Name: 定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: 学ぶ 免疫細胞化学を用いたシナプス数の定量法。前シナプスと後シナプスマーカーの共局在解析により、培養神経細胞や脳切片のシナプス形成を定量的に評価する手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ベンA.バレス（スタンフォード大学）の研究室で：涙点アナライザプラグインは、イメージのためにJはバリーウォーク（Physionコンサルティング現在のアドレス）によって書かれました。 資金調達; <ul><li>アルフレッドP.スローン財団</li><li>エスターA.とジョセフKlingensteinファンド投資法人</li><li>広範な生物医学研究財団</li><li>ハンチントン病のイニシアティブのために治す</li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

上記のシナプスのアッセイは、我々の実験の目標、ここで我々は文化を精製や脳のセクションのいずれかで、大きくRGCsの興奮性の予測に焦点を当てるのコンテキストに基づいています。私たちは、興奮性シナプスを（表1）のラベルにうまく参照テーブルのリストの抗体を提供している。 このシナプスのアッセイは、任意の神経集団または選択的なプリと後シナプスマーカーが存在する他のシナプスのサブタイプのシナプス数を定量化するために適応させることができます。例えば、アッセイは、ここで説明するシナプスは、適切な前と後シナプスマーカー10,11を使用することによりGABA - ergic（のようなグルタミン酸作動性とは対照的）シナプスを研究するために適用することができます。 このシナプスのアッセイは、ニューロン間のシナプス接続の変化を調べる実験室のための重要なツールです。それは電子顕微鏡や電気生理学で、このアッセイの結果を裏付けるために必要である一方、それにもかかわらず、シナプスを形成する神経細胞の能力を調節する分子手がかりに関する重要...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 抗原 </td><td> 種 </td><td> ポリクローナル/モノクローナル </td><td> ベンダ </td><td> カタログ番号 </td><td> 希釈 </td><td> 文化の作品 </td><td> セクションの作品 </td></tr><tr><td rowspan="10">シナプス前の</td><td>シナプシン</td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>シナプシン</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>ファゴット</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>アッセイデザイン</td><td> VAM - PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>ファゴット</td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>シナプトタグミン1 </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td>シナプトブレビン2 （C1.69.1） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td>シナプトフィジン （C1.7.2） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>ミリポア</td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td>モルモット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6">シナプス後の</td><td> PSD - 95 （6G6 - 1C9クローン） </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>親和性バイオ試薬</td><td> MA1 - 045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD - 95 </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td> ZYMED </td><td> 51から6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td>ホーマー</td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td>ホーマー</td><td>ラット</td><td>ポリクローナル</td><td>ミリポア</td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td>ウサギ</td><td>ポリクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td>マウス</td><td>モノクローナル</td><td>シナプスシステム</td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> 表1：我々は成功私たちのシナプスのアッセイで使用されていることを良いプリとシナプス後のマーカーのリストの例。これはすべての利用可能なマーカーの網羅的なリストではないことに注意してください。 Y =はい、N =いいえ、ND =データなし。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> ネコ。いいえ </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマ</td><td> P6407 </td></tr><tr><td>ラミニン</td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>ロシュダイアグノスティック徳国</td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ギブコ</td><td> 16210 </td></tr><tr><td> DAPIとVectaShield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> OCT </td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td></tr><tr><td>トリス-ベース（50 mM）を</td><td>フィッシャー</td><td> BP152 - 5 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L -リジン</td><td>シグマ</td><td> L - 1137 </td></tr><tr><td> 16パーセントPFAのソリューション</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15711 </td></tr><tr><td>粒状のPFA </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24ウェル培養プレート</td><td>ファルコン</td><td> 35から3047 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスアレクサ標識抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> --- </td></tr><tr><td> サプライ </td><td> 会社 </td><td> ネコ。いいえ </td></tr><tr><td> 12mmの0号ガラスのカバースリップ</td><td>カールヘクト徳国</td><td> 1105209 </td></tr><tr><td>第1.5ガラスカバースリップ（スライス用） </td><td> VWRサイエンティフィック</td><td> 48393241 </td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td> VWRサイエンティフィック</td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

