好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

この手順の全体的な目標は、木材の水分と外因性基質が厳密に制御されているペトリ皿の小宇宙で好気性木材分解菌を接種することです。これは、最初に既知のエディアの正確な量で小宇宙を準備することによって達成されます。次に、劣化する木材と外因性の固体基板を、基板間の接触を許さずに、農業表面のプラスチックグリッドの上に組み立てられます。

次に、小宇宙に試験菌を接種し、インキュベートします。インキュベーション後、ウッドブロックを収穫して質量損失を決定し、分析用の組織を準備します。最終的には、質量損失測定、菌糸体形態の観察、誘導結合プラズマ分光法などの標的元素分析を通じて、木材の生分解の程度と外因性元素源の役割を示す結果を得ることができます。

こんにちは、私の名前はブルック・ジェイコブソンで、ミネソタ大学のバイオプロダクツ・バイオシステム工学科のジョナサン・シリング博士の研究室に所属しています。今日は、好気性真菌による植物組織分解のための微小環境としてペトリ皿を使用する手順を示します。私たちの研究室では、この手順を使用して、真菌リグノセルロースの分解メカニズムを研究しています。

リグノセルロースは、リグニン、セルロース、ヘミセルロースからなる植物組織です。私たちが最も頻繁に研究する組織は、オーガーブロック設計の技術的側面が少ない木材の間違いであり、失敗の最も一般的な原因であり、オーガーブロックセットアップのビデオ公開を有用なものにする研究間の変動性の主要な原因です。私たちは経験から、この手順が高品質でばらつきの少ない結果をもたらすことを知っています。

それでは始めましょう。これらの実験では、一般的なペトリ皿よりも1cm深いシャーレを使用して、ウッドブロックの上のヘッドスペースを増やします。小宇宙で。

カルシウムと鉄分を含まないペトリ皿あたり20ミリリットルの十分なエディアを作ることから、小宇宙の準備を始めます。15グラムの寒天を、約400ミリリットルの脱イオン水を含む500ミリリットルのメスフラスコにタイプAし、サプリメントで修正します。事前に調製したストック溶液を使用して、混合物に微量栄養素を追加します。

栄養素が追加されたら、メスフラスコを500ミリリットルラインまで満たします。次に、メディアを1000ミリリットルのフラスコに移します。121°C、16PSIで20分間オートクレーブをかけます。

テストプレートを投与する前に農業が固まらないように、フラスコあたり500ミリリットルを超えないように注意してください。オートクレーブ後、結露を最小限に抑えるために、メディアを触って冷まします。これらの実験では、水分含有量またはmcと同様に、水分を最小限に抑えることが重要です。

80%を超えると、組織に無酸素症を引き起こします。好気性真菌による腐敗を抑え、ばらつきを一度増加させます。涼しい。携帯用ピペットエイドと10ミリリットルの滅菌ポリスチレンピペットを使用して無菌的に。

寒天をバイオセーフティキャビネット内のプレートの高いスタックに移します。次に、プレートの底の内側に収まるようにプラスチックメッシュグリッドをたっぷりとカットします。グリッドを切断し、石鹸と水で完全に洗浄した後、このデモンストレーションのために乾燥とオートクレーブ用のメッシュグリッドを準備します。

ミナミイエローパインまたはSYPは、重要な木材の供給源を表すため使用されています。米国の住宅では、未処理の木材を使用し、木目に沿って縦方向に1つのカットから19×19ミリメートルのノットフリーブロックをカットします。この長さを19ミリメートルの立方体のブロックに切ります。

のこぎりの代わりにノミとハンマーを使用して、19ミリメートルの立方体のブロックを穀物に沿って半分に分割します。これにより、アグリブロックの小宇宙のプラスチックメッシュ上で1つの粗いブロックエッジが下向きになり、ラベルを付けるための滑らかな上端になります。ブロックの滑らかなエッジに鉛筆でラベルを付け、処理を満たすのに十分なブロックをカットし、汚染モニターとして、またオーブン乾燥材料用に並行して調整されたベースラインデータサンプルとして機能する非接種コントロールをカットし、サンプルをアルミニウムホエイパンに入れ、摂氏100度の対流式オーブンに48時間

サンプルをオーブンから乾燥剤に移し、一度冷却します。涼しい。サンプルを事前に計量して、初期オーブン乾燥重量を決定します。最後に、プラスチックグリッドやオートクレーブ用の木材を含むサンプルを、濡れを最小限に抑えるためにホイルでしっかりと包んで調製します。

これには、各サンプルを個別にラップする必要はありませんが、蒸気への曝露が少なく、一貫している必要があります。標識されたサンプルを摂氏121度、16PSIで1時間オートクレーブします。滅菌バイオセーフティキャビネットで、空のAE、接種メッシュ植物基質の外因性材料のソースプレート、シャーピーパラフォームストリップ、鉗子、およびトランスファーツールを組み立てます。

接種の次のステップは、汚染リスクを最小限に抑えるために、アグリにアイテムを追加し、ペトリ皿を含めることです。火炎転写ツールと鉗子は、使用時に95%エタノールを使用しています。まず、プラスチックメッシュをシャーレに追加します。

