Name: 非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶ in vivoエレクトロポレーションによる産後ラット脳への非ウイルス遺伝子導入法。プラスミド注入と電気パルスで標的領域に効率的に遺伝子を送達し、神経科学研究や遺伝子機能解析に応用可能です。

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私たちは、ビデオのサウンドトラックの録音、CAG - EGFPプラスミド調製のための3DアニメーションとピーターBlaesse用イワンMolotkovのヘルプはエカテリーナKarelinaに感謝。 作業は、フィンランドの国際的なモビリティ、フィンランド文化財団とフィンランドアカデミーのセンターからの補助金によって支えられている。

1。はじめトランスジェニック動物の作成 ​​は、動物1を生きているのとセル4のプロパティを操作するためだけでなく、病気のメカニズム2,3を解明するための遺伝子機能の研究の強力な方法です。しかし、手順はこのように、ウイルス注射5、エレクトロポ6のと子宮内エレクトロポレーション7,8 における新生児心室の注入などの代替遺伝子の配信方法を使用することに対する保証、、非常に時間がかかり、高価ではなく、骨の折れるです。 、関心のある領域での局所発現パターンを作成する可能性、非遊走細胞の種類の in situトランスフェクションでは 、例えば、皮質の非ウイルス性遺伝子構築物の使用：出生後の非心室注射とエレクトロポレーションの方法には利点のユニークなセットを持っていますアストロサイト。 このビデオでは、CMVエンハンサー（pCAG - EGFP）9ニワトリβアクチンプロモーターの下で増強緑色蛍光蛋白質をコードするプラスミドを用いて新生仔ラットの脳に生後遺伝子送達の詳細な手順を示しています。我々は、薄いガラスピペットの製造と定位楽器でインジェクターの組み立て、プラスミド含有注射液の調製を例示する。その後、我々は、注入の手順について、および鉗子の電極と生体の porator で使用してエレクトロポレーションについて、手術を行うについて、イソフルランと仔ラットをanaesthetizingについて話す。最後に、我々は簡単にこれらの実験中に発生する可能性のある予想される結果、視点や難しさを議論する。 2。エレクトロポレーションのためのプラスミドの調製<ol><li>我々は通常、200μlの薄壁管のプラスミド注射液10μlを用意する。このソリューションは、いくつかの実験で十分です。 </li><li>我々は、10 × PBSを1μl（材料および機器を参照）と0,1％ファストグリーンの水溶液1μl（材料および機器を参照）（材料および機器を参照）プラスミド溶液8μlを混合する。 </li><li>注射液中のプラスミドの最終濃度は、μg/μLの1〜3であることが必要。高いDNA濃度はキャピラリーガラスの細いチップを通して注入のために粘性が高いとなる一方のプラスミドDNAを低濃度では、トランスフェクション効率が低下します。 </li></ol> 3。ガラス針の準備<ol><li>ガラスピペットの準備のために、我々は、パラメータを引っ張ると加熱最大でフィラメント（材料および機器を参照）と垂直電極のガラスプラー（材料および機器を参照）とキャピラリーホウケイ酸ガラスを使用してください。 </li><li>我々は、その後、直径が先端10から20ミクロンを達成するために一枚の紙を使用して、ピペットの先端を破る。 </li><li>我々は、顕微鏡対物下の先端径と形状を確認してください。 </li></ol> 4。組み立てマイクロインジェクター<ol><li>我々は鉱物油で（材料および機器を参照）の約1 / 3の10μlハミルトンシリンジの容積のを埋めるキャピラリー薄いポリマーを（材料および機器を参照）を使用する（材料および機器を参照）。空気の泡を避ける！ </li><li>その後、我々は、鉱物油とガラスピペットを記入し、ハミルトンシリンジにピペットを挿入する。空気の泡を避ける！ </li><li>ガラスピペットと注射器は、コントローラ（材料および機器を参照）に接続されているインジェクターに固定されています。 </li><li>定位装置（材料および機器を参照）に固定されたマイクロインジェクションのセットアップは、私たちは安全にプラスミド注射液をチューブにガラスピペットの先端を浸漬することができます。 </li><li>先端が溶液の表面に触れると、1または2ミリによって、さらにそれを浸し、マイクロインジェクタコントローラを用いて射出ミックスの約1μlのピペットをご記入ください。 </li></ol> 5。 Anaesthetizing動物ここに示すすべての手順は、動物実験のためのヘルシンキ規制の大学に従って行った。 <ol><li>各実験では、我々は（材料および機器を参照）イソフルランの約2 mlをガスタイトシリンジを（材料および機器を参照）埋める。 </li><li>シリンジよりも空気の流れの源に接続されている麻酔装置（材料および機器を参照）、定位の設定に固定された動物のボックスとマスクで固定されています。 </li><li>麻酔ユニットに、我々は約250 ml /分、4％のイソフルランレベルに空気の流れを調整する。 </li><li>我々は2-5分のための動物ボックスに子犬ラットを置きます。 </li><li>子犬停止が移動する場合は、定位のセットアップに取り付けられた加熱パッド（材料および機器を参照）の上に置きます。 </li><li> anaesthetizingマスクにの子犬の頭の吻側部を置きます。 </li><li>それは5〜10分かかります深い麻酔を入力する子犬。 </li><li>テールピンチで麻酔の深さをチェックして2.0〜約1.5％のイソフルランの流入を減少させる。 </li></ol> 6。手術、マイクロインジェクションやエレクトロポレーション<ol><li> 70％エタノールでの子犬の頭の上に肌を扱う。 </li><li>小さなはさみ（材料および機器を参照）と細いピンセットを使って（材料および機器を参照）、その額に子犬の首筋から皮膚をカット。 </li><li>横に皮膚片を曲げ、少し頭と皮膚の固定のための頭蓋骨の耳の開口部に耳のバーを引き出します。 </li><li>双眼顕微鏡を用いて、我々は、頭蓋骨のブレグマのポイントを探します。 </li><li>定位座標を用いて関心領域を識別します。 </li><li>この地域上記インジェクションピペットを置き、頭蓋骨の表面に注射液の25​​〜50 NLをドロップすることによって、それをマーク。 </li><li>液体は、掘削領域に表示されるまで、顕微鏡下（材料および機器を参照）、高速外科ドリルを使用して印を付けた点で優しく、慎重に頭蓋骨をドリル。 </li><li>優れた導電性を達成するために、現在の導電性ゲルと頭蓋骨の両側にelectropotationの鉗子の電極を（材料および機器を参照してください）​​（材料および機器を参照）を修正。 </li><li>小さなタンポンを使用してドリル穴から液滴を削除する（材料および機器を参照）、注射部位の座標に応じて穴にガラス針をディップ。 </li><li> 5〜20 NL /秒の速度で注射液の25​​から100 nlのを吹き込む。 </li><li>迅速にピペットを削除し、直ちにエレクトロ。エレクトロポレーションは、1 Hzの周波数で99 Vの50ミリ秒と振幅の持続時間と5の矩形パルスを印加することによって行われます。 </li><li>電極と耳のバーを取り外します。 </li><li>ダム（材料および機器を参照）とシャープなピンセットと手術用のスレッド（材料および機器を参照）の組み合わせを使用してカット肌を縫う。 </li><li>麻酔後にその回復を助けるために15〜30分間のウォーム室に子犬を置きます。 </li><li>その後、母親のケージに子犬バックを置く。 </li></ol> 7。代表的な結果うまくトランスフェクトした細胞における導入遺伝子の発現は、エレクトロポレーション後約10時間表示され、そしてそれは数週間安定です。 我々はどちら生後2日目の深い皮質層または線条体領域（P2）にWistarラットの仔のプラスミドをマイクロインジェクションし、前述のように生体内エレクトロポレーションで実行されます 。脳スライス（厚さ400μmのは）2〜6日後にカットされた（P4 - P8）冷たいスライス培地でvibrotome（HEPESはアールの平衡塩類溶液をバッファリング）10を使用。画像取得は、室温でスライス培地でツァイスAxioplan 2 LSM5パスカル共焦点顕微鏡（Zeiss、ドイツ）を用いて行った。 深い皮質層と線条体における注入部位は、直径約200〜300ミクロン（図1A、B）のコンパクトな領域に位置されたEGFPを発現する多くのトランスフェクションされた細胞が含まれている。トランスフェクションした細胞内で、EGFPの発現レベルは、異なる形状（図1D）と軸索の束（図1E）の棘を持つ樹状突起を含む薄い細胞のプロセス（図1C）のイメージングを可能にする十分に高いです。 EGFPと同様にエレクトロポレーション後の細胞生存率の堅牢な安定性は、このような皮質の端末（図1F）のような軸索の遠位部（最大1.5〜2ミリメートルの細胞体から）トレースできました。 <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1（A）が正常にプラスミド注射部位の輪郭を描くP4のラット脳の線条体領域内のセルをトランスフェクション。 （B）P5ラットの脳の深い皮質層にトランスフェクトされた細胞（皮質表面下約1000μmの）。 P8ラット脳の線条体領域での（C）トランスフェクトされた細胞。 （D）P8ラット脳の線条体領域でのトランスフェクトされた細胞の樹状突起を、矢印は樹状突起スパインおよびフィロポディアの異なる種類を示している。 （E）側副路内にトランスフェクションされた細胞の軸索。 （F）の軸索は、P8ラット皮質（矢じり）の軟膜表面で終端する。 CとDには10μm、スケールバーはA、B、E及びFは100μmです

