定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

神経科学における最も重要な目標の1つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子的な手がかりを理解することです。そのため、シナプス結合性の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発することが不可欠になっています。さまざまな実験調製物中のシナプス数を定量化するために、培養ニューロンまたはクライオ切片脳組織調製物を選択的なシナプス前および後シナプスマーカーで染色して、ニューロン間のシナプス接触点を標識します。

次に、細胞または組織を蛍光顕微鏡で画像化し、2つの免疫組織化学マーカーに対応する各チャネルに必要な8ビット画像を作成します。画像は、画像J 1.29とpunctaアナライザーを使用して分析されます。シナプス前とシナプス後の間の共局在の程度を決定するために、共局在の点を使用して、調製物中に存在するシナプスの数を決定することができます。

電子顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合の本手法の主な利点は、シナプスアッセイにより、シナプス数の解析と定量化がはるかに高スループットになることです。この技術の主な意味は、アルツハイマー病、てんかん、自閉症などの臨床障害の診断と治療にまで及び、異常とシナプス結合が根本的な病理の基礎として関与しています。この手法は、影響を受けたニューロンが互いにシナプスを形成する能力に見られる欠陥を軽減または改善できる介入の形態を特定するために利用できます。

この方法は脳の発達の研究に役立ちますが、細胞間接触の数を研究したり定量化したりすることに関心のある他のモデル生物や臓器系にも適用でき、すべての接触部位の対立する各面を選択的にラベル付けすることができます。ラット網膜から精製されたラット網膜神経節細胞を、ポリデリシンでコーティングしたガラスカバースリップ上にP 5〜7匹の動物から採取したラット網膜神経節細胞をプレーティングすることにより、神経細胞培養物を調製します。24ウェルプレートでは、トランスフェクションの3〜5日前に細胞を摂氏37度で増殖させます。

トランスフェクション後、播種した細胞が十分に成熟したときにシナプスが発達するまで、細胞をさらに7〜8日間インキュベートします。ウェルから培地を取り出し、500マイクロリットルの予温済み、4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに7分間固定します。固定後、室温で、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回すすぎます。

細胞がウェルで乾燥しないようにすることが重要です。バッファーをウェルから取り除いたら、すぐに次のバッファーに交換する必要があります。50%正常ヤギ血清と0.2%Triton X 100を含むブロッキングバッファーを調製します。

それぞれからPBSを除去した後、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファーをウェルに加え、30分間ブロッキングします。室温でブロッキングバッファーを取り出し、3回すすぎます。PBSを使用して、選択したシナプス前後の抗体ペアを含む90%抗体バッファー(10%NGS溶液)で一次抗体希釈液を調製します。

ここでは、ウサギの抗シナプシン、シナプス前マーカー、マウスの抗ホーマーです。シナプス後マーカーは、遠心分離機、ベンチトップ遠心分離機で一次抗体を最高速度で5分間希釈して沈殿した抗体を除去し、それぞれに200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。プレートを加湿容器にしっかりと入れて、一次溶液の乾燥を防ぎます。

一次抗体とのインキュベーション後、摂氏4度で一晩インキュベートします。それぞれを3回よくすすいでください。PBSでは、200マイクロリットルの適切な二次抗体を添加し、調製した10%NGSを含む抗体緩衝液で1〜1000に希釈します。

前回と同様に、ディッシュを加湿チャンバーに入れ、二次物とのインキュベーション後、暗所で室温で2時間インキュベートします。PBSで各ウェルを3〜4回すすぎます。スライドガラス上にDPI入りのベクトルシールド封入剤を一滴垂らします。

次に、セルが入ったカバーガラスをドロップに反転させて取り付けます。最後に、カバースリップの端に透明なマニキュアを塗ります。塗布中にカバースリップを動かしたり動かしたりしないように注意してください。

これにより細胞が共有されるため、スライドを乾燥した暗い場所で少なくとも30分間乾燥させます。ここでは、適切なフィルターセットと63倍の油浸対物レンズを備えたzes axioイメージャー蛍光顕微鏡を使用してイメージングを行います。トランスフェクションされていない細胞を含むスライドを顕微鏡ステージに置きます。

DPI フィルター セットを使用して細胞核を視覚化し、最も近い隣接細胞から少なくとも 2 細胞直径離れている細胞を選択します。このステップでDPIを使用すると、バイアスを回避し、細胞選択のランダム性を確保するのに役立ちます。選択した各セルについて、適切なフィルター セット (この場合は GFP と Texas Red) を使用して 8 ビット イメージを取得します。

