Name: リンパ球増殖を監視するためのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 学ぶ CFSEを用いたマウスリンパ球の蛍光標識法。細胞分裂をフローサイトメトリーで追跡し、免疫応答におけるT細胞の増殖を可視化する信頼性の高い手法を解説します。

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この記事で報告された作品は、国立保健オーストラリアプログラムグラント（CRP）とNHMRCプロジェクト無償（CRPとBJCQ）の医学研究評議会（NHMRC）によってサポートされていました。またBJCQはNHMRCピータードハティー博士研究員です。

1）試薬のセットアップ 1.1）CFSEストック溶液 CFSE色素は、通常、25mgのバイアルに、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA、SE）（MW 557.47グラム/モル）として購入されています。 （数ヶ月まで-20℃で50〜100μL分注しのような店）の5mMの最終的なストック溶液のために8.96 mLのDMSOに25 mgを溶解する。それはそのような露出が貯蔵中に回避することが重要であるので、CFDA、SEは、水溶液と反応する。 1.2）リンパ球脾臓とやマウスからのリンパ節からリンパ球を分離し、0.5〜× 10 6の細胞濃度を5％熱不活化（HI）ウシ胎児血清（FCS）、を含む培地を1mL（例：RPMI）に再懸濁する- 10 × 10 7 / mLの。 2）CFSEラベリング 2.1）ルーチン方法： <ol class="lalpha"><li>徹底的に新鮮な（非接流体）を10mLのコニカルチューブの底に慎重に培地と場所の1mLの体積で細胞を懸濁します。 </li><li> （非接液チューブを使って移動し、途中でCFDA、SEのソリューションとの混合から1 mLの細胞懸濁液を防止する）水平にチューブを置きます。 </li><li>慎重に細胞溶液との接触をしない保証するチューブの上部にあるプラスチック製の非接液部分にPBS 110μLを加える。 </li><li> 110μLのPBSでCFDA、SEの5mM株式の1.1μLを再懸濁します。 </li><li>すぐにチューブにキャップをし、ソリューションの混合素早く均一に得るために井戸を反転し、渦。 CFSE色素は、5μMの最終濃度にあることに注意してください、しかし、最適な濃度は、調製した各バッチに対して決定する必要がある場合があります、そして、それが効果的であることを保証するために6ヶ月毎にチェック。 </li><li>室温で5分間細胞をインキュベート。 CFSEにCFDA、SEの変換（説明を参照）により色素は蛍光灯や過度の光に曝露することによって漂白のため、発生しやすくなることに注意してください。従って、それはアルミホイルでそれを覆うことにより、例えば、この点からの光からチューブを保護することをお勧めします。 </li><li> 20 ° Cと廃棄上清で5分間、300 × gで遠心分離により沈降、20℃PBS 5％HI FCSを含む10倍量に希釈して細胞を洗浄。さらに2回洗浄繰り返します。 </li></ol> 2.2）にも高い細胞数（10の適切な代替方法、 - 30 × 10 7）： <ol class="lalpha"><li>得るために井戸を1mlのPBSに5 mMストックの2μLを添加すると迅速に徹底的に再懸濁した細胞を1 mLにこれを追加することで2 ×（10μM）CFDA、SEのソリューションを準備し、その後すぐにチューブをキャップと反転し、渦素早く均一混合。 </li><li>室温で5分間細胞をインキュベートし、手順2.1（f）および2.1（g）のように洗浄。 </li></ol> 2.3）次に、細胞を細胞分裂の誘導のための関心のプロトコルに適用することはできません。標識された細胞は、in vitroおよび in vivoアッセイの両方で使用できます。 2.4）増殖アッセイの完了時に、細胞を採取していると（代表的な例については下記参照）フローサイトメトリーで分析した。 3）代表者の結果 CFSEの希釈によるリンパ球増殖を評価するために、それは分割されていない細胞（すなわち、最大蛍光）と非標識細胞（すなわち、最小の蛍光）の蛍光を知っておくと便利です。したがって、実験的なデザインが考慮に入れ、これらのコントロールを取る必要があります。下記のin vitroおよびフローサイトメトリーによってCD8 + T細胞の分裂を測定するためにCFSEを用いたin vivo試験の例である。 in vitro刺激 3.1） 図1は、のCFSEのプロファイルを示してCFSE標識オボアルブミン（OVA）特異的T細胞受容体トランスジェニックOVAの様々な量でパルスした樹状細胞と3日間の培養後のCD8 + OT - I T細胞。 CD8 + OT - Iマウスの脾臓とリンパ節から精製したT細胞が3.3 × 10 4 DCと共に培養CFSEと1 × 10 5細胞を標識した。 DCはここで、C 37℃で1時間OVAでパルスし、二回文化への事前の洗浄。 3日後、収穫し、標識抗CD8 - APC抗体とヘキスト33258とし、フローサイトメトリー（50,000件のイベントが収集された）によって分析した細胞。ライブは（ヘキスト33258 - ）CD8 +細胞が示されています。非標識細胞は自家蛍光細胞と検出可能な細胞分裂の限界のを示しながら、コントロールとして、単独で培養したCD8 + T細胞は、非分裂細胞のCFSEの強度を示しています。 4 CFSEピークは細胞が3分割まで受けていることを示し、この例ではパネルのそれぞれで見ることができることに注意してください。 in vivoで刺激3.2） 図2は、 生体内での 3日後にCFSEで標識したOVA特異的T細胞受容体トランスジェニックCD8 + OT - I T細胞のCFSEのプロファイルを示しています私■20μgのOVAの存在。 CD8 + CD45.1ジェニックOT - Iマウスの脾臓およびリンパ節から精製したT細胞をCFSEと5 × 10 6個の細胞は、C56BL/6Jの外側尾静脈（CD45.2 +）マウスに静脈注射で標識された。 2時間マウスの後にOVAを20μgと静脈注射した。 3日後、マウスから脾臓を抗B220 - PerCP、抗CD8 - APC - Cy7と抗CD​​45.1 - PE - Cy7抗体とヘキスト33258で標識された、単一の細胞懸濁液に加えた、収集して分析したフローサイトメトリーによる（1,000,000イベントが収集された）。ライブ（ヘキスト33258 - ）B220 -細胞は、右側のパネルに示すように左のパネルと+ CD45.1 +細胞をCD8ゲートに示されています。コントロールとして、無刺激のCD8 + T細胞をCFSE標識、非分裂細胞のCFSEの強度を示し、非標識細胞間、細胞および検出可能な細胞分裂の限界の自家蛍光を示しています。 CD45アロタイプ差を利用し、転送CD8 +彼らは合計CD8 + T細胞（左パネル）のマイナーなサブセットであるため、ホストからのT細胞を、解決に不可欠であることに注意してください。ほとんどの細胞は細胞が6部門にまで受けていることを示し、この例（右パネル）の7 CFSEピーク内に収まっていることに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 CFSEで標識した卵白アルブミン（OVA）特異的T細胞受容体トランスジェニックCD8 OVAの異なる濃度でパルスしたDCへの試験管内で反応する+ OT - I T細胞、3日間培養した後であること示されているデータが。注意CD8の非分割人口+ T の能力抗原（ライトグレーのヒストグラム）と非標識の人口（濃い灰色のヒストグラム）の自家蛍光の有無で細胞。図は、CD8 +より高い抗原濃度で割るより多くのT細胞とCFSE希釈ピークに基づいて1〜3回に分けているT細胞を、示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。の能力をCFSEで標識した卵白アルブミン（OVA）特異的養子OVAに応答するためにC57BL / 6マウスに転送T細胞受容体トランスジェニックCD8 + OT - I T細胞、、養子移入後3日以内に示したデータ左パネル：。CD8 +、CD45。レシピエントマウスに1 + OT - 1 T細胞。右のパネル：CFSE細胞増殖プロファイル。 CD8の非分割人口の点に注意してください+レシピエントマウスのT細胞が抗原（ライトグレーのヒストグラム）と非標識リンパ球（濃い灰色のヒストグラム）の自家蛍光を受信して​​いません。図は、CFSE希釈ピークに基づいて1から6回を分けているCD8 + T細胞を示す。 <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA、SE）を持つ細胞のラベリング中に発生する様々な分子事象の表現。プロセスの詳細については、ディスカッションのテキストを参照してください。注：一般的な頭字語"CFSE"ではなく、CFDA、SEは、一般の標識試薬とラベリング手順を記述するために使用されます。教区4に基づく図。

