻き取ります。セルスクレーパーを用いて、細胞を滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。培養皿を完全血清代替物で2回すすぎます。

フィーダーフリー培地を緩やかに散布し、剥離していない細胞を洗い流します。2回の洗浄で回収した培地と細胞を15 milliliterチューブに回収します。細胞ペレットを乱さないように、室温で200 G、5分間遠心分離して細胞をペレット化します。

上清を注意深く吸引して廃棄します。チューブを軽く弾き、チューブ底部から細胞ペレットを完全に剥離させます。完全血清代替液を用いて、細胞を穏やかに再懸濁します。

5 mL セロロジカルピペットを用いて、フィーダーフリー培地を加えます。トリプシン処理は行わないでください。目的の分割比で、細胞を新しい 60 mm Geltrex コーティング済ディッシュに移します。

培養皿を前後左右に数回動かし、細胞を表面全体に分散させます。翌日、培養皿を37 °C、4～6% CO2加湿環境のインキュベーターに入れます。使い切った培地を完全血清代替物で慎重に交換してください。

細胞残渣を除去するため、新鮮な培地を添加します。その後は、毎日使用済みの培地を交換してください。この位相差像は、完全血清代替品を含むフィーダーフリー培地を用い、gelt TRXコート培養皿で培養したヒト人工多能性幹細胞を示しています。

IPCは、大きな核と少ない細胞質を特徴とするヒト胚性幹細胞に類似した形態を示します。免疫染色の結果、ノックアウト血清代替培地と成長因子カクテルを用いて培養したIPCは、多能性マーカーであるOCT4およびSSEA4を発現していました。このビデオを視聴することで、ノックアウト血清代替培地およびフィーダーフリー条件下でのIPCの順化および維持方法について十分に理解できるはずです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。