定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

神経科学における最も重要な目標の一つは、シナプス形成の初期段階を制御する分子的な手がかりを理解することです。そのため、シナプス接続性の変化を定量化するための客観的なアプローチの開発が不可欠となっています。さまざまな実験標本においてシナプス数を定量化するために、培養ニューロンや脳組織の凍結切片標本を、選択的なシナプス前およびシナプス後マーカーで染色し、ニューロン間のシナプス接触点を標識します。

その後、細胞または組織を蛍光顕微鏡で撮像し、2つの免疫組織化学マーカーに対応する各チャネルについて8ビット画像を取得します。画像は、puncta analyzerを用いたImage J 1.29で解析します。シナプス前マーカーとシナプス後マーカーの共局在の程度を決定するために、共局在点を用いて、調製物中に存在するシナプス数を決定することができます。

電子顕微鏡などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、シナプスアッセイによってシナプス数の解析および定量化をはるかに高いスループットで実施できる点にあります。本手法の主な意義は、アルツハイマー病、てんかん、自閉症などの臨床疾患の診断および治療にまで及びます。これらの疾患では、異常なシナプス結合が基礎的な病理として関与していると考えられています。本手法を用いることで、影響を受けたニューロン同士のシナプス形成能に見られる欠損を減少または改善させることができる介入方法を特定することが可能になります。

この手法は脳の発達の研究に有用ですが、細胞同士の接触部位の対面する各面を選択的に標識できるのであれば、他のモデル生物や関心のある器官系における細胞間接触数の研究や定量化にも適用可能です。P5〜7のラットから採取したラット網膜から精製した網膜神経節細胞を、ポリリシンでコーティングしたガラスカバースリップに播種して神経細胞培養液を調製します。24ウェルプレートを用い、トランスフェクション前に細胞を37 °Cで3〜5日間培養します。

トランスフェクション後、播種した細胞が十分に成熟し、シナプスが形成されるまで、さらに7〜8日間細胞をインキュベートします。ウェルから培地を除去し、あらかじめ温めておいた4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに500 µLずつ加え、7分間固定します。固定後、室温でリン酸緩衝生理食塩水を用いて細胞を3回洗浄します。

ウェル内の細胞を絶対に乾燥させないようにすることが重要です。ウェルからバッファーを除去した後は、速やかに次のバッファーに置換してください。50%正常ヤギ血清および0.2%Triton X 100を含むブロッキングバッファーを調製します。

各ウェルからPBSを除去した後、ブロッキングバッファーを200 µLずつ加え、30分間ブロッキングを行います。室温でブロッキングバッファーを除去し、3つに分けて洗浄します。PBSを用いて、選択したシナプス前およびシナプス後抗体ペアを含む、90%抗体バッファーおよび10%NGS溶液で一次抗体希釈液を調製します。

ここでは、シナプス前マーカーであるウサギ抗synapsin抗体と、シナプス後マーカーであるマウス抗homer抗体を使用します。一次抗体希釈液をベンチトップ遠心機で最大速度で5分間遠心分離し、沈殿した抗体を除去した後、各ウェルに一次抗体溶液を200 µLずつ加えます。一次溶液の乾燥を防ぐため、プレートを加湿容器に入れます。

一次抗体によるインキュベーション後、4°Cで一晩インキュベートします。各ウェルを3回洗浄します。調製済みの10%NGSを含む抗体バッファーで1:1000に希釈した適切な二次抗体200 µLをPBSで添加します。

前述と同様に、二次抗体によるインキュベーション後、ディッシュを加湿チャンバーに入れ、室温・暗所で2時間インキュベートします。各ウェルをPBSで3〜4回洗浄します。ガラススライド上に、DPI含有Vector Shield封入剤を1滴滴下します。

次に、細胞が付着したカバーガラスを滴の上に反転させて載せ、封入します。最後に、カバーガラスの縁に透明なマニキュアを塗布します。この際、カバーガラスを押し出したり動かしたりしないよう注意してください。

これにより細胞が剥がれる可能性があるため、スライドを乾燥した暗所で少なくとも30分間乾燥させます。ここでは、適切なフィルターセットと63倍の油浸対物レンズを備えたZEISS Axio Imager蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行います。非導入細胞を含むスライドを顕微鏡ステージに載せます。

DPIフィルターを用いて細胞核を可視化し、最も近い隣接細胞から少なくとも細胞2個分の直径分だけ離れている細胞を選択します。このステップでDPIを使用することで、バイアスを避け、細胞選択のランダム性を確保できます。選択した各細胞について、適切なフィルターセット（この場合はGFPおよびTexas Red）を用いて8ビット画像を取得します。

