Name: 完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶヒトiPS細胞の凍結保存と回復法。KnockOut SR無血清培地を用いてフィーダー非依存培養で細胞を凍結し、液体窒素で長期保存後、37度で融解して生存率を維持する技術を解説します。

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注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。 開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。 Geltrexコーティングした培養皿の準備注：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください。 <ol><li> 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。 注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。 </li><li> Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。 </li><li>乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に 注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。 </li><li>使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。 </li></ol>完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備<ol><li> 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。 <table border="0"><tbody><tr><td>塩基性FGF </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10％BSA </td><td> 10μL </td></tr></tbody></table> 注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。 </li><li> 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。 <table border="0"><tbody><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 100mgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 mLの</td></tr></tbody></table></li><li>完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）100mLを準備するには無菌的に以下の表に記載されているコンポーネントを組み合わせる。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012） </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 mLの</td></tr><tr><td>グルタミン- I（製品番号35050〜061） </td><td> 200mMの</td><td> 2mMの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028） </td><td> - </td><td> 20パーセント</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01） </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> bFGFの（カタログ番号。PHG0024）。 </td><td> 10μg/ mLの</td><td> 20 ng / mLの</td><td> 200μL </td></tr></tbody></table> 最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。 </li><li>温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 -メルカプトエタノールの必要量 （55 mMストック濃度）を追加します 。例えば、KSR - F 100mLを準備するFの培地は55 mM 2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）182μLを加える代わりに、2 - メルカプトエタノールは、1X完了培地に添加し、2〜8℃で1週間までのCで保存することができます。 </li></ol>凍結/凍結保存培地の準備凍結保存培地は2つのメディアから構成され、彼らは別々のタイミングで細胞に添加され、分離されたままにしておく必要があります凍結培地及び凍結培地のB.。彼らは、それぞれの凍結保存媒体の総容積の50％が必要とされています。必要に応じて凍結保存媒体の総体積は、フリーズしたように各バイアルに1 mLです。ヒトES細胞の90％コンフルエント60ミリメートル皿は凍結保存媒体でヒトES細胞のバンク2バイアルに使用することができます。 超過を確実にするために付加的な2 - 5mLを使用して各凍結培地の十分なボリュームを準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td>凍結培地（最終容量の50％）： </td><td> 50パーセントDMEM/F12 </td><td> 50％のKSR </td></tr><tr><td>凍結培地B（最終容量の50％）： </td><td> 80パーセントDMEM/F12 </td><td> 20％DMSO </td></tr></tbody></table>例： あなたが細胞の20バイアルを凍結している場合は、凍結保存培地の20mlのが必要になります。 24mL凍結保存培地の合計のために超過分を4mlのを追加。それはあなたが凍結培地（24mLの50％）および凍結培地Bの12mL（24mLの50％）の12mL必要があることを意味します。 <table border="1"><tbody><tr><td>凍結培地（12 mL）中： </td><td> 6 mLのDMEM/F12 </td><td> 6 mLのKSR </td></tr><tr><td>凍結培地B（12 mL）中： </td><td> 9.6 mLのDMEM/F12 </td><td> 2.4mLのDMSO </td></tr></tbody></table>凍結保存培地の最終組成は65％DMEM/F12、25％KSR、および10％DMSOである。 