誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

私はクリスティン・ビートンです。カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部にあるジョージ・チェンの研究室で助教を務めています。これから数日間にわたり、DAラットにおいて慢性再発型EAE（実験的自己免疫性脳脊髄炎）を誘発し、それをモニタリングする方法について解説します。

これは多発性硬化症の動物モデル、あるいは多発性硬化症の動物モデルの一つと言えます。このモデルは、動物における上行性の弛緩性麻痺と、ヒトの疾患に類似した組織学的特徴によって定義されます。したがって、この手順には数日かかることになります。

まず1日目は、完全フロイントアジュバントを用いたナイーブラット脊髄ホモジネートによるジェニックエマルションの調製方法について説明します。2日目は、ラットへのEAEの免疫方法を示し、その後7日から15日間待機して、動物に最初の臨床症状が現れるかを確認します。その時点で、個々の動物におけるEAEの進行の異なる段階について説明します。それではまず、エマルションの調製に必要なすべての試薬と器具を紹介します。

使用するのは完全フレンドアジュバントH 37 Raです。これにはすでにMycobacterium tuberculosisが含まれていますが、さらに乾燥Mycobacterium tuberculosis H 37 Raを添加し、4 mg/mLに調整します。この乾燥細菌を調製するために、乳鉢に入れ、乳棒で細かく粉砕して微粉末にします。その後、これらの細菌をアジュバントに添加します。

これでアジュバントの準備が完了しました。次のステップは抗原の調製です。-80°Cで冷凍保存されたラットの脊髄を取り出します。凍結状態を維持するため、ドライアイスを入れた計量皿の上に置き、1つずつ取り出して、カミソリの刃を用いて脊髄を計量皿の中で細かく刻みます。

次に、添加剤を加えたアジュバントをボルテックスミキサーにかけます。ボルテックス攪拌しながら、脊髄組織を少しずつアジュバントに加えていきます。脊髄組織すべてをアジュバントに混ぜ合わせた後、さらに5分間ボルテックス攪拌します。その後、調製した浸漬液を5 mLのガラス製シリンジに移します。

2本の5 mL ガラスシリンジを16 Gのブリッジで接続し、そのブリッジで可能な限り速くエマルションを一方のシリンジからもう一方へと移動させます。数分後、エマルションが硬くなり始めたら、より細いブリッジに切り替えます。ここでは18 Gを使用し、これによりエマルションをさらに硬化させます。このブリッジを装着したシリンジをアルミホイルで包み、冷蔵庫で一晩保存します。

計量紙を用いて、結核菌を30 mg量り取りました。これを乳鉢に移し、乳棒を使って細菌の凝集塊を微粉末状に粉砕しました。

ただし、細菌を破壊しないよう、乳鉢のすりこぎで強く押し付けすぎないでください。操作開始時に細菌が凝集している状態では、色はイエローベージュです。十分に細かく粉砕できれば、最終的に白い粉末になります。これが目的の状態ですが、細菌を破壊しないように、強く押し付けすぎないことが重要です。

その後、10 mLのComplete Trans助剤をアンプルで用意し、すべての細菌が懸濁していることを確認しました。このサンプルを開封し、分散させたMycobacterium tuberculosisの上に、10 mLのComplete Trans助剤をすべてモルタルに注ぎました。そして、この助剤を添加したComplete Trans助剤を50 mLチューブに移します。

それでは、補充剤を加えた完全トランスアジュバントをチューブに移します。当然ながら、細菌は液体の底に溜まっていますので、その大部分をチューブに入れられるようにします。たとえ乳鉢にいくらか残ったとしても、この乳鉢を洗浄せずに脊髄エマルションの調製に再利用するため、大きな問題にはなりません。

こちらが脊髄です。これらは-80°Cで冷凍保存されていました。これらを10 g量り取り、10 mLの添加剤入りアジュバントに加えました。

これらの脊髄をできるだけ凍結状態に保ちながら、称量皿の中でカミソリの刃を用いて非常に細かく刻みます。脊髄を細かく刻むには、2枚のカミソリの刃と称量皿が必要です。まず、脊髄を1本称量皿に入れ、切断を開始します。凍結しているため、切ると飛び散りやすいため、手で覆いながら作業します。最初に大きな塊を切り出しますが、すぐに融解し始め、カミソリの刃の側面に付着し始めます。

そこで、もう一方のカミソリの刃を使ってそれを取り出し、できるだけ細かく、かつ迅速に刻みます。溶けてしまうと切断するのが非常に困難になるため、溶ける前に作業を行う必要があります。脊髄を完全に、そして極めて細かく刻むことは非常に重要です。細かければ細かいほど、浸漬液がより均質になり、より多くのラットがより均一な病態で発症するためです。したがって、すべての脊髄を非常に丁寧に、十分に細かく刻むことが極めて重要です。

