スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

次の実験の全体的な目標は、タンパク質に関するストイアメトリクスと構造情報を決定することです。生きた生体細胞を発現する全ての靭帯複合体、酵母細胞は、ドナーまたはアクセプター蛍光プローブのいずれかに付着した目的のタンパク質を発現するように遺伝子操作されています。ドナープローブは、レーザーで直接励起することができます。

アクセプターは、近くの励起されたドナーからのエネルギーの伝達によってのみ励起されますが、細胞はパルス近赤外レーザーからの光にさらされます。プローブからの蛍光授精は、透過型グレーティングによってそのスペクトル成分に分離され、電子増倍CCDアレイの表面に投影されます。したがって、個々の、すべての靭帯からの完全な蛍光スペクトルが、サンプル中の各位置について得られる。

検出された蛍光のスペクトルプロファイルは、目的のタンパク質の特異的相互作用に依存します。データを分析して、スキャンセルの各画像ピクセルについて、ドナープローブとアクセプタープローブからの別々の放出を決定します。エネルギー伝達の効率は、各画像ピクセルで決定され、次にピクセルはフレット効率とヒストグラムに従って曲げられます。

ヒストグラムの解釈により、タンパク質、複雑なサイズ、および構成のin vivo測定が可能になります。こんにちは、ウィスコンシン大学ミルウォーキー校のリク研究グループのマイケル・ストーンマンと申します。私の名前はシンです。

私はウィスコンシン州ミルウォーキーのRikus Labから来ました。この手法の主な利点は、細胞内の数百のすべての靭帯複合体からの完全な発光プロファイルが、細胞の1回の完全なスキャンで得られることです。通常、ほとんどの蛍光顕微鏡法では、細胞内のさまざまな関心領域でのフレット効率を決定するために十分なスペクトル情報を蓄積するために、目的の細胞を複数回スキャンする必要があります。

しかし、拡散生化学反応は、これらの関心領域の分子構成を変化させ、それにより画像のスキャンで得られる情報を制限する可能性があります。この方法は、タンパク質の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、オリゴマーの害の大きさはどれくらいですか?オリゴマーはタンパク質のライフサイクルのどの段階でファームを行い、このタンパク質のオリゴマーは細胞機能にどのような役割を果たしていますか?

スペクトル分解された2枚の写真顕微鏡は、目的のサンプルを横切る励起ビームの焦点をいくつかの場所でスキャンすることにより、画像セル内のオリマ錯体に関するスペクトル情報を蓄積します。一対の直交する走査型ミラーを使用して、レーザービームの焦点をサンプル全体に2つの異なる方向に平行変換します。走査ミラーの動きはコンピュータ制御され、CCDカメラからの蛍光強度データの抽出と同期し、ラインスキャンから蛍光強度の特定の波長の光に対応する空間マップを再構築することができます。

X線蛍光強度空間マップを正確に再構築し、これらの各マップに対応する実際の波長を計算するためには、フルオレセイン溶液を使用してラインスキャンプロトコルを較正する必要があります。キャリブレーション手順を開始するには、ドナータグGFPの最大励起波長の2倍である800ナノメートルの波長で励起スペクトルに送信し、励起スペクトルに送信し、レーザーキャビティ内にあるプリズムを平行移動して、カメラがインターフェースされているコンピュータープログラムを使用して群速度分散を変更します。CCDチップにコマンドを送信して、CCDチップの温度を到達可能な最低温度まで下げます。

ダークノイズを低減するため。10マイクロリットルのフルオレセイン溶液をカバースリップ付きの顕微鏡スライドカバーにピペットで固定し、サンプルの薄層がカバースリップと顕微鏡スライドとの間の領域に均一に分散するようにし、カバースリップの表面に少量の浸漬油を置きます。今顕微鏡を固定し、XY、Z変換ステージにスライドし、光軸方向にスライドとステージを平行移動 手動でリニアアクチュエータを調整することにより、顕微鏡の対物レンズが液浸油の滴と接触するまでスライドを平行移動し、カメラをデータ収集のビデオモードに切り替えて、CCDアレイに当たる許可された光がコンピュータ画面にリアルタイムで表示されます。

CCDアレイで検出されるバックグラウンドノイズを減らすために、すべてのアンビエントルームライトをオフにしてください。マイクロメータをゆっくりと調整し、光軸方向に平行移動ステージを制御して、サンプルをレーザービームの焦点に取り込みます。フルオレセインサンプルにピントが合っていると、発光はCCDアレイ上に鋭い線として表示されます。

CCDアレイからピクセル強度の読み出しをコンピューターにダウンロードします。CCDアレイ上の位置の関数としてピクセル強度を測定するには、ダウンロードした画像Jの強度値のマトリックスを開き、蛍光領域を通る線を引いてください。image day コマンドを使用します。

プロットプロファイルを解析して、フルオレセインサンプルの発光スペクトルを示すプロットを作成します。レーザーの動きを制御するミラーの増分パラメータを調整します。Y方向に焦点を合わせ、サンプル内の隣接するY位置が、蛍光スペクトルのピークがCCDアレイ上のスペクトル次元に沿って正確に1ピクセル移動するようにします。

これをモニターするには、サンプル中の2つの異なるY位置のフルオレセインスペクトル強度をダウンロードします。次に、画像Jで強度画像を開き、各蛍光スペクトルのピークピクセル位置を見つけます。画像Jカーソルを使用して、CCDのシャッターを開いたまま、サンプル全体のレーザーフォーカスをX方向にスキャンします。