<ol><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).</li>
<li>Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParish%2C+CR+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E. , (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

CFSEの仕​​組みと、なぜ急速な標識方法に感謝するために、増殖の解析での使用に必要な、それはCFSE細胞標識の分子基盤を理解しておくと便利です。これは二つのフェーズ、1）セルのエントリ、2）タンパク質の標識（図3）に分けることができます。 1）セルのエントリ：セルへの染料のエントリーは、染料のジアセチル形、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA、SE）によって媒介される。酢酸塩は、原形質膜を介してその迅速なフラックスを可能に色素性の高い膜透過性を作る。細胞内に存在するエステラーゼ、、それによって切断するCFDA、SEから酢酸とはるかに少ない膜透過性である染料のCFSEの形態を生じさせるには、このように細胞内の色素を集中。 2）タンパク質標識：CFDA、SEとCFSEの両方がアミノ反応性スクシンイミジル側鎖を持っているが、唯一のCFSEの蛍光灯です。 CFSEの高い細胞内濃度は、タンパク質を迅速かつ高いレベルの細胞内ラベリングを容易にします。細胞のCFSE標識は、代表的な結果（図1および2）に示すようにいくつかの部門を受けた細胞を解決するために重要である細胞の均一に標識された人口を、得るために迅速に実行する必要があります。

<table><tbody><tr><td>CFDA,SE</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リンパ球</td><td>例：マウスまたはヒト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>SAFC Global</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-15ml コニカルチューブ</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Capral Aluminium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リンパ球増殖を監視するためのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（cfse）の使用