それでは、10 gすべての脊髄を処理し終えるまで、同様の手順で各脊髄を細かく砕いていきます。次に、アジュバントの添加後に乳鉢に残っているすべてのmycobacterium tuberculosisを確実に回収するため、乳鉢の中で脊髄を軽く混ぜ合わせます。その後、アジュバントをボルテックスミキサーにかけます。

可能な限り高速で連続的にボルテックスしながら、脊髄の均質化物をこのアジュバントに少しずつ加えていきます。これで、ボルテックス上にアジュバントが準備できましたので、脊髄の均質化物を少しずつ加え始めます。抗原をアジュバントに非常にゆっくりと加える理由は、油中水型のエマルションを作成するためです。

アジュバントの主成分はミネラルオイルであり、抗原は等量の溶液となっています。したがって、抗原を追加するたびにオイルが抗原を完全にコーティングできるよう、抗原を非常にゆっくりとオイルに混ぜ合わせます。一度にすべて加えてしまうと、抗原を完全にコーティングすることができません。

脊髄の平均的な量すべてをボルテックス上のアジュバントに加えました。すべてが完全に混ざり合うよう、チューブをボルテックスに固定し、さらに5分間回転させます。このとき、チューブの蓋から内容物が漏れ出さない範囲で、可能な限り高い速度に調整します。5分間のボルテックス処理が終わりましたので、ボルテックスを停止し、混合物をガラス製シリンジに転移させます。

これでシリンジを完全に組み立てました。これを大口径のブリッジに取り付け、ブリッジのもう一方の端にはシリンジのバレルのみを取り付けています。これから、そのシリンジにエマルションを加えます。それでは、始めます。

次に、すべての液体を下側のシリンジに移動させます。上側のシリンジを取り外し、上側の組み立てを完了させ、下側のシリンジ内およびブリッジ内に気泡がないことを確認します。そして、再び接続します。これで、2本のシリンジがこのブリッジを介して連結されました。

一方は完全に満たされており、もう一方は空になっています。これから行うのは、一方のシリンジのプランジャーをもう一方へ向かって、可能な限り速く往復させることです。それでは、大口径のブリッジを、より小口径の18 Gブリッジに変更します。

より小さなブリッジを使用すると、エマルションはさらに高粘度になります。そのため、ブリッジを交換する際は、まずエマルションをすべて一方のシリンジに移動させます。次に、空になったシリンジを取り外し、ブリッジ内で液剤が失われないように注意しながらブリッジを取り外します。新しいブリッジを装着し、気泡をすべて追い出してから、もう一方のシリンジを再装着します。

そして手順を繰り返します。この時点ではエマルションの透過性が大幅に低下しているため、非常に脆いこのブリッジを壊さないよう注意します。チューブ内にエマルションがある限り、別のシリンジセットを用いてこの手順を繰り返します。したがって、すべてのエマルションを使い切るために必要な数のシリンジを使用します。

乳剤を数回、おそらく10回から15回ほど混合しましたが、これはバッチによって異なります。現在、非常に通りにくくなっています。あと数回行いますが、あるいは、もう十分かもしれません。

完全に固定されたので、このままにしておきます。無理に動かすと、シリンジかブリッジのいずれかを破損させる恐れがあるためです。したがって、注入が停止した場合、それが非常に早い段階で起こったのであれば、ブリッジが詰まっている可能性があります。

しかし、この時点で、少なくとも10回から15回は混ぜ合わせたため、エマルションが完成したことになります。非常に粘度が高いため、そのままにしておきます。これからアルミホイルで包み、一晩冷蔵庫に入れておきます。

昨日、赤色の脊髄を用いたエマルションを調製し、一晩冷蔵庫で保存しました。本日は、それを冷蔵庫から取り出し、ラット1匹につき尾根に200 µLずつ注入します。ただし、注入する前に、エマルションの状態が適切であることを確認する必要があります。

したがって、依然として固体であるはずであり、良好な固体状態が維持されています。ここで見える亀裂は、それが良好な固体であること、つまり、好ましくない状態である相分離（2相への分離）が起きていないことを示しています。したがって、このエマルションは使用に適しています。

したがって、各ケージに200 µLのエマルションを投与します。注入には3 mLシリンジを使用しますが、必ずルアーロックチップ付きのシリンジを使用してください。スリップチップ付きのシリンジを使用した場合、エマルションの粘度が高いため、注入中に針が抜けてしまう可能性があるためです。

したがって、常にルアーロックタイプのシリンジを使用してください。針については、可能な限り細いものを選択しますが、今回のように粘度の高いエマルションの場合は、20ゲージの針を使用する必要があります。尾の根元に非常に正確に注入する必要があるため、ラットを数分間麻酔し、ラットが深く眠っている間に個体識別などのマーキングを行います。

