Name: Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚からの一次神経培養法。Midgastrula期のDrosophila胚を用いて電気興奮性とシナプス伝達を研究する。神経細胞の分化と機能解析に活用できる。

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この作品は、DKODにNIHの助成金NS27501によってサポートされていました。 HHMI教授グラントからDKODにこの仕事のための追加サポート。

I.ショウジョウバエの胚のコレクション<ol><li>卵のコレクションプレートを準備<ol><li> 8グラムの寒天を加えて200mlのdH 2 Oを沸かす</li><li> 50℃まで冷却</li><li> 2ミリリットルエタノール、2mlの酢酸を追加</li><li>トップス、35mmプラスチックシャーレに注ぐ</li><li>クールと4で気密容器° Cで保管</li><li>約80枚になります</li></ol></li><li>酵母ペーストを準備する<ol><li>貼り形成するために水にFleishmansアクティブベーキング酵母を溶かす</li><li>酵母を殺すために20〜30秒のためのマイクロ波（以上沸騰に注意） </li><li> 4℃で2週間で10 ccシリンジ（針なし）で保管して</li></ol></li><li>ハエ：卵の収集に使用される大人は、彼らは新鮮な食料へのアクセスがあったことを提供、3〜14日、新興の後に、一般的に最も生産的です。多くの変異株は、産卵とは、最も生産的となる年齢の変化の低下率で現れることができる肥沃度が低下している。一般的に、数百の大人は、良い産卵個体群ために作る。 </li><li>手順：卵のコレクション板に貼り付け酵母の薄層を広げて。これは、卵の産卵のための良好な基質を提供します。転送成人は、瓶の口の中にきれいな卵のコレクションのボトルとテープコレクションプレートに飛ぶ。湿度が上昇するとハエがペーストにし、瓶の側面にはまり込むように長く3-4時間よりも、これらのボトルにハエを放置しないでください。 </li></ol> II。ブリーチと胚Dechorionation <ol><li>アスピレーターに接続されているフィルターフラスコに接続したブフナー漏斗を設定します。漏斗でワットマン＃1枚の紙を置く。吸引を実行している状態で、滅菌蒸留水で紙を濡らし。 </li><li>洗浄瓶からの水の流れとろ紙の上にコレクションのプレートから胚を洗浄します。 </li><li>滅菌水のいくつかのボリュームでそれらをすすぎ、吸引器の電源をオフにし、50％の漂白剤の漏斗のボリュームを追加します。卵は5〜10分放置します。 chorionsは1〜2分で溶解されますが、長くて、漂白剤で胚を残す汚染酵母の多くは破棄されます。料理を洗い流したているすべての大人や幼虫を取り出す。 </li><li>滅菌蒸留水で滅菌ペトリ皿（NOT組織培養）に胚を洗浄します。それは事前に接液されていない場合の胚の多くは、皿の底に残ることでしょう。この料理の滅菌水で数回すすいでください。 </li><li>中期原腸胚期の胚を取り出すために透過光による胚を調べます。 </li></ol> III。単一の胚培養の準備<ol><li> DDM1を作る（セクションIVのレシピを参照してください） </li><li>直前の培養に胚の皿から水を注ぐ。滅菌メディアで胚をカバー。 </li><li> 3、35ミリメートルペトリ皿を設定します。各皿の4オートクレーブ円形カバーグラスに入れて。各カバースリップ上で、培地の5μlを置く。 Bellcoカバーガラス - 低鉛ガラスcoverlipsを使用してください。 Bellco生物学的ガラス製品 800-257-7043 猫＃1943から00012 </li><li>いくつかの非常に微細なピペットを引き出します。我々が使用するピペットはナリシゲPP - 83プラーに引っ張られている。ピペットの正確な寸法は重要ではなく、我々は通常、私たちが望むよりも細かそれらを引き出し、それらは大きさを測定するために胚のような視野の同じ分野で先端を折る。あなたが一度に胚のすべてを吸うしたくない、と自分は、それが細胞を吸うために5分かかるという情報が非常に小さくしたくない。両者の間のどこかを目指しています。透過光で胚を調べて、胚の内容を削除するには、ピペットに接続されている口の吸引管を使用してください。可能な限りカバースリップの近くに優しく細胞を追い出すことで、準備カバースリップ上に細胞を分散させる。あなたは、より高い電力でカバースリップを調査し、さらに同様の方法で細胞を分散させる場合があります。 </li><li>細胞は10分以上、もはや放置。洪水は、メディアと皿とインキュベーターに入れ、4-5％のCO 2環境、定義された培地を使用する場合。 22〜24℃の温度我々は日常的に23℃、湿度95％を使用。湿度は、蒸発を避けるためにしたいとして、重要です。あなたは23に設定された温度制御℃で冷凍庫に入れ、標準の哺乳類の培養器を使用することができます</li></ol> IV。文化を成長させるためのDDM1定義培地<ol><li> DMEMを加える：ハムのF12/DMEメディアの100 MLS（DMEM）（アーバインサイエンティフィック＃9052）に。 <ol><li> 0.476グラムのHepes（20mMの）（シグマ＃H - 3375）を追加します。ミックス。 </li><li> 1.25ミリリットル、L -グルタミン200mMのを（アーバインサイエンティフィック＃9317）を追加します。ミックス。 </li><li> 0.2μmの酢酸シリンジフィルター（2種類のフィルターを必要とする）とフードでフィルタリング。 </li><li> pHは6.64とOSM 288です。 </li><li> 15ミリリットルの遠心チューブに10ミリリットルのアリコートを行います。 </li><li> 4℃で2週間以上ないため。 注：常にメディアやサプリメントだけのために予約されているコンテナでオートクレーブ滅菌ろ過水を使用して行う。以下に記載されている追加補足：pH電極を置くか、またはMedia.To内の他の目的に使用される攪拌棒を絶対にDDM1を作るDMEM直前に培養することに。 </li></ol></li><li> DMEM追加の10〜MLS： <ul><li> 100μlのトランスフェリン</li><li> 100μlのプトレシン</li><li> 100μlのセレン</li><li> 100μlのプロゲステロン</li><li> 50μlのインスリン</li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

