Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。

私の名前はダイアナ・ダウドで、カリフォルニア大学アーバイン校の発生細胞生物学および解剖学および神経生物学の教授です。そして今日は、ショウジョウバエの胚からの初代ニューロン培養物の調製についてお話しします。そして、これに伴うのは、実際に胃の中期であるショウジョウバエの胚からすべての細胞を取り出し、細胞培養に入れることです。

そして、これらの培養物を使用するのは、ショウジョウバエのニューロン間の電気的興奮性とシナプス伝達の調節に重要な遺伝子と環境要因が何であるかを本当に理解することです。この手順を開始するには、ショウジョウバエの胚を収集する必要があります。そのために、卵収集プレートを取り、その上にイーストペーストを少し広げます。

これは、成虫のハエが卵を産むのに適した基質です。これらのプレートを、通常は100〜200匹の成虫のハエの集団が入ったボトルに置きます。そして、ハエの成虫に約2〜3時間卵を産ませます。

次に、採卵プレートを取り出し、これが培養手順に使用する胚です。次のステップは、胚をデックコーティングすることであり、それは実際にコリオンを取り除くことを意味します。これを行うには、胚をビュヒナー漏斗に洗い流し、その上に濾紙を敷いて胚を捕まえます。

私たちは、それらを50%漂白剤溶液でブフナーファンネルに座らせることができます。この50%漂白剤溶液は、コリオンを溶解するだけでなく、滅菌手順の一部としても機能します。この手順は実際にはフードの中ではなく、フードの外側で行っているので、胚は脱塩素されたらペトリ皿に洗い流されます。

彼らは実際に、コーリアンがなくなると、ビエル膜はかなり粘着性があり、ペトリ皿にうまくくっつきます。次に、その上に蒸留水を注ぎ、蒸留水を2〜3回取り除き、実際に水を捨てるだけで、胚がペトリ皿にくっつきます。ティッシュカルチャープラスチックディッシュは使用しないでください。

彼らはそれに固執しません。手順の無菌部分は、胚のペトリ皿を取り、それを層流フードに取り込むことから始めます。ベルコのカバースリップです。

コーティングされていませんが、オートクレーブ処理されており、洗浄されていません。しかし、それらはあまりうまく機能していないことがわかりました。洗濯したら、通常は4枚のカバースリップを取り出して、1枚のシャーレに入れます。

そこで、各シャーレで4つの胚培養物を作ります。さて、ペトリ皿は基本的に私たちが培養を開始する準備ができており、私は通常、一度に12〜16の文化を作ります。大丈夫です。私たちが使用する培地は、比較的単純な定義済み培地です。

A-D-M-E-Mベースで、この液体培地は2週間に1回作るので、冷蔵庫で2週間保存できます。これは滅菌されています。0.2ミクロンの滅菌フィルターにかけ、5種類のサプリメントを培地に加えます。

それらは2か月に一度調製され、その後、10ミルの液体培地に加えられるアリコートで凍結されます。したがって、内容物を削除するだけです。最後に、これはただ、このメディアを静かに反転させて混ぜ合わせるだけで、準備が整います。大丈夫です。

すべてがセットアップされています。私は準備ができている私の培養皿を持っています、それ、または4つのカバースリップが入った私のペトリ皿はすぐに行く準備ができています。そして今、私は胚と一緒に皿を持って行きます、そして私はそうするつもりです、彼らは今蒸留水に座っています。

蒸留水を振り落とすだけで取り除いていきます。これが私がゴミ箱に捨てる方法です。そして今、私はこれらの胚に約2ミルの培地を注ぎます、そして今、彼らは私が実際にガラス針を個々の胚に挿入し、内容物を取り除く準備ができています。

メディアを外側に置かなければなりません。明らかに、そこに水があれば、浸透圧ショックが発生します。さて、胚の中身を取り出す直前に実際に培養物を準備する準備をするために、実際に5マイクロリットルの滴をカバースリップに置きました。

長く放置しすぎると、メディアのpHが変化します。さて、今度は4枚のカバースリップのそれぞれの中央に5マイクロリットルのドロップを置きます。実際には、これらのドロップができるだけ無傷でいることを言うことが重要です。

媒体がカバースリップ全体に広がると、細胞が一部にメッキされ、非常に薄い液体の層は困難になります。あなたはemが細胞をきれいに丸い液体の滴にメッキしたいです。ご覧の通り、丸い液体が4滴入っています。

そして今、私は引いたピペットの1つを取り、それをこの口ピペットチューブに取り付けます。あなたはあなたが望む任意のチューブを使用することができますが、このチューブの良いところは、実際にはVWRパイプ校正された100マイクロリットルピペットが付属しています。そして、私たちが持っているこれらの中には、ここに小さなゴム製のガスケットがあります。