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
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<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

生きている齧歯類の脳への遺伝子送達の方法は、当生後エレクトロ6について、最近では、 子宮内エレクトロポレーション7,8,11,12 のために確立されています。しかし、これらの方法はいくつかのアプリケーションのために制限されることがありますプラスミドDNA、の脳室内注入に基づいています。例えば、これらのメソッドは、海馬、また皮質アストロサイトなどの非遊走細胞の種類のトランスフェクションなどの特定の脳領域で細胞を標的とすることはできません。エレクトロポレーションと相まって、非心室注入は、最初の小脳ニューロン13に遺伝子送達のために使用されていました。我々のプロトコルは、ラットの脳の他の地域のための非心室方式の拡張を示しています。我々は方法論的アプローチは、生後ラットの脳5内の関心の制限区域への遺伝子送達のウイルスの方法に有用な代替手段であることを提案する。 本方法の利点にもかかわらず、いくつかの困難は、後述するように期待されることがあります。 <p cla...

<table><tbody><tr><td>2A-sa ダмбピンセット、115mm</td><td>機器</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>外科操作に使用する前に70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>ステンレス製加熱パッド付き生物学的温度コントローラー</td><td>機器</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント付きホウケイ酸ガラス管</td><td>材料</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>ガラス針</td></tr><tr><td>使い捨てドリル</td><td>材料</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&amp;rsquo;s PBS 10X</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5ピンセット、110 mm</td><td>機器</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>外科操作に使用する前に70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>Ealing マイクロ&amp;#8211;電極プラー</td><td>機器</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>垂直電極ガラスプラー</td></tr><tr><td>Ethilon モノフィラメントポリアミド 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>材料</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>EH7177H</td><td>手術用縫合糸</td></tr><tr><td>Exmire マイクロシリンジ 10.0 ml</td><td>機器</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>ガスタイトシリンジ</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット電極</td><td>機器</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>使用前に70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>Foredom ドリルコントローラー</td><td>機器</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>外科用ドリルの電源およびコントローラー。現在入手可能な代替品はマイクロモーターキット K.1070 (Foredom) である</td></tr><tr><td>Foredom マイクロモーターハンドピース</td><td>機器</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>現在入手可能な代替品はマイクロモーターキット K.1070 (Foredom) である</td></tr><tr><td>マウス用ガス麻酔プラットフォーム</td><td>機器</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>脳定位固定装置に取り付けて使用</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>試薬</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドレッシングピンセット、105 mm</td><td>機器</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>外科操作に使用する前に70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>マイクロシリンジ充填用キャピラリー</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil シリンジ 10 microliter</td><td>機器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>Hamiltonシリンジ</td></tr><tr><td>プラスミド CAG-EGFP</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) を用いて抽出・精製し、ヌクレアーゼフリー水で 1.5 mg/ml の濃度に溶解したもの</td></tr><tr><td>パルスジェネレーター CUY21Vivo-SQ</td><td>機器</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller 電極ゲル</td><td>試薬</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>導電性ゲル</td></tr><tr><td>小動物用脳定位固定装置</td><td>機器</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;lting マウスおよび新生ラット用アダプター</td><td>機器</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>脳定位固定装置に取り付けて使用。外科操作に使用する前に、イヤーバーを70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>学生用アイリス剪刀、直線 11.5 cm</td><td>機器</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>外科操作に使用する前に70%エタノールで消毒すること</td></tr><tr><td>Sugi 吸収綿 17 x 8 mm</td><td>材料</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>外科用タンポン</td></tr><tr><td>UMP3 マイクロシリンジポンプおよび Micro 4 マイクロシリンジポンプコントローラー</td><td>機器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>マイクロインジェクターおよびコントローラー</td></tr><tr><td>Univentor 400 麻酔装置</td><td>機器</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

