完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

この手順の全体的な目的は、フィーダーありまたはフィーダーフリーの培養条件下でiPS細胞を凍結保存し、回復させることです。まず、通常の手順でiPS細胞のパッキングを行い、次に細胞を無血清凍結保存液に移すことでこれを達成します。

手順の3番目のステップは、通常の方法で凍結保存を行うことです。手順の最終ステップは、細胞を融解し、維持培養を開始することです。最終的に、無血清凍結保存培地を用いてiPS細胞を凍結および融解し、融解後の健全な形態と回復が確認されたことで、凍結・融解が成功したという結果を得ることができます。

こんにちは、Life TechnologiesのGCOサイトのKate Wagnerです。iPS細胞は凍結や温度の変化に非常に敏感であるため、このプロトコルの視覚的なデモンストレーションが極めて重要になります。このプロトコルを容易にするのは、ワークフロー全体を通してノックアウト血清代替物を使用できることです。

現在、KSR製品ファミリーには、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のフィーダー依存的、フィーダーフリー、およびゼノフリー培養のための、培地および試薬の完全なラインナップが含まれています。KSRは、樹立、増殖、凍結保存、拡大、および分化の初期段階に使用できます。次のビデオでは、フィーダーフリー条件下でKSRを用いた細胞の融解および凍結について説明します。

本手順を開始するために、まず適量の完全フィーダーフリー培地をウォーターバスで37 °Cに温めておきます。60 mmディッシュである培養容器から、使い切った培地を吸引します。この際、ヒト人工多能性幹細胞をDPBSで2回洗浄してください。

次に、1 mLのdispaをディッシュに加えます。ディッシュを37 °Cで3分間インキュベートします。その後、dispa溶液を吸引し、DPBSで細胞を穏やかに洗浄します。

次に、ディッシュ全体を覆うように完全フィーダーフリー培地を加え、セルスクレーパーを用いて細胞を穏やかに剥離させ、滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。ディッシュを完全フィーダーフリー培地でリンスし、剥離していない細胞を穏やかに洗い流します。このリンス液を、細胞が入った同じ15 milliliterチューブに移します。

培養液でディッシュを2回目にすすぎ、細胞を含むその洗浄液を回収します。室温で1000 RPM、3分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、廃棄します。チューブを軽く叩き、チューブ底から細胞ペレットを完全に剥離させます。

次に、5 mL セロロジカルピペットを用いて、凍結培地Aを1 mL加え、ゆっくりとピペッティングして細胞を再懸濁します。凝集塊が均一に懸濁された後、細胞懸濁液をゆっくりと回転させながら混ぜ合わせつつ、凍結培地Bを1 mLずつ滴下してチューブに加えます。細胞懸濁液を各クライオバイアルに1 mLずつ分注し、イソプロパノールチャンバーを用いて-80 °Cで一晩凍結させます。

翌日、細胞が入ったバイアルを液体窒素タンクに移し、長期保存します。凍結保存された細胞バイアルを37 °Cのウォーターバスに約3〜4分間浸し、バイアル内に小さな氷の塊がわずかに残るまで急速解凍します。バイアルをウォーターバスから取り出した後、70%イソプロパノールをスプレーして除染し、5 mLピペットを用いて、バイアルの内容量すべてを15 mLコニカルチューブに無菌的に移します。

次のステップは、本手順の中で最も困難な工程かもしれません。フィーダーフリー培地は、ゆっくりと慎重に細胞に添加する必要があります。浸透圧ショックを軽減するため、15 mLコニカルチューブ内の細胞に、完全フィーダーフリー培地 4 mLをゆっくりと滴下して加えてください。

培地を加える際、チューブを前後にゆっくりと動かして細胞を混合させます。これにより、細胞への浸透圧ショックを軽減できます。コンプリートフィーダーフリー培地は、meth条件化培地を含むノックアウト血清代替物、またはフィーダー細胞使用用のノックアウト血清代替培地で代用可能です。培地の調製手順については、プロトコルの本文を参照してください。

4 mLの培地をすべて加えた後、細胞を室温で1000 RPMで5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を吸引し、除去します。細胞ペレットを4 mLの完全フィーダーフリー培地で穏かに再懸濁します。

5 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をgeltracコーティングされた60 mm培養皿にゆっくりと滴下します。培養皿を、空気中に4〜6%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気の36〜38 °Cインキュベーターに入れます。細胞を均一に分散させるため、皿を南北および東西方向に慎重に円を描くように揺らします。

融解から24時間後、ディッシュ内の培地を新鮮な培地に交換します。その後、細胞が約70～80%コンフルエントになるまで、毎日古くなった培地を交換してください。

このコントラスト像は、完全血清代替物およびフィーダーフリー培地を用い、Gelt TRXコーティング済みの培養皿で培養されたヒト人工多能性幹細胞を示しています。iPS細胞は、大きな核と少ない細胞質を特徴とするヒト胚性幹細胞に類似した形態を示しています。これは、解凍後および血清代替物除去後の細胞の一例です。

gelt TrackX上のフィーダーフリー培地がここに示されています。この手順に従う際は、すべての細胞コロニーを同じ大きさに保つことが重要です。これにより、凍結保存時の細胞回収率が向上します。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。