Name: 誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 48 s
Description: 学ぶ、DAラットにおける慢性再発型実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導法と臨床スコアリングシステム。多発性硬化症の動物モデルとして、上行性弛緩性麻痺の評価と病態進行のモニタリング手法を解説します。

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慢性再発性EAEの誘導とモニタリングエマルジョンは、補足完全フロイントアジュバントに添加水溶液中の抗原の1:1混合物である。それは、アジュバントとしない他の方法でラウンドして抗原を追加することが非常に重要です！ 作り、エマルジョンを注入する際に廃棄物がたくさんある。常に必要なものよりも1.5〜2倍以上を準備。 オートクレーブ乳鉢、乳棒、ガラスの注射器、およびブリッジを使用してください。すべてのプラスチックは無菌でなければなりません。準備は、通常の実験台で行うことができます 。 1。補足アジュバントの調製乳鉢に結核菌 （Difco社のカタログ＃231141）と場所の30 mgを秤量する。細菌を破ることを避けるためあまりにもハードキーを押すことなく、薄い粉末にしてください。完全フロイントアジュバントH37Ra（Difco社製カタログ＃231131）とミックスの10 mlを追加します。この補足アジュバントは現在、4 mg / mlの結核菌が含まれています。チューブに移す。 2。脊髄ホモジネートの調製 DAラット（年齢/性別無関心）から脊髄を収集し、-80凍結℃で保存補足アジュバントを1:1（容積重量）を混在させるのに十分持っている冷凍脊髄を量る。カミソリの刃を持つできるだけ細かいとして脊髄をミンチ、セクション1で使用したモルタルに転送、および乳棒を用いてペーストを作る。 3。エマルションの調製<ol><li>場所は、チューブのフロイントアジュバントを完了補った。ハイスピー​​ドでボルテックス。ボルテックスしながらドロップで脊髄ホモジネートドロップを追加。さらに5分間脊髄ホモジネートのすべてが追加され、渦。混合物は薄いピンクを有効にしてください。 </li><li> 5 mlのガラス製の注射器でエマルジョンを入れ、（フィッシャーのカタログ＃14から825 - 17L）18Gのブリッジを使用して別の5mlのガラス製注射器にリンクします。それがハードになる（5〜10分）まで、シリンジから他にエマルジョンを送る。エマルジョンのより5mlを準備している場合、いくつかの5mlの注射器が大きい注射器は使用しないでください使用。 </li><li>エマルジョンは3週間は4℃で注射器に格納することができます。私はそれが崩壊しないことをチェックするため、事前にそれを少なくとも12時間の準備をお勧めします。それは厚さ2段階に分離されていないままにしてください。色は黄色またはベージュの光に一晩変更されます。 </li></ol> 4。ラットの予防接種<ol><li>数分間シリンジでエマルジョンを混合し、注射用注射器に移す。短期的な麻酔の下に23G注射針および3mLルアーロックシリンジを用いて尾の非常ベースで皮下に200μlを注入する。 </li><li>受信者は、7〜9週齢の雌性DAラットです。我々は、ハーラン - スプラーグドーリーから我々のラットを得る。 </li><li>ラットを毎日二度見して毎日検討する必要があります。臨床徴候は7-15日エマルジョンの注入後に期待されています。 </li></ol>臨床スコア： 0：無症 0.5：遠位足を引きずる尾 1：足を引きずる尾 2：軽度の不全対麻痺、運動失調 3：中等度の対麻痺、時々ラット旅行 3.5：ある後肢が麻痺され、その他の動き 4：完全な後肢の麻痺 5：完全な後肢の麻痺や失禁 6：瀕死状態、呼吸困難、飲食していません。すぐに安楽死させる。

CBとKGCはAirmid社の共同創設者およびコンサルタントです。

このプロトコルにはいくつかの重要な考慮事項があります。 DAラットの遺伝学は、それらがから購入されているブリーダーによって多少異なります。これらの違いは、誘導をEAEラットの感受性を増減する場合があります。あなたのラットはEAEに影響を受けやすい場合には、非添加の完全フロイントアジュバント、あるいは不完全フロイントアジュバントを使用することによって予防接種の強さを減らすことになるでしょう。また、エマルジョンを調製する前に注入または生理食塩水で脊髄のホモジネートを希釈乳剤の量を減らすことを考慮することがあります。あなたのラットは、エマルジョンがあなたの住宅施設の清浄度を確認する免疫フル強度を用いてEAEの臨床症状を発症しない場合。寄生虫（など蟯虫など）に感染したラットは、EAEを開発しません。あなたは、フィルタ - トップスオートクレーブケージの掃除機の条件であなたの動物を収容し、それらに酸性の水を自由に摂取（酸性の水を調製するためのプロトコルが接続されている）を与えることを考慮することがあります。 乳剤はアジュバント中の油が完全にコートでは、滴ずつ追加抗原をするように、油中水型にする必要があります。他の方法でラウンド（水中油型）準備エマルジョンは、...

