完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ
July 15th, 2010
このプロトコルはノックアウトSRの凍結保存培地でヒトiPS細胞をcryopreserving、完全ノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地やフィーダーベースのノックアウトSR培地でこれらの細胞を回収するための詳細な手順を説明します。
この手順の全体的な目標は、フィーダーベースまたはフィーダーフリーの培養条件でIPS細胞を凍結保存および回収することです。これは、まず通常どおりにIPCのパッケージ化を開始することで実現されます。手順の2番目のステップは、細胞を無血清凍結培地に移すことです。
手順の3番目のステップは、通常どおり凍結保存することです。手順の最後のステップは、細胞を解凍してメンテナンスを開始することです。最終的には、無血清凍結培地中のIPS細胞の凍結および融解が、健康な形態および融解後の回復を通じて成功したことを示す結果を得ることができます。
こんにちは、Life TechnologiesのGCOサイトのKate Wagnerです。IPCは凍結やT罰金に非常に敏感であるため、このプロトコルを視覚的にデモンストレーションすることが重要です。このプロトコールを容易にするのは、ノックアウト血清の補充をワークフロー全体で使用できることです。
現在、KSRファミリーの製品には、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のフィーダーベースのフィードフリーおよびゼノフリー培養用の培地および試薬の全リストが含まれています。KSRは、誘導増殖、凍結保存、増殖、および分化の最初の最初のステップに使用できます。次のビデオでは、ピーターフリーマシンでKSRを使用して解凍および凍結する様子を示しています。
この手順を開始します。まず、60ミリメートル皿である培養容器から使用済み培地を吸引する水浴で摂氏37度まで適量完全フィーダーフリー培地を温めます。この場合、ヒト人工多能性幹細胞をDPBSで2回すすぎます。
次に、皿に1ミリリットルのディスパを追加します。皿を摂氏37度で3分間インキュベートします。その後、ジスパ溶液を吸引し、DPBSで細胞をやさしく洗浄します。
次に、完全なフィーダーフリー培地を皿を覆い、細胞スクレーパーを使用して細胞を静かにこすり落とし、細胞を滅菌15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。遊離培地の完全な供給で皿をすすぎ、剥離していない細胞をやさしくスプレーします。すすぎ液を細胞が入った同じ15ミリリットルのチューブに移します。
皿を培地でもう一度すすぎ、そのすすぎ液を細胞ペレット細胞で引き、室温で3分間1000RPMで遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引して廃棄します。チューブを静かにフリックして、細胞ペレットをチューブの底から完全に取り除きます。
次に、5ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、1ミリリットルの凍結培地Aを添加し、ピペットで静かに上下させて細胞を再懸濁します。塊の均一な懸濁液に続いて、細胞懸濁液を穏やかに渦巻かせて混合しながら、1ミリリットルの凍結培地Bをチューブに滴下します。各クライオバイル凍結細胞に1ミリリットルの細胞懸濁液をマイナス80°Cでイソプロパノールチャンバー内で一晩割り当てます。
翌日、細胞のバイアルを液体窒素タンクに移し、長期保存します。細胞の凍結バイアルを摂氏37度の水浴に約3〜4分間入れて、バイアルに小さな凍結チャンクが残るまで急速に解凍します。バイアルをウォーターバスから取り出した後、70%イソプロパノールをスプレーして除染し、5ミリリットルのピペットを使用してバイアルの全内容物を15ミリリットルの円錐管に無菌的に移します。
次のステップは、手順の最も難しい側面かもしれません。フィーダーフリー培地は、ゆっくりと慎重に細胞に添加する必要があります。浸透圧ショックを軽減するには 15ミリリットルの円錐管内の細胞に、4ミリリットルの完全なフィーダーフリー培地をゆっくりと滴下します。
培地を加えながら、チューブをゆっくりと前後に動かして細胞を混合します。これにより、細胞への浸透圧ショックが軽減されます。完全フィーダーフリー培地は、メスコンディショニング培地を含むノックアウト血清補充培地またはフィーダーで使用するためのノックアウト血清補充培地と交換することができます(培地調製手順については、プロトコルのテキストを参照してください)。
4ミリリットルの培地をすべて添加したら、細胞を室温で5分間1000RPMで遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さずに正気を慎重に吸引して廃棄します。細胞ペレットを4ミリリットルの完全フィーダーフリー培地に穏やかに再懸濁します。
5ミリリットルのピペットを使用して、ゲルトトラックでコーティングした60ミリメートル培養皿に細胞懸濁液を滴下します。培養皿を摂氏36〜38度のインキュベーターに入れ、空気中の二酸化炭素4〜6%の加湿雰囲気に置きます。皿を北から南、東から西のパターンで慎重に渦巻いて、細胞を均等に分散させます。
解凍後24時間。皿の中の中肉を新鮮な中肉と交換します。その後、細胞が約70〜80%コンフルエントになるまで、使用済みの培地を毎日交換します。
このコントラスト画像は、完全な血清置換、フィーダーフリー培地を使用して、ゲルトTRXコーティング培養皿で増殖したヒト人工多能性幹細胞を示しています。IPCは、大きな核と乏しい細胞質を特徴とするヒト胚性幹細胞と同様の形態を示します。解凍後の細胞とノックアウト血清置換の例。
gelt TrackX上のフィーダーフリーメディウムをここに示します。この手順に従うときは、すべての細胞コロニーを同じサイズに保つことを覚えておくことが重要です。凍結保存すると、細胞の回復が向上します。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
このプロトコルは、KnockOut SR凍結保存培地を使用してヒトの誘導多能性幹（iPS）細胞を凍結保存し、完全なKnockOut SR Feeder Free（KSR-FF）培地またはフィードベースのKnockOut SR培地で回復させる手順を概説しています。凍結と解凍の過程でのiPS細胞の感受性のため、視覚的な実演の重要性が強調されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 幹細胞研究
- 凍結保存技術
背景
- ヒトのiPS細胞は凍結と解凍のプロセスに敏感です。
- KnockOut SR製品は、幹細胞培養の様々な段階を促進します。
- 適切な凍結保存は細胞の生存率を維持するために重要です。
- フィードフリーとフィードベースの培養条件は、iPS細胞に使用できます。
研究の目的
- iPS細胞の信頼できる凍結保存プロトコルを提供すること。
- 解凍後の細胞の成功的な回復を確保すること。
- ワークフロー全体を通じてKSR製品の使用を示すこと。
使用方法
- 凍結保存のためのiPS細胞の準備。
- 細胞保存のための無血清凍結培地の使用。
- -80度セルシウスでの凍結保存とその後の液体窒素での保存。
- 完全なフィードフリー培地で細胞の解凍と再懸濁。
主な結果
- 健康的な形態によって確認されたiPS細胞の凍結と解凍の成功。
- 細胞はフィードフリーとフィードベースの両方の条件下で生存率と成長を維持しました。
- 細胞回復の視覚的評価を通じてプロトコルの有効性が確認されました。
- 均一な細胞コロニーサイズの維持は回復率を向上させました。
結論
- このプロトコルは、iPS細胞の凍結保存に対する体系的なアプローチを提供します。
- KnockOut SR製品は、プロセス中の細胞の健康維持に効果的です。
- 視覚的な実演は、プロトコルの理解と実行を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