個体識別にはイヤーパンチを用い、打孔パターンの違いによって各ラットを識別します。それでは、ラットへの注射準備が整いました。各ラットの尾根元にエマルションを200 µL投与し、同時に耳に印を付けます。注射にかなりの力を込める必要があり、必要量以上のエマルションを投与することを避けるため、注射器へのエマルションの充填はラット1匹分ずつ行います。

そのため、一度に1つのhu分だけシリンジに充填します。シリンジへの充填は、エマルションが入ったガラスシリンジに接続されたブリッジに、プラスチック製注入用シリンジを接続して行います。プラスチックシリンジに約300 µLのエマルションを入れます。

次に、針を接続し、針の中の空気を押し出します。これにより、針の中の50 µLのデッドスペースによる損失を防ぎます。そして、正確に200 µLであることを確認し、ラットの尾根元に注入します。これですべての心臓への注入が完了しましたので、今後毎日モニタリングを行います。

そこで、毎朝体重を測定し、1日2回、EAEの臨床症状を確認します。最初に見られる兆候は、後ほど実際に現れた際にお見せしますが、尾の弛緩です。最初のラットには、注射後7日目から8日目頃にこれらの兆候が現れることが予想されます。ほとんどのラットは10日から12日目頃に発症し、最も遅いラットでも15日から17日目頃には発症します。

脊髄乳剤を心臓に免疫して13日目となりました。これから動物をモニタリングし、クリニカルスコアを確認します。その前に、動物の飼育環境について説明します。自己免疫疾患においては、動物内に存在するあらゆる病原体が自己免疫応答を減弱させるという特性があります。

したがって、それを最大限に避けるため、ラットを特定の条件下で飼育しています。具体的には、ろ過空気が供給され、陽圧管理されたこのキュービクル内で飼育し、動物自体はオートクレーブ滅菌済みのケージに入れています。つまり、ラットを入れる前に、ケージ内のすべてのものを完全にオートクレーブ滅菌しています。

ケージの上部にはフィルターが設置されています。餌には標準的なロデント用飼料を使用しています。これはI社製です。

また、ラットには酸性水を投与します。通常の飲料水に標準プロトコルに従って塩酸を添加して酸性水を作成し、これを投与することで腸内フローラを最小限に維持し、自己免疫反応を阻害するリスクを低減させます。これで、ラットの臨床スコアリングを行う準備が整いました。

スコアリングは、臨床症状がない0点から、動物を犠牲にする必要がある重篤な状態である6点までの範囲で行われます。それでは、このモデルで見られる各臨床スコアの例を段階的に説明します。現在は、ラットにUCAEを免疫してから13日目となります。

また、そのケージにはまだ発症していないラットが2匹います。したがって、臨床症状は全く認められません。つまり、2匹のラットは依然として健康な状態です。

彼らは走り回っており、ご覧の通り、移動する際に尾を床材から持ち上げています。そのため、時折尾を乾燥させることもありますが、ほとんどの場合は床材から離そうとします。また、機会があればケージの外に登り出ようとするため、四肢を完全に制御できており、必要に応じて立ち上がることができることがわかります。

EAの最初の臨床症状は、尾の弛緩（limp tail）です。ラットを持ち上げ、指で尾を圧迫すると、通常、ラットは尾の先端で掴もうとする傾向があります。今ご覧いただいたように、このラットは尾の弛緩が見られません。もう一方の個体でも同様に確認できます。

尾が指を掴んでいます。つまり、これらのラットは尾の反応が完全であることを意味します。臨床スコアは0であり、実際には全く症状がないことを示しています。さて、こちらは臨床スコアが0.5のラットです。

したがって、ケージの中で観察しているだけでは、走り回ったりケージの壁に登ったりするなど、完全に正常な行動を示します。しかし、尾の先端が敷材から離れることはありません。このラットは部分的な尾の肢欠損がある可能性があります。そこで、ラットを捕まえて同様のテストを行いますが、尾にいくらかの緊張は認められるものの、先端が私の指に完全に巻き付くことはありません。

したがって、このラットには、部分的な尾の弛緩を示すスコア1.5を付けます。臨床スコア1は、尾が完全に弛緩し、尾のどの部分にも緊張が見られない状態で特徴付けられますが、ラットはまだ後肢を使用することができます。ご覧のように、このラットはケージの壁に寄りかかって立っており、後肢が正常に機能していることがわかります。

しかし、これらのラットを抱き上げて尾を確認すると、尾に緊張が全く認められません。もう一つの試験方法として、RU（ラット）がケージの底にいる状態で、通常のラットと同様に尾を持ち上げた場合、スコア1のRUでは、尾がゆっくりと下がるか、あるいは地面にまで届かないことがあります。一方で、尾を持ち上げてもすぐに地面まで垂れ下がる場合があります。