口のピペット、つまりガラスピペットをピペットのこの端に挿入できます。そして、胚の中身を吸い上げると、これ以上は上がらず、胚が狭くなり始める部分になります。つまり、マウス吸引を使って私を隔てる巨大な領域があるのは、ここと細胞がある場所

ですから、汚染の問題はありません。誤って内容物をこの領域に吸い込むと、汚染の大きな問題が発生します。当社の層流フードには、スコピックベースの解剖顕微鏡があります。

これにより、胚の下から光が差し込むことができ、実際の胚を見るときに見える頭蓋溝や中腸、想像力を実際に見ることができます。そして、これが実際に胚の中身を取り除くために培養に重要な胚の段階を選ぶ方法です。ガラスピペットを使用し、パッチ記録ピペットを作るために使用する通常のマイクロ電極プーラーで引っ張ります。

設定が何であるかはあまり気にしません。私たちは、胚の隣の皿でピペットを本当に必要なサイズで折るので、かなり細かいピペットを引っ張ります。次に、これらのガラスピペットを胚のビエル膜を通して挿入し、ピペットの背面の背面に取り付けられた口内吸引チューブを使用します。

次に、胚全体の内容物を抽出します。次に、それを動かし、ピペットを取り出して、5マイクロリットルのメディアドロップが入ったカバースリップがある別の皿に移動します。そして、胚の内容物をその5マイクロリットルの滴に排出します。

細胞を分散させるために数回ピペットで上下させ、その後、そのカバースリップを約10分間皿に座らせてから、皿に2ミルの培地を浸します。めっきされた細胞の皿は、5%CO2インキュベーターに入れられます。私たちが使用するメディアは重炭酸塩バッファードメディアであるため、これは非常に重要です。

そこにはHEPがいくつかありますが、空気環境で緩衝するには十分ではありません。そのため、5%CO2のインキュベーターを使用する必要があります。ただし、22〜23度程度の比較的低い温度にする必要があるのが理想的です。

そこで、哺乳類の培養物から使用される標準的なCO2インキュベーターを37度に加熱します。私たちがやっているのは、ヒーターをオフにして、研究室に置いて、インキュベーターの底に氷を入れることで、温度を約21〜25度に保つことです。私たちが使用する他の手法は、これらの標準的な加熱式CO2インキュベーターの1つを取り出し、インキュベーターを冷蔵室に置くことです。

その後、周囲温度が室温が冷たい場合、インキュベーターを実際に非常に効果的に23度に加熱できます。そして、これらは私たちが標準的なシールを持つために使用する2つの方法であり、哺乳類のアザラシはインキュベーターに自分自身が生き残ることを可能にします。さて、これは1時間前にメッキされたカルチャーで、メッキ直後の1時間後と同じ倍率でメッキされたものです。

ここでは、約2日間分化したニューロンが見られます。文化では、神経芽細胞は1回以上分裂し、その後、ニューロンを生じさせ、ニューロンは、広範な重複する神経回路を形成するプロセスを拡張します。ここでは、向かい合っている2つの細胞体があります。

上の1つは11時位置のプロセスを延長し、下の1つは5時位置のプロセスを延長しています。これらは彼らの主要な拡張です。そして、それらがより細い枝を形成していることがわかります。

これらはガラス基板に非常に密着しており、これらを重ね合わせている他の細胞からも来るプロセスを見ることができます。そして、これらはシナプス結合の可能性のある部位です。これらの細胞の1つにパッチを当てると、一般的に、このレベルのプロセス精緻化により、シナプス機能的なシナプス電流が発生します。

現在、私たちの細胞はめっき後12時間で培養中で増殖します。彼らはかなり素晴らしいプロセスを拡張しているでしょう。私たちの標準的な生理学は、培養後に1〜2回くらいから始めます。

そして、彼らが実際に次の4、5日間、プロセスを拡大し続けていることがわかります。そして、私たちは細胞から培養で最大2週間を記録しましたが、私たちの記録のほとんどは、これらの培養物で2〜6日間の培養であり、その後、胃の真ん中のショウジョウバエの胚から準備したばかりで、培養で通信するニューロンのネットワークがあります。私たちは、これらの細胞の発火特性を実際に見ることができます。

それらは多様な焼成特性を持っています。彼らは、反復的に発火し、一部の細胞は反復的に発火し、他の細胞は出生時に発火し、これらの細胞は主にコリン作動性またはGABA作動性です。そして、これらによって媒介されるシナプス電流、ニコチン性、Aach受容体、H受容体、GABA受容体に注目することができます。