次に、ここに木製の基材を追加します。メッシュの長さに沿って2つのウッドブロックが追加され、収穫の早い時期と遅い時期のデータをペアにすることができます。これらのブロックは、穀物と並べて、真菌接種の供給源の点に面して追加されます。

次に、外因性材料を追加します。ここは。石膏の役割は、糸状菌による腐敗についてテストされています。したがって、真菌は木材に到達する前にこれらの石膏ディスクに遭遇するはずです。

各ブロックとメッシュ上部の接種ポイントの間に1つの石膏ディスクが追加されます。ディスクを互いに近づけながら、木材内のディスクが接触しないように注意してください。真菌の接種物については、直径7ミリメートルの4番コルクボーアを使用して、20ミリリットルの寒天で栽培した2週間の培養物からプラグを作ります。

これにより、接種量の制御に役立ちます。接種されていないコントロールの場合は、滅菌プレートからプラグを追加するのが最善です。接種物と外因性基質または木材との間に接触させないでください、しかしそれらを互いに近づけて置

接種プラグはブロックごとに1つ使用してください。かみそりでカットされたパラムで皿を密封し、プレートを水平に保持し、滑らかな連続動作でパラムを包みます。最後に、耐アルコール性マーカーを使用して皿の蓋にラベルを付け、ブロック番号をそれぞれの基材に直接ラベル付けします。

また、石膏ディスクの上に円を描きます。プレートを生物学的インキュベーターに慎重に移して、内容物がぶつからないようにし、温度変動による結露を最小限に抑えます。ここで使用される条件は摂氏20度で、暗闇の中で最後の収穫を除いて無菌的に時系列の収穫を行います。

5週目の収穫ポイントで、処理ロット全体を削除します。各底面と上部に70%エタノールをスプレーし、炎状鉗子を使用してバイオセーフティキャビネット内の材料を取り除きます。アグリプレートを破壊する前に、モーフFやメロンに焦点を当てて写真を撮ります。

次に、処理するブロックを削除します。余分なphaを丸めますが、腐った材料オーブンを失わないように注意してください。アルミ製のフライパンのドライブブロックは、コントロールの新鮮で乾燥した重量を使用して質量損失を決定し、過度の吸湿発散を監視します。

質量損失データは、崩壊の進行を測定するのに役立ち、重要なデータです。元素濃度をグラム重量ベースで計算する場合は、パーセンテージデータを正規化する必要があります。統計情報については、明らかに水浸しになっている暗褐色のブロックにラベルを付けて追跡します。

最後に、オートクレーブ可能なバッグ内の培養物を破壊し、プラスチック支持メッシュやその他のコンポーネントを保存して、将来の実験で使用するためにリサイクルします。アグリブロックの小宇宙のセットアップを使用して、松の木のブロックをプラスチックメッシュの上に置いて、ブロックをアグリコンタクトの上に持ち上げます。サーキュラークレインズは、石膏の表面と直接接触して木のブロックに成長しました。

この菌糸体は、木材と外因性の栄養元素源との間の重要なつながりを表しています。寒天または固体材料でこれらの外因性材料源を制御することは、5週間および15週間後のsercrain'sによる木材の腐敗の程度の尺度として、土壌ブロック設計に対する農業ブロック設計の主要な重量損失です。ここでは、アグロブロックの小宇宙におけるマツとのインキュベーションを示しています。

治療はありませんでした。同じ文字の下の各収穫バーについて、純度99%を超える石膏または1%の鉄修正石膏を超える寒天に添加された5ミリモルの塩化カルシウムは、有意差はありません。エラーバーが標準偏差を表しているため、コントロールの茶色の腐った松のブロックでは60%以上の重量減少が観察され、これは米国材料試験協会の標準目標である50%を超える減衰を満たしています。

崩壊の平均変動係数は、16週で0.055でした。ばらつきが少ないことに加えて、治療効果が観察されました。真菌の腐敗は、寒天に塩化カルシウムとして、または純粋な石膏として、カルシウムを添加することで抑制されました。

興味深いことに、石膏に鉄を追加すると、崩壊率は回復します。カルシウムではなく鉄を示唆することは、崩壊の15週目に5回の反復を観察する上で重要です。同じ褐色腐敗病、試験菌、円形のラミンによって、菌糸体の色がmeinを明らかにします。

治療による外部菌糸の違いは、ブロックを取り除き、アップして乾燥させました。カルシウムフリー治療におけるmeinの欠如を明らかにします。純粋なカルシウム処理の黄変と鉄修正処理の錆びた外観。

コントロールは、比較のために接種されていないブロックを表します。興味深いことに、高鉄媒体を使用すると、メイン効果が失われます。まとめると、この真菌はカルシウムではなく鉄を利用していることを示唆しています。

これらの資料では、オーガーブロックセットアップを使用して、好気性糸状菌による植物組織の生分解を成功裏にテストする方法を示しました。この手順を実行するときは、基質が互いに接触しないように、特に植物組織とオーガーがオーガーと血小板からの水分含有量を最小限に抑え、インキュベーション前に各プレートの内容物がシフトしていないことを再確認することを覚えておくことが重要です。これらの変数を念頭に置くと、土壌ブロックのセットアップを使用する場合よりもはるかにうまく崩壊環境を制御できます。

研究課題に答えるために必要な統計的検出力でデータを生成することができます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。