こちらのRUは4肢すべてを動かすことができますが、後肢に力がなく立ち上がることができません。したがって、このRUの臨床スコアは2と判定します。スコア1と2の主な違いは、スコア1が尾の弛緩のみである点です。

後肢は完全に機能しており、スコアが3の場合、ラットは横に倒れます。2は中間状態で、ラットは後肢を使うことができますが、正常なラットよりもかなり弱くなっています。したがって、このラットはEAEの特異な特徴を示しています。

通常、EAEは上行性の弛緩性麻痺を特徴としますが、本例のように極めて稀なケースでは、後肢が麻痺する前に前肢に麻痺が現れることがあります。このラットがそれに該当します。観察すると、前肢に困難がありケージの側面に登ることができないため、頭部が体の他の部分よりも低い位置にあります。

また、後肢は正常に機能していますが、前肢で押し出すことができません。したがって、このラットにはスコア2を付けます。これは通常、後肢に見られる軽度の麻痺（paras）に相当しますが、このRUでは4肢すべてに現れています。そのため、このRUは前の個体よりもはるかに重篤な表現型を示しています。

臨床スコアは3です。これからお見せするように、前肢は完全に正常に機能していますが、後肢の2本には中程度の麻痺が見られます。そのため、RUは移動に両後肢を使用できますが、側方に倒れ込み、これらの肢を完全に制御することはできません。

これらの胞子は、EEがない通常の状態よりもかなり弱くなっています。また、この段階では、尾の弛緩についてはもう心配していません。なぜなら、多くのラットはしばらくすると、尾が非常に硬くなる（wirey tail）ためです。この個体はまだ尾が非常に弛緩していますが、時折ジストニアが見られることがあります。つまり、尾が不協調な動きを始めるということです。

この段階では、もう尾は見ません。肢がどのように機能するかにのみ注目します。後肢を見ると、一方は動いていますが、もう一方は完全に麻痺しており、ラットの前進を全く助けていないため、スコアは3.5となります。したがって、これは後肢片側の完全麻痺とみなされ、スコアは3.5になります。

このRUの臨床スコアは4であり、これは完全な後肢麻痺を意味し、後ろ脚を全く動かせない状態が特徴です。このケージにいるラットの臨床スコアは5であり、これは完全な後肢麻痺に加えて失禁がある状態に対応します。この個体は失禁しており、見ての通りこの領域が完全に濡れていますが、失禁していない他の個体ではこのような状態は見られません。

HUSのスコアが3以上の場合は、確実に水を飲めるように、長い吸い口チューブが付いた水ボトルを提供します。また、ケージの底に餌を置き、ゲルパックも与えます。これらの措置を講じているものの、1日2回のモニタリングのためにラットを取り出すたびに、日中に十分な水分を摂取できていなかった場合に備えて、常に水を提供しています。

ここでは、臨床スコアが4のラットを示しています。この段階になると、動物に食事を促す必要があります。そこで私は、餌を水で濡らして、彼らがより噛み切りやすいようにしています。

過去2週間にわたり、DAラットにおいて慢性再発型EAEを誘導し、モニタリングする方法について説明してきました。まず最初のステップでは、脊髄浸漬液の調製方法と、それをラットの尾根部に注入する方法について示しました。そして本日は、疾患の進行度に応じてこれらのラットをスコアリングする方法について説明しました。

当然ながら、これは慢性再発モデルであるため、ラットのスコアは変動することが予想されます。疾患は数日で寛解し、時間の経過とともに再発します。一部のラットは、より慢性的な疾患段階へと移行します。

個体によって差があります。さて、このビデオを終える前に、これらのモデルで薬剤テストを行う際の注意点を一点強調しておきたいと思います。非常に重要な点は、動物を可能な限りランダムに割り付けることです。

非常に重要な点として、動物の発症が早ければ早いほど、疾患が重症化するということが挙げられます。したがって、1日目にすべての対照群の動物をまとめ、その後の数日間で処置群の動物をまとめるような方法は避けてください。実際の手順としては、動物が発症し、治療を開始させたい当日になった時点で、動物をランダムに2つの異なるグループに分けます。

例えば、対照群と処置群が1つずつある場合、1つ目の心臓を対照群に、2つ目を処置群に入れ、すべての動物がそれぞれの群に配置されるまでこれを繰り返します。ただし、このランダム化はプロトコルの可能な限り早い段階で行うようにします。このビデオが皆様のお役に立ち、Dラットにおける慢性再発型EAEの誘導とモニタリングが可能になることを願っております。

それでは、実験の成功をお祈りいたします。