重ね合わせた疑似カラー画像は、シナプス前マーカーとシナプス後マーカーをそれぞれ赤と緑で表示する必要があります。次に、トランスフェクションされた細胞を含むスライドを顕微鏡ステージに置きます。ここでは、細胞にTDトマト発現ベクターをトランスフェクションしています。

このマーカーを使用して、以前と同様にセルを選択します。選択した各セルについて、適切なフィルターセット(この場合はGFP、Texas Red、Sci five)を使用して8つのピット画像を取得します。重ね合わせた疑似カラー画像には、赤、緑、青のシナプス後マーカーが必要です。

ここでは、穿刺分析プログラムを使用して、共局在性シナプス穿刺の定量化を行います。PunctaアナライザープラグインはBarry Walkによって書かれ、リクエストに応じて画像J 1.26で利用できます。収集した画像の1つを開きます。

円形選択ツールを使用して、対象のSORの周囲に半径半径約1セルの領域を選択します。関心のある領域を選択した状態で、プラグインメニューに移動し、赤チャンネル緑チャンネルを選択と表示される分析オプションウィンドウでパンクチャアナライザーを選択します。最初に背景を減算し、結果ファイルを設定します。

[OK]をクリックします。次に、結果を保存する場所を定義します。これらの結果は、表示されるウィンドウでさらに分析するためにExcelにエクスポートできます。

次に、ローリングボールの半径50が選択されていることを確認し、白い背景オプションのチェックを外します。この変更は必須ではありませんが、多くの場合、アプリケーションのユーザーに好まれます。視覚化を容易にするために、[OK] をクリックします。

新しいウィンドウが、赤チャンネルの画像に対応するマスクの横に表示されます。赤いマスクができるだけ多くの目立たない個々の穿刺に対応するまで、しきい値を調整します。ノイズが多すぎないように、[完了]をクリックします。

最小句読点サイズを 4 ピクセルに設定します。それ以外のものは変更しないでください。[OK]をクリックします。

今度は緑のチャネルに対して前の手順を繰り返します。これを緑のチャンネルで繰り返した後、プラグインは各チャンネルのpunctaに対応する定量化と、2つのチャンネル間の共局在punctaを提供します。ここに示すシナプスアッセイは、脳のクライオ切片や、脊髄や網膜などの他の神経系組織に適用できます。

適切なシナプス前およびシナプス後マーカーのペアがある場合。まず、放血とPBSによる大量投与によって安楽死させたマウスから脳組織を採取します。翌日、脳全体を摂氏4度のPBS中の4%パラアルデヒドに一晩置きます。

PBSで脳を3回すすぎます。クライオは、脳を30%スクロースに入れることで脳を保護します。PBSで。

組織は最初に浮き、組織が底に沈むまで摂氏4度に保ちます。その段階で、クライオプロテクションは完了です。次に、20%スクロースをOCTおよびPBSに2対1の溶液で、切片化のために目的の向きでブレインニンを埋め込みます。

たとえば、矢状または冠状です。次に、ドライアイスのバケツの上に平らな金属面を置きます。埋め込まれた脳をその上に置き、凍結したら凍結し、脳をフリーザーバッグに移し、摂氏マイナス80度で最大1年間置いてから切片化します。

クライオスタットクライオを使用して、組織を12〜16ミクロンのセクションに切片化し、スライドガラスに取り付けます。次に、スライドを摂氏37度のオーブンに入れて乾かします。次に、PBSで3回すすぎ、残留OCTを取り除きます。

パラフィンペンを使用してスライドの周囲に疎水性バリアを作成し、ブロッキングバッファーをスライドに追加して、パラフィン境界によってスライドから流れ出るのを防ぎます。スライドをPBS中の20%正常ヤギ血清に室温で1時間置き、次の場所をブロックします。.一次抗体の切片をPBSで0.3%トリトンおよび10%正常ヤギ血清で希釈しました。

ここでは、ウサギのアンチイット、PSD 95はグルタミン酸作動性のシナプス後コンパートメントを標識するために使用され、モルモットの抗vグル2はグルタミン酸作動性シナプス前終末を標識するために使用されます。スライドを摂氏4度に置き、インキュベーション後36〜60時間インキュベートします。スライドをPBSに3回、それぞれ15分間浸漬して、一次抗体を洗い流します。

この手順の後、スライドを直接光から保護してください。0.3%トリトンおよび10%正常ヤギ血清を含むPBSで1〜200に希釈した二次抗体を塗布します。こちらは、ヤギのアンチモルモット。