<table><tbody><tr><td>Complete Freund&amp;rsquo;s Adjuvant</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF 311-360-5</td><td>Difco社製</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF3114-33-8</td><td>Difco社製</td></tr><tr><td>DAラット</td><td>動物</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>雌、7-9週齢</td></tr><tr><td>ガラス製注射器 - 5 ml</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-10 B</td><td></td></tr><tr><td>金属製コネクタ - 18G</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-17L</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックプラスチック製注射器 - 3 ml</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>針 - 20G 1 1/2</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5C</td><td></td></tr></tbody></table>

誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

多発性硬化症（MS）は、一般的に若い成人に影響を与える中枢神経系（CNS）の慢性炎症性疾患である。それは脳と脊髄に散在地域における脱髄とグリア瘢痕によって特徴づけられる。これらの病変は、神経の伝導を変更し、中枢神経系の脱髄斑（例：対麻痺、麻痺、失明、失禁）の位置によって変化無効に神経学的欠損を引き起こす。 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのためのモデルです。 EAEは、最初のウサギの脊髄上に成長させたウイルスを使用して、狂犬病予防接種の間に人間に誤って誘導した。不活化ウイルスによる脊髄注入の残基は、中枢神経系疾患を誘発した。これらの観​​察に続いて、EAEの最初のモデルは1935年に河川によってホモジネートCNSとSchwentherで免疫した非ヒト霊長類に記載されていた。 EAEはそれ以来、様々な種で生成されており、種/系統と使用される免疫抗原に応じてさまざまなコースをたどることができます。同じ抗原がモルモットにおける慢性疾患を誘導しながら例えば、アジュバントとエマルジョンのミエリン塩基性蛋白質とのLewisラットを免疫すると、EAEの急性モデルを誘導する。 EAEモデルここで説明するが、完全フロイントアジュバントでエマルジョン中のDAラット脊髄に対してDAラットを免疫することによって誘導される。ラットは7〜14日後の予防接種の中で昇順弛緩性麻痺を開発する。臨床症状は数週間にわたって再発寛解型経過をたどる。病理学は、中枢神経系脱髄斑の大きい免疫浸潤を示しています。 EAEと動物のために世話をするための特別な考慮事項は、ビデオの最後で説明されています。

DAラットの慢性再発性実験的自己免疫性脳脊髄炎：このビデオでは、多発性硬化症の動物モデルの誘導と臨床スコアを示しています。全体ラット脊髄と完全フロイントアジュバントを含むエマルジョンをラットを免疫することにより誘導される疾患は、、人間の病気に似た臨床症状を示しています。

多発性硬化症（MS）は、主に若年成人に発症する中枢神経系（CNS）の慢性炎症性疾患である。その特徴は……

私はクリスティン・ビートンです。カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部にあるジョージ・チェンの研究室で助教を務めています。これから数日間にわたり、DAラットにおいて慢性再発型EAE（実験的自己免疫性脳脊髄炎）を誘発し、それをモニタリングする方法について解説します。これは多発性硬化症の動物モデル、あるいは多発性硬化症の動物モデルの一つと言えます。このモデルは、動物における上行性の弛緩性麻痺と、ヒトの疾患に類似した組織学的特徴によって定義されます。したがって、この手順には数日かかることになります。まず1日目は、完全フロイントアジュバントを用いたナイーブラット脊髄ホモジネートによるジェニックエマルションの調製方法について説明します。2日目は、ラットへのEAEの免疫方法を示し、その後7日から15日間待機して、動物に最初の臨床症状が現れるかを確認します。その時点で、個々の動物におけるEAEの進行の異なる段階について説明します。それではまず、エマルションの調製に必要なすべての試薬と器具を紹介します。使用するのは完全フレンドアジュバントH 37 Raです。これにはすでにMycobacterium tuberculosisが含まれていますが、さらに乾燥Mycobacterium tuberculosis H 37 Raを添加し、4 mg/mLに調整します。この乾燥細菌を調製するために、乳鉢に入れ、乳棒で細かく粉砕して微粉末にします。その後、これらの細菌をアジュバントに添加します。これでアジュバントの準備が完了しました。次のステップは抗原の調製です。-80°Cで冷凍保存されたラットの脊髄を取り出します。凍結状態を維持するため、ドライアイスを入れた計量皿の上に置き、1つずつ取り出して、カミソリの刃を用いて脊髄を計量皿の中で細かく刻みます。次に、添加剤を加えたアジュバントをボルテックスミキサーにかけます。ボルテックス攪拌しながら、脊髄組織を少しずつアジュバントに加えていきます。脊髄組織すべてをアジュバントに混ぜ合わせた後、さらに5分間ボルテックス攪拌します。その後、調製した浸漬液を5 mLのガラス製シリンジに移します。2本の5 mL ガラスシリンジを16 Gのブリッジで接続し、そのブリッジで可能な限り速くエマルションを一方のシリンジからもう一方へと移動させます。数分後、エマルションが硬くなり始めたら、より細いブリッジに切り替えます。ここでは18 Gを使用し、これによりエマルションをさらに硬化させます。このブリッジを装着したシリンジをアルミホイルで包み、冷蔵庫で一晩保存します。計量紙を用いて、結核菌を30 mg量り取りました。これを乳鉢に移し、乳棒を使って細菌の凝集塊を微粉末状に粉砕しました。ただし、細菌を破壊しないよう、乳鉢のすりこぎで強く押し付けすぎないでください

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を持つラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法を示します。...

EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

学ぶ、DAラットにおける慢性再発型実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導法と臨床スコアリングシステム。多発性硬化症の動物モデルとして、上行性弛緩性麻痺の評価と病態進行のモニタリング手法を解説します。

誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

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