midgastrula期胚から調製ショウジョウバエの培養では神経細胞はin vitroで分化に先立って分割しその多くが神経芽細胞の前駆体、から生じる。このシステムは、このように神経発達のごく初期の段階（Rohrbaughら、2003）で重要な遺伝的要因と環境要因の探査のためのユニークな機会を提供します。我々は、単純な定義の培地中で増殖させた神経細胞でも（;リーとOダウド、1999 Oダウド、1995）機能的なシナプス結合を形成する電気的興奮性ニューロンへの分化が示されている。このモデルシステムは、電気的興奮性とシナプス伝達（ホッジスら、2002の開発に関与する役割の​​遺伝子と環境要因を探るために使用できる標準的な全細胞記録技術と組み合わせて、変異体および/または薬理学的操作の分析を使用;リーとOダウド、2000; Leeら、2003）。。

このメディアに作られた文化は、約22〜24℃、5％CO2インキュベーター内で維持されなければならない我々は、インキュベーターが涼しい部屋に置き、標準の哺乳類の組織培養を使用し、23℃に加熱常に使用されるろ過水をオートクレーブし、メディアやサプリメントだけのために予約されている容器にしてください。 pH計を置いていないか、メディア内の他の目的に使用されるバーをかき混ぜることはありません。

midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの主ニューロン培養を行うための手順を示しています。漂白剤を使用して、胚とそのdechorionationを収集するための方法が実証されています。口の吸引管に接続されているガラスピペットを用いて、我々は、単一の胚からのすべてのセルの除去を示しています。コー​​ティングされていないガラスのカバースリップ上で培地の小さな（5リットル）ドロップに各embyroから細胞を分散させるための方法が示されている。めっき後の1時間での顕微鏡を使用してビューには、好ましい細胞密度を示しています。定義された培地中で増殖させた場合、生存細胞のほとんどは12-24時間で神経突起のプロセスを拡張する前に、文化に1回以上の分割神経芽です。顕微鏡を使用してビューには、神経突起伸長のレベルを示し、in vitroで2日間で健全な文化の中で期待分岐を。培養は22〜24℃、5％CO 2インキュベーター中で、定義された培地をベースにシンプルな炭酸で栽培されています神経突起のプロセスは、文化としたとき、彼らはしばしば機能的なシナプス結合を形成する隣接セルからの神経突起と接触するように最初の週にわたって詳しく説明し続ける。これらの培養物における神経細胞は、電位依存性ナトリウム、カルシウム、カリウムチャネルを発現しており、電気的興奮性があります。この培養系は、ニューロンの分化、興奮性、およびシナプス形成/機能を調節する分子遺伝学的要因と環境要因を研究するために有用です。

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

このビデオでは、中期原腸胚期のショウジョウバエ胚から一次神経細胞培養を作成する手順を説明します。胚の回収方法は...

