イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

この手順の全体的な目的は、細胞内溶液を制御しながら、制御された電圧下でBKチャネルの活性化を記録することです。これは、まずBKチャネルmRNAを注入してXenopus CytesにBKチャネルを発現させることで達成されます。手順の第2段階は、灌流システムの準備です。

本手順の第3ステップは、卵母細胞膜とパッチピペットの間にギガシールを形成することです。手順の最終ステップは、膜パッチを切り出すことです。最終的に、パッチクランプ法と灌流システムを組み合わせて得られた結果から、BKチャネルが電位およびカルシウム濃度の変化によって活性化されることが示されました。

こんにちは。ワシントン大学のJamie Zus博士の研究室に所属しているJin Cho Youngです。この手法は、イオンチャネル活性化の分子メカニズムに関する疑問など、神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。それでは、始めていきましょう。

本手順の最初のステップは、パッチクランプ法の数日前から開始し、in vitroで転写したBKチャネルmRNAを使用します。Xenopus oocyteの5〜6段階で回収した後、0.05〜50 ngのBKチャネルmRNAをoocyteに注入します。注入にはNanoject IIオートナノリッターインジェクターを使用してください。

各mRNAについて、同様に12個の卵細胞に注入を繰り返します。ND 96溶液を用いて卵細胞を2回洗浄します。その後、卵細胞を培養プレートに移し、18 °Cで2日以上インキュベートして、BKチャネルを発現させます。

2〜5日間のインキュベーション後、卵母細胞でBKチャネルが発現しているはずであり、パッチクランプ法に供することが可能になります。卵母細胞を取り扱う前に、灌流システムをはじめとするパッチクランプに必要な準備をすべて整えてください。ここに示しているシステムはAutomate Valve Linkです。

16 profusion systemによって加圧された窒素が、プロフュージョン溶液を溶液リザーバーからプロフュージョンチューブ経由でプロフュージョンペンシルおよびチップへと押し出します。各プロフュージョン溶液ストリームの流れは、1つのリザーバーバルブと1つの電子バルブによって制御されます。本プロトコルでは、リザーバーの1つは加圧されず、廃棄物回収容器および圧力放出機構として機能します。

実験前に、カルシウムまたはマグネシウムの濃度が異なる灌流液を調製しておきます。灌流液をリザーバーに加え、それぞれのカルシウムまたはマグネシウムの濃度を示すラベルを貼ります。まず灌流システムをセットアップするために、チューブを灌流ペンシルに接続します。

次に、電子バルブコントローラーの電源を入れ、電子バルブを開いて、チューブと灌流ペンシルに詰まりや気泡がないことを確認します。脱イオン水で満たしたシリンジを用いて、各チューブに脱イオン水を押し流してください。この時点で、チューブを溶液リザーバーに接続し、ガスシリンダーのバルブを開いて窒素で加圧します。

リザーバーバルブのいずれか1つを開き、リザーバー溶液のいずれかでチューブを満たします。必要に応じて、リザーバーバルブをクリックして溶液中の気泡を除去してください。チューブが溶液で満たされたらリザーバーバルブを閉じ、灌流チップに水を満たして灌流ペンシルにねじ込んで固定します。

気泡が混入しないように注意してください。チップを接続する際は、モデリングクレイを使用して灌流ペンシルをバスステージに固定し、灌流チップがバス内の空間にあることを確認してください。これで灌流システムのセットアップは完了です。

ここで、バスに脱イオン水を加えます。灌流チップが水に浸かっていることを確認してください。各灌流溶液が灌流チップから正しく出ているかを確認します。

廃棄物回収容器のチューブに接続された電磁弁を閉じ、灌流液いずれか一方のバルブを開きます。顕微鏡下で、灌流チップから噴出する灌流液のジェットを確認してください。その灌流液のバルブを閉じ、廃棄物回収容器のバルブを開きます。

還流ジェットはほぼ消失しているはずです。各還流溶液について同様のテストを繰り返します。すべての還流溶液が正しく流れていることを確認したら、バス内の脱イオン水を目的のバス溶液に交換してください。

次に、記録装置をセットアップします。パッチクランプのセッションを行う前に、銀記録電極を塩化銀で再コーティングする必要があります。まず、ピペットホルダーから電極線を外し、電極線の先端半分を、新鮮な漂白剤を入れたバイアルに15分以上浸してください。

これにより、電極線に塩化銀の層が析出します。電極線を脱イオン水で洗浄し、吸い取って乾燥させます。その後、塩化銀電極をピペットホルダーに再度取り付けます。

次に、コンピュータの電源を入れます。コンピュータのプリンターポートにハードウェアキーを接続してください。データ収集ソフトウェアであるHEA pulseを使用するには、ハードウェアキーが接続されている必要があります。