アレクサ4 8 8とヤギのアンチウサギ。Alexa 5 9 4を使用しています。暗所で室温で2時間インキュベートします。

スライドをPBSに4回、それぞれ15分間浸して洗浄し、取り付けます。ベクターシールド封入剤を少量ずつ加え、スライドをカバースリップで覆います。マニキュアを塗って、カバースリップの動きを抑制します。

組織切片のイメージングは、各切片の画像に対して63倍の油浸対物レンズを使用し、合計5ミクロンの深さで0.33ミクロン間隔で連続光学切片を合計15の光学切片に対して、適切なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して実行する必要があります。各動物の少なくとも3つの切片を画像化し、特定の実験条件から少なくとも3匹の動物を含める必要があります。3 つの連続するセクションのグループから最大強度の投影を生成し、それぞれ 1 ミクロンの深さを表す 5 つの投影を生成します。

これらは、アストロサイトの非存在下で形成されるシナプスの数を決定するために、ROIを修正したRG Csについて説明したように、画像Jを使用して定量化されます。免疫化学は、予想通り赤で示されているファゴットおよび緑で示されているホーマーに対する抗体を使用して、基礎増殖培地で処理された解離rgcに対して行われました。アストロサイト分泌分子がin vitroで形成されたシナプスの数に及ぼす影響を決定するために観察されたシナプスの共局在点はほとんど観察されず、解離したRGCをマウスアストロサイト馴染培地で3日ごとに処理し、染色後合計12日間にわたって行いました。

このニューロンには多数のシナプスが明らかでしたが、すぐに赤で示されます。ホーマーは、細胞質Lee発現TDトマトをトランスフェクトした緑色の解離RDCに示され、基礎成長のみで処理されました。中程度のシナプスは見られません。

TDトマトは青で、シナプスは赤で見られます。緑色で示されているシナプス後マーカーのホーマーには、ほとんど信号が見られません。同じ細胞をラットアストロサイト馴化培地で慢性的に処理すると、多くのシナプスが見られます。

TDトマトは青、シナプシンは赤、ホーマーは緑です。精製されたRGCは、アストロサイト馴化培地で処理され、赤およびシナプス後のホーマーグリーンマーカーでシナプス前について染色されたことが示されています。パンクチャクチャーアナライザーを使用して生成された閾値マスクは、存在する2つのチャネルに対応します。共局在のポイントを特定すると、Punctaアナライザーはこれらのポイントのグラフィカル表現を出力します。

数値出力は、puncta アナライザーによって提供され、両方のチャネルと共局在のポイントで識別された離散puncta の数を示します。このニューロンの解析によって得られたデータは、アストロサイト分泌分子がシナプスの形成を促進する能力を示しており、シナプス前およびシナプス後の免疫組織化学的標識の共局在を定量化して、重要なアストロサイト分泌シナプス原性分子トロンボスポンのニューロン受容体の過剰発現によるアストロサイト誘導シナプス形成の増強を実証したシナプスアッセイとして示されています。この図に示されているのは、基礎増殖培地、gm、またはアストロサイトコンディショニング培地で慢性的に治療されたニューロンあたりの平均シナプス数です。

A-C-M-A-C-Mは、空のベクターを過剰に発現する細胞と比較して、血栓スポン受容体を発現するよりも網膜神経節細胞のシナプス形成をより強く促進します。マウスのシナプス密度を定量化するために、シナプス前およびシナプス後コンパートメントをコンパートメント特異的免疫組織化学マーカーを使用して別々に標識しました。ここに示すように、生後7日目からP14にかけてシナプス数が増加しました。

これは、この発達時間枠における上尺骨のシナプス数の増加を示しています。一度習得すると、このプロトコルは、解離したニューロン培養の場合は約2日で完了し、この手順に続く動物からの採取から脳切片の場合は約5日で完了することができます。電気生理学や電子顕微鏡などの他の方法を利用して、シナプス数の変化が機能的シナプスと超構造的に正常なシナプスの両方の変化を反映していることを確認できます。

このビデオを見た後、シナプス数を定量化するために、免疫組織化学を実験調製にどのように適用するかについて十分に理解しているはずです。このプロトコールでは、コンパートメント特異的抗体を使用して、シナプス前およびシナプス後のコンパートメントを選択的に標識する方法を詳しく説明しています。これに関連して、シナプスは、これらのマーカーのそれぞれから得られるシグナル間の共局在の点として定義します。