私はダイアナ・ダウドです。カリフォルニア大学アーバイン校の発生・細胞生物学、および解剖・神経生物学部門の教授を務めています。本日は、ショウジョウバエ胚からの一次ニューロン培養の調製方法について実演します。具体的には、中腸形成期のショウジョウバエ胚からすべての細胞を取り出し、それらを細胞培養に供する手順について解説します。これらの培養細胞を用いる目的は、ショウジョウバエのニューロン間における電気的興奮性とシナプス伝達の調節に重要な遺伝子および環境因子を真に理解することにあります。この手順を開始するために、まずショウジョウバエの胚を回収する必要があります。そのために、卵回収プレートを用意し、そこに酵母ペーストを少量塗布します。これは成虫が産卵するのに適した基質です。これらのプレートを、通常100匹から200匹の成虫が入ったボトルに入れます。その後、成虫に2〜3時間ほど産卵させます。次に卵回収プレートを取り出します。これらが培養手順で使用する胚となります。手順の次のステップは胚の脱外殻（Dec coate）であり、これは実際に絨毛膜を除去することを意味します。胚をビュヒナー漏斗に洗い流し、フィルターペーパーで胚を捕捉することでこれを行います。ブフナー漏斗に入れ、50%漂白剤溶液に浸らせます。この50%漂白剤溶液は、絨毛膜を溶解させるだけでなく、滅菌手順の一部としても機能します。この操作は実際にはフード内ではなく、フード外で行います。脱塩素化された胚は、その後ペトリ皿へと洗浄して移します。実際、コーリアン（Corian）を除去すると、卵膜（viel membrane）はかなり粘着性があるため、シャーレにうまく貼り付きます。そこに蒸留水を注ぎ、その蒸留水を2、3回入れ替えてください。単に水を捨てるだけで、胚はシャーレに貼り付いたままになります。組織培養用プラスチックシャーレは使用しないでください。それらは付着しません。胚が入ったペトリ皿をラミナーフローフード内に入れ、滅菌操作を開始します。これらはBellco社製のカバーガラスです。これらは未コーティングで、オートクレーブ処理済みですが、洗浄はされていません。この状態ではあまりうまく機能しないことがわかっています。洗浄する場合、通常は4枚のカバーガラスを取り出し、1枚のペトリ皿に入れます。したがって、各ペトリ皿で4つの胚培養を行います。これでペトリ皿の準備が整い、培養を開始できます。私は通常、一度に12から16の培養を行います。使用する培地は、比較的単純な限定培地です。これはADMEMベースであり、この液体培地は2週間ごとに調製されるため、冷蔵庫で2週間保存可能です。これは滅菌済みです。0.2 µmの滅菌フィルターでろ過した後、培地に5種類のサプリメントを添加します。これらは2ヶ月に一度調製し、分注して冷凍保存したもの

preparation-neuronal-cultures-from-midgastrula-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

私たちは、から解離初代細胞を調製するための詳細なプロトコルを提供...

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

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このビデオは、ショウジョウバエの脳神経幹細胞の静止状態からの再活性化を開始する外因性因子を特定するためのプロトコルを示しています。孵化したばかりの幼虫を解剖して脳を分離し、その後、試験ホルモンの有無にかかわらず培地で培養して、神経幹細胞の再活性化と増殖を誘導するホルモンの可能性を評価します。...

培養ショウジョウバエ脳外植片における神経幹細胞の再活性化の解析

このビデオは、マウス胚の中脳からドーパミンニューロンを分離し、培養するプロセスを示しています。孤立した腹側中脳床は、酵素を使用して解離されます。得られたドーパミンニューロンは回収され、マルチウェルプレート内のマイクロアイランドに移されます。細胞をドーパミンニューロン培地とインキュベートして、細胞をマイクロアイランド内で高密度に維持します。...

初代胚性マウス中脳ドーパミンニューロンの単離と培養

出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。...

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パーキンソン病中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの変性の原因は完全には理解されていません。細胞培養システムは、これらのニューロンの神経生理学的特性を研究するための重要なツールを提供します。ここでは、神経変性のin...

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胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

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ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

学ぶショウジョウバエ胚からの一次神経培養法。Midgastrula期のDrosophila胚を用いて電気興奮性とシナプス伝達を研究する。神経細胞の分化と機能解析に活用できる。

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

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