トランスジェニック動物の作成 ​​は、 生体内で目的の遺伝子の機能を研究する上で標準的なアプローチです。しかし、多くのノックアウトまたはトランスジェニック動物は、改変された遺伝子が発現したり、生物全体に削除されるような場合に実行可能ではありません。また、代償機構の様々な、しばしばそれが困難な結果を解釈すること。補償効果はどちらのタイミング遺伝子発現またはトランスフェクトされた細胞の量を制限することによって軽減することができます。 出生後の非心室マイクロインジェクションの方法および in vivoエレクトロポレーションでは、直接新生児げっ歯類の脳への関心の小さな領域への遺伝子、siRNAや色素分子の標的送達することができます。従来の心室の注入法とは対照的に、このメソッドは非遊走細胞の種類のトランスフェクションすることができます。ここで説明する方法によりトランスフェクトされた動物は、in vivoイメージングや急性脳スライスの電気生理学的実験で、例えば、二光子のために、使用することができます。

このプロトコルは、生きている齧歯類の脳の特定領域に遺伝子構築物の送達の非ウイルス方法を説明します。方法は、プラスミド調製、マイクロピペットの製造、新生児ラット子犬手術、コンストラクトのマイクロインジェクション、および構成されています<em&gt; in vivoで</em&gt;エレクトロポレーション。

トランスジェニック動物の作製は、目的遺伝子のin vivoにおける機能を研究するための標準的なアプローチである。しかし、多くのノックアウト動物やトランスジェニック動物は……

こんにちは、RI Ovです。そして、Alexia Yingです。私たちはセント大学の大学院生です。このビデオでは、脳組織の特定領域に標的遺伝子を導入するための、in vivo エレクトロポレーション法について紹介します。それでは、詳しく見ていきましょう。in vivoエレクトロポレーション法は、目的の遺伝子や小分子干渉RNAを生体脳組織へ迅速かつ効率的に導入するための手法です。本手法は、トランスジェニック動物の作製やウイルスを用いた遺伝子導入アプローチに代わる、低コストな選択肢を提供します。このビデオでは、新生ラットの皮質への出生後遺伝子導入の詳細な手順を実演します。ここでは、CMVエンハンサーを備えたチキンβアクチンプロモーターおよび強化緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを使用します。無菌状態を維持し、動物への細菌または真菌汚染のリスクを最小限に抑えるため、すべての外科的操作は層流キャビネット内で行います。皮質へのプラスミド導入には、電子コントローラー付きのWPIマイクロインジェクターと、定位固定装置に取り付けた10 µLのハミルトンシリンジを使用します。赤色の仔犬は、ボックスとマスクで構成される麻酔装置を用いて麻酔をかけます。その後、ステレオタキシス操作機に取り付けられた加温台上の耳棒を用いて、幼生を固定します。外科的操作およびマイクロインジェクションのモニタリングには、双眼顕微鏡を使用します。エレクトロポレーションには、ピンセット型電極を備えたCYV 21 in vivo エレクトロオペレーターを使用します。幼生（パップ）の回復について。麻酔後、加温チャンバーを使用します。通常、200 µLの薄壁チューブにプラスミド注入溶液を10 µL準備します。この溶液で数回分の実験が可能です。プラスミド溶液 8 µLに、10 XPBS 1 µLと0.1% fast green水溶液 1 µLを混合します。注入液中のプラスミド最終濃度は 1～3 µg/µLにする必要があります。プラスミドDNAの濃度が低すぎるとトランスフェクション効率が低下し、濃度が高すぎると粘度が高くなりすぎて、ガラスキャピラリーの細いチップからの注入が困難になります。ガラスピペットの作製には、フィラメント付きのホウケイ酸ガラスキャピラリーと、最大設定のプーリングおよび加熱パラメータに設定した垂直電極ガラスプーラーを使用します。次に、ピペットの先端を紙で折って、直径10～20 µmの先端にします。顕微鏡対物レンズ下で、先端の直径と形状を確認します。細いポリマーキャピラリーを用い、10 µLのハミルトンシリンジの容量の約3分の1を満たします。この際、ミネラルオイルを用いて気泡が入らないように注意します。次に、ガラスピペットにミネラルオイルを満たし、そのピペットをハミルトンシリンジに挿入します。ここでも、気泡が入らないように注意します。次に、ガラスピペットを装着したシリンジを、コントローラーに接続されたマイクロインジェクターに固定します。定位固定装置に固定されたマイクロインジェクション装置を用いることで、ガラスピペットの先端をプラスミド注入液の入ったチューブに安全に浸すことができます。チップが溶液の表面に触れたら、さらに1〜2 mm深く浸します。次に、マイクロインジェクターコントローラーを使用して、パイペットに約1 µLの注入用混合液を満たします。ここに提示されるすべての実験は、ヘルシンキ大学の動物実験規制に従って実施されています。各実験において、ガストレタイトシリンジにイソフルランを満たします。シリンジを気流源に接続された麻酔装置に固定し、動物を歩かせ、マスクをステレオタキシス装置に固定します。麻酔装置で、気流を約250 milliliters minuteに、イソフルラン濃度を4%に調整します。その後、動物ボックスにレッドキャップを装着し、2〜5分間放置します。Pの動きが止まったら、定位固定装置に取り付けられたヒーティングパッドの上に置きます。Pの頭部の吻側部をマスクに合わせます。幼若個体が深い麻酔状態に入るまでには、通常5〜10分かかります。それが達成されたら、イソフルランの流量を約1.5〜2%に下げます。小型の綿球と細いピンセットを用いて、70% ethanolで子ラットの頭部の皮膚を処理します。子ラットの後頸部から額にかけて皮膚を切開し、皮膚を側方に折り曲げ、耳状バーを頭蓋骨の口孔にわずかに挿入して、頭部と皮膚を固定します。実体顕微鏡を用いて、定位手術座標に基づき頭蓋骨上のブレグマ点を確認して関心領域を特定します。この領域の上に注入用ピペットを配置し、25〜50 nanolitersの注入液を頭蓋骨表面に滴下してマーキングします。顕微鏡下で、高速外科用ドリルを用いて、印を付けた部位の頭蓋骨を液体が現れるまで慎重に穿孔します。頭蓋骨の両側にエレクトロポレーション用ピンセットおよび電極を固定します。導電性を高めるため、導電性ゲルを塗布します。小さなタンポンを使用して穿孔部位から液滴を取り除き、ガラス針を穴に浸します。注入部位の座標に従い、注入液を 25 から 100 nanoliters、毎秒 5 から 20 nanoliter の速度で注入しました。その後、速やかにピペットを抜き、直ちに電極法（エレクトロポレーション）を行います。電撃法（エレクトロポレーション）は、パルス振幅 99 V、周波数 1 Hz、パルス幅 50 ms のパルスを 5 回印加することで行います。電極と耳固定バーを取り外します。鈍視鉗子と尖視鉗子および手術用縫合糸を用いて、切開した皮膚を縫合しました。麻酔からの回復を促すため、幼獣を保温チャンバーに15〜30分間置きました。その後、幼獣を母親のケージに戻しました。正常にトランスフェクションされた細胞における導入遺伝子の発現は、エレクトロポレーションの約10時間後に現れ、数週間安定して持続します。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。それでは。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin...