重ね合わせた擬似カラー画像では、シナプス前および後のマーカーがそれぞれ赤色と緑色で示されるはずです。次に、形質導入した細胞を含むスライドを顕微鏡ステージに設置します。ここでは、細胞にTD tomato発現ベクターを形質導入しています。

これまでと同様に、このマーカーを使用して細胞を選択します。選択した各細胞について、本ケースではGFP、Texas Red、およびSci fiveの適切なフィルターセットを用いて、8枚のピット画像を取得します。重ね合わせた擬似カラー画像では、ポストシナプスマーカーが赤、緑、青で表示される必要があります。

ここでは、共局在するシナプスパンクチャの定量化にパンクチャ解析プログラムを使用します。Puncta analyzerプラグインはBarry Walkによって作成されたもので、ImageJ 1.26でリクエストに応じて利用可能です。収集した画像の一つを開きます。

円形選択ツールを使用して、目的のSORの周囲に放射状に細胞1個分程度の直径の領域を選択します。関心領域を選択した状態で、「plugins」メニューに移動し、「puncture analyzer」を選択します。表示された解析オプションウィンドウで、「Red Channel」および「Green Channel」を選択します。最初に背景減算（subtract background）を行い、結果ファイルを設定します。

「OK」をクリックします。次に、結果を保存する場所を指定してください。表示されたウィンドウから、これらの結果をExcelにエクスポートしてさらに解析することができます。

次に、ローリングボール半径に50が選択されていることを確認し、「白い背景」オプションのチェックを外します。この変更は必須ではありませんが、本アプリケーションのユーザーに好まれることが多い設定です。可視化を容易にするため、「OK」をクリックします。

レッドチャンネル画像に対応するマスクとともに、新しいウィンドウが表示されます。個々の独立した穿刺部位の多くが可能な限り正確にマスクされるまで、しきい値を調整してください。ノイズを導入しすぎないように注意して、「完了」をクリックします。

最小パンクチュエーションサイズを4ピクセルに設定します。それ以外の箇所は変更しないでください。「OK」をクリックします。

同様の手順を、今度はグリーンチャンネルに対して繰り返します。グリーンチャンネルでの操作を完了すると、プラグインにより、各チャンネル個別の点状構造（puncta）および2つのチャンネル間で共局在している点状構造の定量化が行われます。ここで示したシナプスアッセイは、脳の凍結切片や、脊髄、網膜などのその他の神経系組織に適用可能です。

適切なシナプス前およびシナプス後マーカーのペアがあることが前提となります。まず、放血およびPBSによる灌流で安楽死させたマウスから脳組織を採取します。脳全体をPBSで調製した4%パラアルデヒドに浸し、4 °Cで一晩固定します。

脳をPBSで3回洗浄します。PBSで調製した30% sucroseに浸し、脳を凍結保護します。

組織は最初は浮きますが、底に沈むまで4 °Cで保持します。この段階で、凍結保護が完了します。次に、20% sucrose、OCT、およびPBSを2:1の比率で混合した溶液を用いて、切片作成に適した方向で脳を包埋します。

例えば、矢状面または冠状面です。次に、ドライアイスを入れたバケツの上に平らな金属面を置きます。そこに埋没させた脳を置き、凍結させます。凍結後、脳をフリーザーバッグに移し、切片作成まで最大1年間、-80 °Cで保存します。

クライオスタットを用いて組織を12〜16 µmの厚さで凍結切片し、ガラススライドに貼り付けます。次に、スライドを37 °Cのオーブンに入れて乾燥させます。その後、PBSで3回洗浄し、残留したOCTを除去します。

パラフィンペンを用いてスライド上の周囲に疎水性バリアを作成し、ブロッキングバッファーを滴下します。パラフィンの境界により、バッファーがスライド外へ流出するのを防ぎます。スライドをPBSで希釈した20%正常ヤギ血清に浸し、室温で1時間置いてブロッキングを行います。次に、0.3% Tritonおよび10%正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した一次抗体で切片を処理します。

ここでは、グルタミン酸作動性後シナプス領域を標識するためにウサギ抗PSD 95抗体を、グルタミン酸作動性前シナプス終末を標識するためにモルモット抗vGlu2抗体を使用します。スライドを4°Cに置き、36～60時間インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBSに15分間ずつ3回浸し、一次抗体を洗浄します。