スキャンのラインに沿って各ボクセルから放出された光は、各ラインスキャンの最後にCCDアレイに入射し、このラインスキャンで取得したCCDアレイからのデータを保存し、CCDアレイのピクセルをクリアする必要があります。レーザーの位置を動かします。前に決定した量だけY方向に焦点を合わせます。

次に、サンプルを横切るX方向にレーザービームをスキャンします。もう一度、CCDのシャッターを開いたままにして、データを保存します。このラインスキャン手順を繰り返して、1つの生体細胞の寸法よりも約50%大きい物理領域がレーザー光で照らされます。

特定のラインスキャン画像の行番号と波長との関係を使用して画像を再構築し、異なる波長の複数の元妻の蛍光強度の顔マップを取得する必要があります。特定の波長の元妻の蛍光提出画像を取得するには、この波長に対応する最初のラインスキャンから取得した画像上の行番号を見つけます。次に、後続のラインスキャン画像の隣接する行は、蛍光発光画像の次の行に対応します。

その特定の波長について、この波長に対応するすべての画像行を積み重ねて、その波長でのサンプルのXY蛍光強度空間マップを取得します。他のすべての取得可能な波長についてこの手順を繰り返して、サンプルのデータを収集します。まず、形質転換した酵母コロニーを持つプレートをインキュベーターから取り出します。

形質転換細胞には少なくとも3種類あるはずです。目的のタンパク質を発現する細胞には、両方のタイプの蛍光プローブがタグ付けされています。ドナー蛍光プローブでタグ付けされたタンパク質のみを発現する細胞、およびアクセプター蛍光プローブでタグ付けされたタンパク質のみを発現する細胞。

100マイクロリットルの100ミリモル塩化カリウムをマイクロ遠心チューブに加えます。次に、マイクロピペットチップを使用して、ドナーと蛍光プローブ以外の両方のタグが付けられたタンパク質を発現する細胞のプレートから3〜5個の酵母コロニーをこすり落とし、100ミリモルの塩化カリウムを接種します。これらの細胞を使用して、細胞懸濁液を10マイクロリットル取り出し、新しい顕微鏡で分注します。滑る。

液滴をカバースリップで覆い、カバースリップの表面に油の液滴を置きます。次に、レーザー光線の経路にあるシャッターを手動で閉じて、レーザー光が顕微鏡の対物レンズに到達するのを防ぎます。顕微鏡スライドをXY、Z平行移動ステージに固定し、顕微鏡の対物レンズが液浸油滴に接触するまでスライドステージを光軸方向に平行移動します。

次に、広視野光照明をオンにして、カメラに移動します。データ収集のビデオモード。サンプルの広視野画像は、発光経路に透過格子が存在するため、著しくぼやけます。

そのため、全幅半値の小さいバンドパスフィルタを、透過回折格子の前の光路に配置してください。カメラ画面上の細胞の画像を見ながら、細胞に焦点が合うまで、平行移動ステージを光軸方向にゆっくりと平行移動します。ステージをX方向またはY方向に移動させ、1つのセルをレーザービームの焦点の位置に持ってくるようにします。

広視野照明源をオフにし、バンドパスフィルターを発光パスから取り外します。レーザービームのブロックを短時間解除すると同時に、CCDアレイで受信した信号を確認します。レーザービームが細胞に入射している間にCCDアレイで蛍光信号が検出された場合は、この細胞の蛍光データ取得スキャンを行ってください。

同じスキャンパラメータ、特にライン数と、前に示したキャリブレーション手順で決定された増分の理由を使用することが重要です。ドナータグとアクセプタータグの両方に結合したタンパク質を発現する多数の細胞について、細胞位置と蛍光データ取得プロセスを繰り返します。十分な蛍光画像を蓄積した後、両方の受容体でタグ付けされたタンパク質を発現する細胞の画像が、ドナー蛍光プローブでタグ付けされたタンパク質のみを発現する細胞と、アクセプター蛍光プローブでタグ付けされたタンパク質のみを発現する細胞の両方について、全プロセスを繰り返します。

最後に、すべてのスキャンを再構築して、スペクトル分解を取得します。これらの3つの図で前述した手順を使用した各データセットのXY蛍光強度空間マップは、無菌からアルファ因子受容体を発現する酵母細胞に対して行われたスペクトル分解された2光子顕微鏡測定から計算された結果として得られる空間マップです。ドナーシグナルとアクセプターシグナルの2次元マップは、細胞の各位置から得られたスペクトル発光プロファイルを解析して得られた。

蛍光強度には、その値に応じて偽色が割り当てられ、スケールは挿入図として表示されます。次に、ヒストグラムプロットが準備されたばかりのセルの見かけのフレット効率マップから抽出された値を使用して、KDAおよびKAD画像を使用して見かけのフレット効率の2次元マップを計算しました。セルの計測されたEAPP値は、円で表されます。

赤い実線は、緑の実線で表される個々のカルシウム関数の合計を使用して、測定データに最も適合することを表しています。プロトコルのテキストに記載されているヒストグラムの分析により、無菌の2つのアルファ因子受容体すべての靭帯複合体がin vivoでRBA形状の四量体の形をとることが確認されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば12時間で実行できます。

この実験を行う際には、励起源の電力を低く抑えることが重要です。ドナーが1つのパルスで複数回興奮しないようにすることが重要です。