神経科学における最も重要な目標の1つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子の合図を理解することです。このように、それはシナプス接続の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発するために必要不可欠になっています。サンプルの固定から始まる、このプロトコルの詳細については、どのように解離神経細胞培養中および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。これらcolocalizationsの数は、ImageJの解析ソフトウェアのプラットフォームの下涙点アナライザ（リクエストも承りますバリーウォーク、、c.eroglu @ cellbio.duke.eduによって書かれた）プラグインを使用して定量される。このプロトコルで説明されているシナプスのアッセイは、選択前と後シナプスマーカーを持っている任意の神経組織や文化を準備するために適用することができます。このシナプスのアッセイは、広くシナプス開発の研究に利用することができる貴重なツールです。

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。

神経科学における最も重要な目標の一つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子的手がかりを解明することである。そのため、……

神経科学における最も重要な目標の一つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子的な手がかりを理解することです。そのため、シナプス接続の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発することが不可欠となっています。さまざまな実験的な調製試料においてシナプス数を定量化するために、培養ニューロンまたは脳組織の凍結切片試料に、選択的なシナプス前および後マーカーで染色を行い、ニューロン間のシナプス接点に標識を付けます。その後、細胞または組織を蛍光顕微鏡で観察し、2つの免疫組織化学的マーカーに対応する各チャネルについて、8ビット画像を撮影します。画像は、puncta analyzerを備えたImageJ 1.29を用いて解析します。プレシナプスマーカーとポストシナプスマーカーの共局在の程度を決定するために、共局在点を用いて、調製物内に存在するシナプスの数を算出します。電子顕微鏡などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、シナプスアッセイによってシナプス数の分析と定量化をはるかに高いスループットで行えることです。本手法の主な意義は、アルツハイマー病、てんかん、自閉症などの臨床疾患の診断および治療に及びます。これらの疾患では、異常なシナプス結合が潜在的な病理の基礎として関与していると考えられています。本手法を利用することで、影響を受けたニューロン同士がシナプスを形成する能力の欠損を減少または改善させる介入方法を特定することが可能です。この手法は脳の発達を研究するのに有用ですが、細胞間の接点におけるそれぞれの対向面を選択的に標識できるのであれば、関心のある他のモデル生物や器官系における細胞間接点の数の研究や定量化にも適用可能です。P5〜P7のラットから採取し精製したラット網膜神経節細胞を、ポリリジンでコーティングしたガラスカバースリップ上に播種して神経細胞培養を調製します。24ウェルプレート内で、細胞をトランスフェクション前の3〜5日間、37 °Cで培養します。トランスフェクション後、播種した細胞が十分に成熟し、シナプスが形成されるまで、さらに7〜8日間細胞をインキュベートします。ウェルから培養液を除去し、あらかじめ温めておいた4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに500 microliters加え、室温で7分間固定します。固定後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を3回洗浄します。ウェル内の細胞を絶対に乾燥させないようにすることが重要です。ウェルからバッファーを除去した後は、速やかに次のバッファーに置換してください。50%正常ヤギ血清と0.2%Triton X 100を含むブロッキングバッファーを調製します。各ウェルからPBSを除去した後、ブロッキングバッファーを200 µLずつ加え、室温で30分間ブロッキングします。ブロッキングバッファーを除去し、PBSで3回洗浄します

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する...

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

このビデオは、免疫学的シナプストポロジーの生細胞イメージングを実演し、Tリンパ球と蛍光抗原を運ぶ上皮細胞との間の相互作用を調査しています。蛍光顕微鏡法では、内皮細胞に赤い細胞質の変位と黄色の膜輪が見られ、免疫学的シナプスの形成が示唆されています。...

生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

このビデオでは、特定のシナプス前タンパク質の分布を定量化するためのマウス脳切片の免疫蛍光染色を実演しています。このプロセスでは、非特異的な部位をブロックし、標的タンパク質と参照マーカーに一次抗体を適用し、続いて二次抗体の標識と核対比染色を行います。リファレンスマーカーは、一貫したベースラインを提供することで正確な定量を保証し、シナプス前タンパク質の分布は共焦点顕微鏡を使用して脳領域全体で分析されます。...

免疫蛍光法を用いたマウス脳におけるシナプス前タンパク質の分布の定量化

出典:McLeod, F., et al.海馬のげっ歯類の脳スライスにおけるシナプス密度の評価。J. Vis. Exp.

免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry...

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。...

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。...

ヒト免疫シナプスのイメージング

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。...

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

ここでは、フローサイトメトリーを使用してvGLUT1陽性シナプスとpHRodo...

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

学ぶ 免疫細胞化学を用いたシナプス数の定量法。前シナプスと後シナプスマーカーの共局在解析により、培養神経細胞や脳切片のシナプス形成を定量的に評価する手法を習得できます。

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

さらに動画を探す