アンプの電源を入れ、データ収集ソフトウェアを起動します。HEAパルスを選択します。プロトコルファイルを読み込み、刺激スケールなどの構成設定を調整します。

構成設定を調整する目的は、テスト電位を指令電位と正確に一致させることです。これで、卵母細胞を準備する準備が整いました。インキュベーターから卵母細胞を取り出します。

卵母細胞をストリッピング溶液に5～10分間浸します。ストリッピング溶液によって卵膜が細胞膜から剥離し、卵膜を除去することが可能になります。5～10分後、卵母細胞から卵膜をそっと取り除きます。

2本のピンセットを使用します。divi OC部位は極めて脆弱であるため、移動は必要最小限にとどめてください。Devi卵母細胞が空気や気泡に触れないように注意しながら、十分な量の溶液を満たしたガラスピペットを用いて、卵母細胞をバスへ移します。

卵母細胞膜上のチャネルが露出し、パッチピペットを使用できる状態になりました。ガラスキャピラリーチューブをマイクロピペットプラーに挿入し、パッチピペットを作成します。顕微鏡下でピペットを観察し、チップの形状と開口径を確認してください。

記録中の容量性電流を低減させるため、開口径は2〜4 µmにする必要があります。また、チップを滑らかにするために、チップにワックスを塗布してから加熱してください。その後、顕微鏡下で研磨します。ピペットの先端をピペット溶液に浸し、プランジャーを引いてピペットチップを満たしてください。

これによりピペットの先端を湿らせます。次に、シリンジを用いてピペット溶液をピペットの3分の1まで満たします。その後、銀/塩化銀電極を挿入した状態で、ピペットをピペットホルダーに設置します。

ワイヤ電極がピペット溶液に接触していることを確認します。次のステップは、準備した卵母細胞からインサイドアウトパッチを切り出すことです。まず、顕微鏡下で卵母細胞の透明な端を探します。

マニピュレーターを使用して、パッチピペットを卵細胞の近くまで移動させ、溶液に浸かっていることを確認します。バス溶液中で、ピペットの直列抵抗を記録します。ピペット溶液を満たし、バス溶液に浸した状態でのパッチピペットの理想的な直列抵抗は、1から1.5 milli ohmsの間です。

次に、抵抗が約2倍になるまで、ピペットを卵母細胞にゆっくりと押し当てます。ピペットホルダーに接続された吸引チューブを用い、口で穏やかに吸引してギガオームシールを形成させます。ギガシールが形成されたことを確認後、-30 mVで数分間保持し、パッチを安定させます。

インサイドアウトパッチを得るには、ピペットをOO部位に素早く押し込み、その後ゆっくりと引き抜くことでパッチを切り出します。これで、インサイドアウトパッチのパッチクランプ準備が完了しました。インサイドアウトパッチを保持しているピペットを、灌流チップの開口部から約100 microns離れた位置まで移動させます。

廃液回収用の電子バルブを閉じ、目的の灌流液用のリザーバーバルブを開きます。パッチ上の電流の記録を開始します。必要に応じて、電圧および灌流液を変更してください。

記録が終了したら、詰まりを防ぐために脱イオン水を流して、プロフュージョンチューブのペンシルとチップを洗浄してください。ここで得られたパッチクランプ記録は、卵母細胞膜パッチ上の野生型BKチャネルが、電圧とカルシウムの両方に反応することを示しています。この図は、灌流液中のカルシウム濃度を名目上のゼロとしたパッチ記録を示しています。

電流波形の上にある矩形波は、パッチに印加された電圧を示しています。50 millivoltsから200 millivoltsまで、50 millivolts刻みの4つの電圧を印加しました。最大電圧の200 millivoltsにおいて、最大電流として約2 nano ampsが得られました。

電圧の上昇に伴い電流振幅が増大したことは、BKチャネルの開口確率が電圧に応じて上昇したことを示しています。この図は、インサイドアウトパッチに対する異なる電圧への応答を示しています。灌流液中に1 µMのカルシウムが存在する状態で、電圧ステップを印加しました。

前述の図と同様に、200 millivoltの電圧ステップに対する応答において、Perfu eightにカルシウムが含まれている場合は、カルシウムがない場合の2 nano ampsに対し、上の応答は約three nano ampsまで増加しました。これは、カルシウムの存在下でBKチャネルの開口確率が増加したことを示しています。要約すると、このパッチクランプ法により、BKチャネルが電圧およびカルシウム依存的であることが示されました。

このビデオを視聴することで、プロ燃料供給システムを組み合わせたパッチクランプ法を用いて、鉄チャネルの活性化を記録する方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。