Cryopreserving性IPSC <ol><li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、表の1belowを参照してください。 </li><li>ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。 </li><li>ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コー​​ト全体の細胞表面をにスワール培養容器を。 </li><li> 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。 </li><li>インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。 </li><li>優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。 </li><li>静かに切り離されていない任意のセルを&quot;オフ噴霧&quot;、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。 </li><li>ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。 </li><li> cryovialsの十分な量を準備します。細胞はDMSOと接触していると、彼らは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。 </li><li>ゆっくりと完全に[穏やかに5 mLの血清学的ピペットを使用して上下にピペッティングして]を凍結培地Aにチューブの底からの細胞ペレットと再サスペンド細胞を取り除くために、チューブをフリック。穏やかに混合して細胞懸濁液を渦巻くながら、塊の均一な懸濁液に続いて、、滴下方法で、それに凍結培地Bの等量を追加します。 注：この時点で、細胞はDMSOと接触している、と作業が効率的に実行する必要があります。いったん細胞はDMSOと接触している、それらは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。 </li><li>各クライオバイアルに細胞懸濁液のアリコートを1ミリ​​リットル。 </li><li> ℃で一晩迅速ミスターフロスティでバイアルを配置[急速に凍結する]、-80に転送します。 </li><li> -80℃で一晩保管° Cの後、長期保管のための液体窒素タンクにセルを転送する。 </li></ol> IPSCバイアルの雪解けと細胞の回復注：KSR - FFは、KSR含有MEF -馴化培地、またはフィーダで使用するためのKSRの培地で置き換えられるかもしれません。メディアを準備するための指示については、付録を参照してください。 50 mlチューブにKSR - FF媒体のプレ暖かい10mLを。 <ol><li>ちょうどあなたのめっき前に室温にGeltrex - コートディッシュの適切な量を平衡化し、皿から液体を吸引するR細胞。 </li><li>慎重にヒトES細胞（またはIPSC）液体窒素貯蔵タンクからバイアルを取り外してください。 </li><li>ちょうど小さな冷凍チャンクがバイアルになるまで急速に、37 ° Cの水浴中で細胞の凍結バイアルを解凍。 </li><li>それを除染し、無菌組織培養フードにそれを転送するためにイソプロパノール70％スプレーバイアル。 </li><li>無菌的に5 mLのピペットを用いて15 mLコニカルチューブにバイアルの内容全体を転送する。 </li><li> KSR - FF 1 mlのバイアルをリンスし、15 mlの遠心チューブに以下を追加。 </li><li>ゆっくりと、KSR - FFの4 mLの15mlのコニカルチューブに細胞に滴下して加える。培地を添加しながら、穏やかに細胞を混合する前後にチューブを移動します。 （これは細胞に浸透圧ショックを減らす）。 </li><li>室温で2分間1000rpm（200 × g）で細胞懸濁液を15 mLの試験管を遠心します。 </li><li>慎重に吸引し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を捨てます。 </li><li> 5 mLのピペットを用いて予め温めておいたKSR - FF（例えば4mL/60 mmディッシュ）で細胞ペレットを再サスペンドし、細胞ペレットが完全に分散されるまで静かに上下のセルをピペッティング。生存率が70％未満の場合は70％を超えるの生存率が期待されている、しかし、それは、コンフルエントに達するために、細胞のために時間がかかることがあります。 </li><li>同じピペットを使用して、細胞懸濁液を室温に平衡化Geltrexコーティングした培養皿に滴下して転送する。 </li><li>空気中の4〜6％CO 2の加湿雰囲気下で、37℃インキュベーターで培養皿を置きます。均等に細胞を分散させる西側パターンに南、東、北に慎重にスワール容器。 </li><li>静かに培養皿24時間の解凍後、細胞破片を除去すると料理が約70〜80％コンフルエントになるまで、新鮮な栄養素を提供するために、その後毎日流体変更。あなたのiPS細胞の継続的な文化と継代については、&quot;完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー培養と継代&quot;というタイトルの我々のプロトコルを参照してください。 </li></ol>予想される結果細胞は、前の凍結保存にコンフルエントおよそ70から80パーセントにする必要があります。アップカーリングとコロニーの縁に沿ってコロニーの折り畳みのディスパーゼの消化は結果。細胞を収穫した後、彼らは、凍結保存メディアの小さな塊として凍結されています。バイアルを融解されると、細胞が回復し、小さな塊としてプレコートしたディッシュに付着する。彼らは急速に5-6日でコンフルエント皿につながる成長する。 表1 - 推奨ボリューム<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 35mmのディッシュ </td><td> 60ミリメートルディッシュ </td><td> 100mmディッシュ </td></tr><tr><td>完全にノックアウトSR培地</td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr><tr><td> Geltrexソリューション</td><td> 1 mLの</td><td> 1.5 mLの</td><td> 4〜5 mLの</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 3〜4 mLの</td></tr><tr><td>すすぎのためのD - PBS </td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr></tbody></table>してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">付録を見るにはここをクリック</a> 。