このステップの後、スライドを直射日光から保護してください。0.3% Tritonおよび10%正常ヤギ血清を含むPBSで1:200に希釈した二次抗体を適用します。ここでは、ヤギ抗ギニアピッグ抗体を使用します。

Alexa 488およびgoat anti rabbit Alexa 594を使用します。室温の暗所で2時間インキュベートします。

スライドをPBSに15分間ずつ4回浸して洗浄し、封入準備をします。dappyを用いてVector Shield封入剤を少量滴下し、カバーガラスでスライドを覆います。カバーガラスのズレを防ぐため、ネイルポリッシュを塗布します。

組織切片のイメージングは、適切なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を用い、各切片画像に対して63倍の油浸対物レンズを使用して行う。合計5 µmの深さにわたって0.33 µm間隔で連続的な光学切片を作成し、計15枚の光学切片を取得する。各個体から少なくとも3枚の切片をイメージングし、特定の実験条件につき少なくとも3個体を含める必要がある。連続する3枚の切片のグループから最大強度投影画像を作成し、それぞれ1 µmの深さを表す5枚の投影画像を得る。

これらは、アストロサイト不在下で形成されるシナプス数を決定するため、RG Csで説明された方法に基づき、ROIを変更してImage Jを用いて定量化しました。免疫化学染色は、基礎増殖培地で処理した解離RG Csに対して行い、期待通り、赤色で示されるbassoonに対する抗体と、緑色で示されるhomerに対する抗体を用いました。シナプスの共局在点はほとんど観察されませんでした。in vitroで解離したRG Csにアストロサイト分泌分子がシナプス形成数に及ぼす影響を決定するため、染色後、計12日間にわたり3日ごとにマウスアストロサイト馴化培地で処理しました。

このニューロンには多数のシナプスが認められましたが、soonが赤色で示されています。Homerは緑色で示されています。細胞質Leeを発現するTD tomatoを導入した解離RDCを基底増殖培地のみで処理した場合、シナプスは見られませんでした。

TD tomatoが青色に、シナプスが赤色に示されています。緑色で示されているポストシナプスマーカーのhomerのシグナルはほとんど見られません。同じ細胞をラットアストロサイト調製培地で慢性的に処理すると、多くのシナプスが観察されます。

ここでは、TD tomatoを青色、synapsinを赤色、homerを緑色で示しています。アストロサイト馴化培地で処理し、プレシナプスの赤色マーカーおよびポストシナプスのhomer緑色マーカーで染色した精製RGCを示しています。Puncta analyzerを用いて生成された閾値マスクは、存在する2つのチャネルに対応しています。共局在点を確認すると、Puncta analyzerがこれらの点のグラフィカルな表現を出力します。

puncta analyzerによって、両方のチャネルで特定された個別のpunctaの数および共局在点の数を示す数値出力が提供されます。このニューロンの解析から得られたデータは、アストロサイト分泌分子がシナプス形成を促進する能力を例示しています。ここではシナプスアッセイとして、シナプス前およびシナプス後の免疫組織化学的標識の共局在を定量化し、重要なアストロサイト分泌シナプス形成分子であるthrombospondinのニューロン受容体を過剰発現させることで、アストロサイト誘導性のシナプス形成が増強されることを示しています。この図に示されているのは、基礎増殖培地（gm）またはアストロサイト条件培地で慢性的に処理したニューロン1個あたりの平均シナプス数です。

空ベクトルを過剰発現させた細胞と比較して、トロンボスポン受容体を過剰発現させた網膜神経節細胞では、A-C-M-A-C-Mがより強くシナプス形成を促進します。マウス上丘におけるシナプス密度を定量化するため、コンパートメント特異的な免疫組織化学マーカーを用いて、シナプス前および後コンパートメントを個別に標識しました。ここに示すように、生後7日からP 14にかけてシナプス数が増加しました。

これは、この発達期間における上丘のシナプス数の増加を示しています。このプロトコルを習得すれば、解離ニューロン培養の場合は約2日で、本手順に従って動物から採取した脳切片の場合は約5日で完了させることができます。シナプス数の変化が、それぞれ機能的なシナプスと超微形態的に正常なシナプスの両方の変化を反映していることを検証するために、電気生理学や電子顕微鏡などの他の手法が利用されます。

このビデオを視聴することで、シナプス数を定量化するために、実験試料に免疫組織化学をどのように適用すべきかについて十分に理解できるはずです。本プロトコルでは、コンパートメント特異的抗体を用いて、シナプス前および後コンパートメントを選択的に標識する方法について詳しく説明します。ここでは、これらの各マーカーから得られたシグナルの共局在点としてシナプスを定義します。