非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

こんにちは、RI Ovです。そして、Alexia Yingです。私たちはセント大学の大学院生です。このビデオでは、脳組織の特定領域に標的遺伝子を導入するための、in vivo エレクトロポレーション法について紹介します。

それでは、詳しく見ていきましょう。in vivoエレクトロポレーション法は、目的の遺伝子や小分子干渉RNAを生体脳組織へ迅速かつ効率的に導入するための手法です。

本手法は、トランスジェニック動物の作製やウイルスを用いた遺伝子導入アプローチに代わる、低コストな選択肢を提供します。このビデオでは、新生ラットの皮質への出生後遺伝子導入の詳細な手順を実演します。ここでは、CMVエンハンサーを備えたチキンβアクチンプロモーターおよび強化緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを使用します。

無菌状態を維持し、動物への細菌または真菌汚染のリスクを最小限に抑えるため、すべての外科的操作は層流キャビネット内で行います。皮質へのプラスミド導入には、電子コントローラー付きのWPIマイクロインジェクターと、定位固定装置に取り付けた10 µLのハミルトンシリンジを使用します。赤色の仔犬は、ボックスとマスクで構成される麻酔装置を用いて麻酔をかけます。

その後、ステレオタキシス操作機に取り付けられた加温台上の耳棒を用いて、幼生を固定します。外科的操作およびマイクロインジェクションのモニタリングには、双眼顕微鏡を使用します。エレクトロポレーションには、ピンセット型電極を備えたCYV 21 in vivo エレクトロオペレーターを使用します。

幼生（パップ）の回復について。麻酔後、加温チャンバーを使用します。通常、200 µLの薄壁チューブにプラスミド注入溶液を10 µL準備します。この溶液で数回分の実験が可能です。

プラスミド溶液 8 µLに、10 XPBS 1 µLと0.1% fast green水溶液 1 µLを混合します。注入液中のプラスミド最終濃度は 1～3 µg/µLにする必要があります。プラスミドDNAの濃度が低すぎるとトランスフェクション効率が低下し、濃度が高すぎると粘度が高くなりすぎて、ガラスキャピラリーの細いチップからの注入が困難になります。

ガラスピペットの作製には、フィラメント付きのホウケイ酸ガラスキャピラリーと、最大設定のプーリングおよび加熱パラメータに設定した垂直電極ガラスプーラーを使用します。次に、ピペットの先端を紙で折って、直径10～20 µmの先端にします。顕微鏡対物レンズ下で、先端の直径と形状を確認します。

細いポリマーキャピラリーを用い、10 µLのハミルトンシリンジの容量の約3分の1を満たします。この際、ミネラルオイルを用いて気泡が入らないように注意します。次に、ガラスピペットにミネラルオイルを満たし、そのピペットをハミルトンシリンジに挿入します。

ここでも、気泡が入らないように注意します。次に、ガラスピペットを装着したシリンジを、コントローラーに接続されたマイクロインジェクターに固定します。定位固定装置に固定されたマイクロインジェクション装置を用いることで、ガラスピペットの先端をプラスミド注入液の入ったチューブに安全に浸すことができます。

チップが溶液の表面に触れたら、さらに1〜2 mm深く浸します。次に、マイクロインジェクターコントローラーを使用して、パイペットに約1 µLの注入用混合液を満たします。ここに提示されるすべての実験は、ヘルシンキ大学の動物実験規制に従って実施されています。

各実験において、ガストレタイトシリンジにイソフルランを満たします。シリンジを気流源に接続された麻酔装置に固定し、動物を歩かせ、マスクをステレオタキシス装置に固定します。麻酔装置で、気流を約250 milliliters minuteに、イソフルラン濃度を4%に調整します。その後、動物ボックスにレッドキャップを装着し、2〜5分間放置します。

Pの動きが止まったら、定位固定装置に取り付けられたヒーティングパッドの上に置きます。Pの頭部の吻側部をマスクに合わせます。幼若個体が深い麻酔状態に入るまでには、通常5〜10分かかります。

それが達成されたら、イソフルランの流量を約1.5〜2%に下げます。小型の綿球と細いピンセットを用いて、70% ethanolで子ラットの頭部の皮膚を処理します。子ラットの後頸部から額にかけて皮膚を切開し、皮膚を側方に折り曲げ、耳状バーを頭蓋骨の口孔にわずかに挿入して、頭部と皮膚を固定します。実体顕微鏡を用いて、定位手術座標に基づき頭蓋骨上のブレグマ点を確認して関心領域を特定します。この領域の上に注入用ピペットを配置し、25〜50 nanolitersの注入液を頭蓋骨表面に滴下してマーキングします。

顕微鏡下で、高速外科用ドリルを用いて、印を付けた部位の頭蓋骨を液体が現れるまで慎重に穿孔します。頭蓋骨の両側にエレクトロポレーション用ピンセットおよび電極を固定します。導電性を高めるため、導電性ゲルを塗布します。

小さなタンポンを使用して穿孔部位から液滴を取り除き、ガラス針を穴に浸します。注入部位の座標に従い、注入液を 25 から 100 nanoliters、毎秒 5 から 20 nanoliter の速度で注入しました。その後、速やかにピペットを抜き、直ちに電極法（エレクトロポレーション）を行います。

電撃法（エレクトロポレーション）は、パルス振幅 99 V、周波数 1 Hz、パルス幅 50 ms のパルスを 5 回印加することで行います。電極と耳固定バーを取り外します。鈍視鉗子と尖視鉗子および手術用縫合糸を用いて、切開した皮膚を縫合しました。

麻酔からの回復を促すため、幼獣を保温チャンバーに15〜30分間置きました。その後、幼獣を母親のケージに戻しました。正常にトランスフェクションされた細胞における導入遺伝子の発現は、エレクトロポレーションの約10時間後に現れ、数週間安定して持続します。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。それでは。