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）はリンパ球分裂1-3を監視するために効果的で人気のある手段です。 CFSEは共有結合蛍光色素、カルボキシで長寿命の細胞内分子にラベルを付けます。このように、CFSE標識細胞が分裂するときに、その子孫は、カルボキシタグ付き分子の数の半分とを授けられており、したがって、各細胞分裂は、フローサイトメトリーを介して細胞の蛍光に対応する減少を測定することにより評価することができます。その低い細胞毒性と相まって非常に低分散の高い蛍光強度を持つリンパ球集団を、ラベルを付けるCFSEの容量は、その細胞分裂を測定するために理想的な色素こと。それは、フルオレセイン系染料なのでそれはまた、マルチカラーフローサイトメトリーにそれが適用されること、他の蛍光色素の広い範囲と互換性があります。この記事では、通常8細胞分裂にまで監視の目的のためにマウスのリンパ球を標識するために使用される手続きを説明します。これらの標識された細胞は、in vitroおよびin vivo試験の両方を使用することができます。

CFSEは共有結合蛍光色素、カルボキシで長寿命の細胞内分子にラベルを付けます。このように、CFSE標識細胞が分裂するときに、その子孫は、それによって細胞分裂を評価するために使用できる蛍光の半分の量を、持っている。この資料では、通常CFSEでマウスのリンパ球を標識するために使用される手続きを説明します。

リンパ球増殖を監視するためのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）の使用

カルボキシフルオレセイン・スクシンイミジルエステル（CFSE）は、リンパ球の分裂をモニタリングするための有効かつ普及している手法である1-3。CFSEは、長寿命の...に共有結合的に標識を施す。

この実験の全体的な目的は、細胞内蛍光染料であるCFSEを用いてリンパ球を標識し、フローサイトメトリーによってリンパ球の細胞分裂をモニタリングできるようにすることです。これは、CFSEのジアセチル形態であるCFDAseをリンパ球と混合させることで達成されます。2つのアセチル基により、染料がリンパ球内の細胞に迅速に進入することが可能になります。エステラーゼがC-F-D-A-S-Eからアセチル基を除去することで、染料のCFSE形式が形成されます。アセチル基がなくなることで、CFSEは蛍光性を持ち、同時に膜透過性が低下するため、染料が細胞内に濃縮されます。その後、CFSEのアミノ反応性AL側鎖が染料を細胞内タンパク質に共有結合させ、これにより細胞はほぼ永続的に蛍光を発するようになります。CFSEは、娘細胞の蛍光強度が段階的に減少することに基づき、リンパ球の分裂をモニターするために使用できます。トリチウム標識チミジンの取り込みなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、個々の細胞の細胞分裂をモニターできることです。細胞を標識するための手順については、私の研究室のリサーチフェローであるBen Quaが実演します。マウスの脾臓またはリンパ節から freshly isolated したリンパ球を用い、5% 熱不活化胎児牛血清を添加した培地を用いて、細胞濃度を 0.5〜10 million cells/mL に調整します。細胞を十分に再懸濁し、1 mL を新しい 10 mL コニカルチューブの底に注意深く移します。チューブを慎重に水平に寝かせます。チューブ上部のプラスチックの濡れていない部分に、110 µLのPBSを加えます。このとき、細胞溶液に接触しないように注意してください。この110 µLのPBSに、5 mMのC-F-D-A-S-Eストック溶液1.1 µLを加え、新鮮な染色液を調製します。染料は蛍光を発し、光退色しやすいため、速やかにチューブの蓋を閉め、転倒混和およびボルテックスを行い、溶液を迅速かつ均一に混合させます。チューブをアルミ箔で覆い、遮光します。細胞を室温で5分間インキュベートします。20 °Cの5% H-I-F-C-S含有PBSを用いて、10倍量で希釈して細胞を洗浄し、20 °Cで300 Gsにて5分間遠心分離して沈殿させ、上清を捨てます。この洗浄操作をさらに2回繰り返します。その後、細胞を目的のプロトコルに適用して細胞分裂を誘導させます。ラベル化した細胞は、in vitroおよびin vivoの両方のアッセイに使用可能です。増殖アッセイの完了後、細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析します。この例では、遺伝子改変トランスジェニックマウス由来のT細胞が、異なる濃度の抗原でパルスした樹状細胞に対してどのように反応するかを測定するために、in vitroでCFSEラベル化を用いています。網掛けのないCFSE希釈ピークは、1回から3回分裂したトランスジェニックCD8陽性T細胞を示しています。抗原濃度が高くなるほど、より多くのT細胞が分裂することがわかります。CFSEラベル法は、養子移入実験のようなin vivoアッセイにも適用可能です。ここでは、レシピエントマウスにおいて目的のT細胞集団を特定するためにfax（フローサイトメトリー）が用いられています。その後のCFSE増殖プロファイルは、CFSE希釈ピークに基づき、分化後に1回から6回分裂したCD8陽性T細胞を示しています。この手法は、免疫応答におけるリンパ球の増殖を探索する研究者や免疫学への道を開きました。

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