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産Life Technologies社によって採用されています。

<table><tbody><tr><td>ノックアウトDMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>注：代替DMEM製品GlutaMAX-I（カタログ番号 35050-061）の使用については、付録を参照してください。</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement 成長因子カクテル</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic、ヒト組換えタンパク質、10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>注：bFGFの代替パックサイズについては付録を参照してください。</td></tr><tr><td>2-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ディスパッセ</td><td></td><td>17105-041</td><td>注：別の継代方法については付録を参照してください。</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified 減少成長因子基底膜マトリックス, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&amp;rsquo;カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>無菌組織培養フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターを37℃に設定する&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスを37℃に設定する&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みセロロジカルピペット（5 mL、10 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm 組織培養処理済みディッシュ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素保存タンク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール凍結容器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL凍結保存チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトips細胞のcryopreservingおよびリカバリ

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。 GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。 従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンでは、フィーダーフリーへの移行はお尻とhES細胞の培養を、まだノックアウトSRの使用を維持しながら簡単にできるように、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。

このプロトコルはノックアウトSRの凍結保存培地でヒトiPS細胞をcryopreserving、完全ノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地やフィーダーベースのノックアウトSR培地でこれらの細胞を回収するための詳細な手順を説明します。

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

2006年、ヒトおよびマウスの線維芽細胞をリプログラミングすることで、胚性幹細胞と著しく類似した特性を持つiPS細胞を生成できることが発見されました 1-3。

この手順の全体的な目的は、フィーダーありまたはフィーダーフリーの培養条件下でiPS細胞を凍結保存し、回復させることです。まず、通常の手順でiPS細胞のパッキングを行い、次に細胞を無血清凍結保存液に移すことでこれを達成します。手順の3番目のステップは、通常の方法で凍結保存を行うことです。手順の最終ステップは、細胞を融解し、維持培養を開始することです。最終的に、無血清凍結保存培地を用いてiPS細胞を凍結および融解し、融解後の健全な形態と回復が確認されたことで、凍結・融解が成功したという結果を得ることができます。こんにちは、Life TechnologiesのGCOサイトのKate Wagnerです。iPS細胞は凍結や温度の変化に非常に敏感であるため、このプロトコルの視覚的なデモンストレーションが極めて重要になります。このプロトコルを容易にするのは、ワークフロー全体を通してノックアウト血清代替物を使用できることです。現在、KSR製品ファミリーには、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のフィーダー依存的、フィーダーフリー、およびゼノフリー培養のための、培地および試薬の完全なラインナップが含まれています。KSRは、樹立、増殖、凍結保存、拡大、および分化の初期段階に使用できます。次のビデオでは、フィーダーフリー条件下でKSRを用いた細胞の融解および凍結について説明します。本手順を開始するために、まず適量の完全フィーダーフリー培地をウォーターバスで37 °Cに温めておきます。60 mmディッシュである培養容器から、使い切った培地を吸引します。この際、ヒト人工多能性幹細胞をDPBSで2回洗浄してください。次に、1 mLのdispaをディッシュに加えます。ディッシュを37 °Cで3分間インキュベートします。その後、dispa溶液を吸引し、DPBSで細胞を穏やかに洗浄します。次に、ディッシュ全体を覆うように完全フィーダーフリー培地を加え、セルスクレーパーを用いて細胞を穏やかに剥離させ、滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。ディッシュを完全フィーダーフリー培地でリンスし、剥離していない細胞を穏やかに洗い流します。このリンス液を、細胞が入った同じ15 milliliterチューブに移します。培養液でディッシュを2回目にすすぎ、細胞を含むその洗浄液を回収します。室温で1000 RPM、3分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、廃棄します。チューブを軽く叩き、チューブ底から細胞ペレットを完全に剥離させます。次に、5 mL セロロジカルピペットを用いて、凍結培地Aを1 mL加え、ゆっくりとピペッティングして細胞を再懸濁します。凝集塊が均一に懸濁された後、細胞懸濁液をゆっくりと回転させながら混ぜ合わせつつ、凍結培地Bを1 mLずつ滴下してチューブに加えます。細胞懸濁液を各クライオバイアルに1 mLずつ分注し、イソプロパノールチャンバーを用いて-80 °Cで一晩凍結させます。翌日、細胞が入ったバイアルを液体窒素タンクに移し、長期保存します。凍結保存された細胞バイアルを37 °Cのウォーターバスに約3〜4分間浸し、バイアル内に小さな氷の塊がわずかに残るまで急速解凍します。バイアルをウォーターバスから取り出した後、70%イソプロパノールをスプレーして除染し、5 mLピペットを用いて、バイアルの内容量すべてを15 mLコニカルチューブに無菌的に移します。次のステップは、本手順の中で最も困難な工程かもしれません。フィーダーフリー培地は、ゆっくりと慎重に細胞に添加する必要があります。浸透圧ショックを軽減するため、15 mLコニカルチューブ内の細胞に、完全フィーダーフリー培地 4 mLをゆっくりと滴下して加えてください。培地を加える際、チューブを前後にゆっくりと動かして細胞を混合させます。これにより、細胞への浸透圧ショックを軽減できます。コンプリートフィーダーフリー培地は、meth条件化培地を含むノックアウト血清代替物、またはフィーダー細胞使用用のノックアウト血清代替培地で代用可能です。培地の調製手順については、プロトコルの本文を参照してください。4 mLの培地をすべて加えた後、細胞を室温で1000 RPMで5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、除去します。細胞ペレットを4 mLの完全フィーダーフリー培地で穏かに再懸濁します。5 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をgeltracコーティングされた60 mm培養皿にゆっくりと滴下します。培養皿を、空気中に4〜6%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気の36〜38 °Cインキュベーターに入れます。細胞を均一に分散させるため、皿を南北および東西方向に慎重に円を描くように揺らします。融解から24時間後、ディッシュ内の培地を新鮮な培地に交換します。その後、細胞が約70～80%コンフルエントになるまで、毎日古くなった培地を交換してください。このコントラスト像は、完全血清代替物およびフィーダーフリー培地を用い、Gelt TRXコーティング済みの培養皿で培養されたヒト人工多能性幹細胞を示しています。iPS細胞は、大きな核と少ない細胞質を特徴とするヒト胚性幹細胞に類似した形態を示しています。これは、解凍後および血清代替物除去後の細胞の一例です。gelt TrackX上のフィーダーフリー培地がここに示されています。この手順に従う際は、すべての細胞コロニーを同じ大きさに保つことが重要です。これにより、凍結保存時の細胞回収率が向上します。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の最適段階での凍結保存

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

学ぶヒトiPS細胞の凍結保存と回復法。KnockOut SR無血清培地を用いてフィーダー非依存培養で細胞を凍結し、液体窒素で長期保存後、37度で融解して生存率を維持する技術を解説します。

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

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