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

遺伝子は、成体動物における行動や神経病のその後の研究のために、神経細胞の接続性における迅速かつターゲットの変更を可能にするために、E16での子宮内電気穿孔（IUE） ビア皮質またはラットの海馬の開発中に操作することができます。 IUE成功を制御するためのインビボイメージングにおける出生後の共トランスフェクトし、ルシフェラーゼの生物発光を活性化することによって行われる。...

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

我々は、新生児の脳室下帯のエレクトロポレーションと呼ばれる低侵襲技術を実証した。テクニックは、新生児の仔の側脳室にプラスミドDNAを注入し、提供し、遺伝的に神経幹細胞を操作するために電流を印加することで構成されています...

新生児の脳室下帯のエレクトロ

軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。...

新生児軟膜表面エレクトロ

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

マウス膀胱の生体内で尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによる尿路上皮細胞への DNA のプラスミッドの配信手法について述べる.膀胱疾患の土着のマウス ・...

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

ここで提示されるプラスミドDNA送達およびアジェンジモグリア細胞標識のエレクトロポレーション方法は、成人ゼブラフィッシュテレンセファロンにおける。このプロトコルは、個々のエペンディモグリア細胞を視覚化し、トレースするための迅速かつ効率的な方法であり、遺伝子操作の広い範囲にエレクトロポレーションを適用するための新しい可能性を開きます。...

成体ゼブラフィッシュテレンスファロンにおけるプラスミドDNAの生体内送達に関するエレクトロポレーション法

本プロトコルは、遺伝子編集および薬物送達のために新生児マウスで髄腔内注射を行うためのステップバイステップの指示を概説する。...

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

学ぶ in vivoエレクトロポレーションによる産後ラット脳への非ウイルス遺伝子導入法。プラスミド注入と電気パルスで標的領域に効率的に遺伝子を送達し、神経科学研究や遺伝子機能解析に応用可能です。

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

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