Name: ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶPristionchus pacificusの培養とEMS・TMP/UVによる突然変異誘発法。遺伝子機能解析や表現型スクリーニングに活用できる実験技術を解説します。

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この作品は、NSFの助成IOB＃0615996によって資金を供給されています。

パート1：準備線虫の増殖培地（NGM）ペトリ皿このような線虫やPと実験線虫pacificusは通常、線虫の増殖培地（NGM）1を含む6センチメートルペトリプレート上で実験室で培養されています。ワームは、20 ° Cに保たれていますが、気温の範囲（° C 4との間の - 25℃）でインキュベートすることができる線虫の種および実験計画に応じて、。 NGMでプレートを準備するには、標準的な滅菌技術は、真菌や細菌汚染を防ぐために使用する必要があります。以下は、NGMプレートを準備するプロトコルです。 <ol><li> 15gの寒天、2.4グラムのNaCl、2gのトリプトン、および2.72グラムのKH 2 2 Lの三角フラスコ中のPO 4を量り、水で1 Lにボリュームを構成してオートクレーブし、60℃の水浴中を冷却することができます。 </li><li> 0.8ミリリットル1 M 塩化カルシウム、コレステロール（エタノール中の5 mg / ml）をそれぞれ、と1 M MgSO 4を追加。真菌や細菌汚染を防ぐために、1 mlのストレプトマイシン（100 mg / ml）をし、1ミリリットルナイスタチン（10 mg / mlのは）培地の各リットルに追加することができます。 </li><li> Unispenseのマシンを使用し、無菌状態を維持し、目的の板にメディアを注ぐ。プレートは完全な約2 / 3番目に記入してください。標準的な直径60mmのプレートは、メディアの約10mlが必要です。寒天が完全にgelifiedされるまで、プレートを移動したりしないでください、それ以外は困難な実体顕微鏡でワームを集中すること、寒天の表面に凹凸があるでしょう。 </li><li>いったん乾燥させ、プレートはすぐに播種または4℃で保存できます細菌でシードまでのC。 </li></ol>パート2：OP50細菌を準備し、NGMペトリ皿を播種 P. pacificusは、大腸菌 OP50株を食べることによって実験室で培養される。 OP50は、それによって、ワーム1の可視化を容易に薄い芝生を形成し、NGMプレート上の限られた成長を持っています。 OP50の文化を成長させるために、LB -ブロスを使用します。 <ol><li> 500 mlのスクリューキャップのボトルに、蒸留水とオートクレーブで500 mlにボリュームを構成する5グラムバクトトリプトン、2.5 gの酵母エキスと2.5グラムのNaClを追加。 </li><li>無菌条件下での培養プレートからOP50のシングルコロニーを液体培地に接種し、37℃で一晩成長させ℃に</li><li> LB - OP50は、使用する準備ができており、無菌性が維持されている場合、4℃で数ヶ月保存できます。プレートがシードされる必要がある場合は、必ず小さな滅菌ビーカーに培養液の少量を注ぎ、これは株式の文化の汚染を防ぐことができます。 </li><li>シードのプレートに、直径60mm NGMペトリ皿とそれを広めるために渦巻きにOP50の100から120μlを分注する。 </li><li>成長する芝生のため、室温で一晩これらのシードプレートをインキュベートする。これらの生成済のプレートは、現在、最大3週間までは4℃で保存することができます。倒立位置にそれらを保管すると急激な乾燥を防ぐのに役立ちます。 </li></ol>パート3：ピックを作るこのセクションでは、ワームのピックを作成する方法について説明します。ピックは、ある場所から別の場所にワームを転送するために使用されます。一部の研究者がわずかに異なる金属組成を好むかもしれませんがピックは、30ゲージ90％プラチナ10％イリジウムのワイヤーで作られています。 <ol><li>ワイヤーの3-4 cmのカット、場所は、パスツールピペット（その先端より小さい長さに切断された）の先端部、及び内部のそれの0.5 cmのブンゼンバーナーを介してガラスにそれを封印。ガラスから突出線の長さは約3〜3.5センチメートルですが、個々の好みに応じて変えることができます。 </li><li>ハンマーやペンチを使って出ているワイヤの端を平らに。その後、スクープを形成するために平坦化された部分を上に曲げる。 </li><li>ワームや寒天の損傷を防ぐために、サンドペーパーでピックのシャープなエッジを滑らかに。 </li></ol>パート4：ピッキングワーム<ol><li>ワームを選択するために、穿刺または損傷寒天表面​​に注意していないながら、厚い粘着性細菌との先端を炎に白金線を殺菌し、コートに細菌の芝生に沿ってピックアップの平坦化された先端をドラッグします。 </li><li>実体顕微鏡を使用して、非常に軽くワームはピックで細菌に付くまでピックアップされるワーム/ワームに対してスティッキー先端を磨きます。 </li><li>ワームは、ピックの先端にしたら、触れたり、新しいプレートの細菌の芝生に対してピックの先端をスライドさせて新しいプレートにすぐにそれを転送し、ワームがオフクロールする必要があります。ケアは、ワームは、それが難しいそれらを取得すること穴にクロールする他のプレートに寒天の表面を傷つけないように注意する必要があります。ワームが長すぎるためにピックしたままの場合、それは生気を奪うかもしれない。 </li></ol>第5部：EMS変異誘発エチルメタンスルホネート（EMS）は、ゲノム2での突然変異の広いスペクトルを誘導する。変異体は、産卵、筋肉の欠陥などの欠陥によって識別することができますの、性決定、dauer形成、行動、および生殖腺の形成。 EMS変異誘発のためのプロトコルは、Cに対して記載したものと同様です。 エレガンス 1。 <ol><li> 1N NaOHを500mlのを（またはそれ以上）を準備。 </li><li> 4-5取る、ワームの完全な直径6cmペトリ皿、サード幼虫幼若（J3）の段階で数百ワームを含む、プレート当たり滅菌M9 2〜3 ​​mlを使用してからワームを洗う。 </li><li>滅菌済み、使い捨て15 ml遠心チューブ内のすべてのワームを収集する。ワームは、ペレットを形成するまで5-7分のためのまたは1500 × gで遠心する。 </li><li>液体を吸引し、再度サスペンドワームにM9の2 mlを使用してください。 M9の2ミリリットルを含むチューブに20μlのEMSを追加し、それを溶かすために振る。その後、静かにワームのサスペンションと渦の2ミリリットルにこのEMSソリューションを追加します。 EMSの最終濃度は47 mMのようになります。注意：EMSが非常に強い変異原性物質であり、ドラフト内で処理する必要があります。この変異原物質と接触するすべての材料は（手袋、ピペ​​ット、チップ）は、非アクティブEMSに1N NaOHで処理されるべきである。全体のEMS突然変異誘発手順の間に二重手袋を着用してください。あなたの機関のガイドラインに従って有害廃棄物を処分する。 </li><li>遠心管を配置し、パラフィルムでキャップをカバーする、ドラフト内で水平に配置し、3.5時間インキュベートワームを聞かせ。チューブはまた、低速度のロッカー上に配置することができます。 </li><li>チューブを回して、パラフィルムでキャップをカバーする、ワームのシンクまでの垂直位置とインキュベートの場所。 </li><li>上清を吸引除去し、1N NaOHを含むビーカー/フラスコにそれを捨てる。これは、EMSを不活性化されます。 </li><li>ワームから5 mL M9を追加する、ワームのペレットを形成するまで5〜7分のためにまたは1500 × gでワーム、遠心分離機を洗浄するためにチューブを25から30回転倒。上清を吸引除去し、1NのNaOHのビーカーに捨てる。 </li><li>洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。 </li><li>最終洗浄後、M9の最小量（〜500μl）をでワームペレットを再サスペンドし、OP50細菌の芝生を含むNGMプレート上にそれらをピペット。この時点で、もはや化学のフード内で作業する必要はありません。 </li><li>数分間液体を乾燥させて、その後新鮮なシードのプレートにJ4幼虫を探して、健康を選択して転送する。あなたの機関の有害廃棄物のガイドラインにしたがって原版を破棄。 </li><li>突然変異ワームの自己受精させて。実体顕微鏡を使用して、関心の劣性突然変異体のF2世代の表現型をスクリーニングする。 </li></ol>パート6：ソラレン変異誘発このセクションでは、長波長紫外線（UV）と一緒にTMPを使用して突然変異誘発のための手順を説明します。変異誘発のTMP / UV法は、広くゲノム3内に欠失変異を誘発するために使用されます。 <ol><li>前の手順で説明した15 mlの遠心管に4-5、直径6cmペトリ皿からワームを収集する。 </li><li> 10ミリリットルM9を追加し、20回反転ワームを洗い、5分間1500 × gで遠心する。上清を捨て、3回の合計のために洗浄を繰り返します。 TMPの30μg/ mlを含むM9の約10倍の体積の液体と再サスペンドワームを吸引除去する。 M9の2mlにTMPのピペットを20μl（3 mg / ml）を。 EMSと同様に、TMPは強力な発がん性物質であり、適切な安全対策を取って処理する必要があります。適切な眼が身に着けている紫外光の潜在的な危険を防止するために使用する必要があります。使い捨ては、適切なバイオハザードバッグに廃棄する必要があります。 </li><li>低速のロッカー（40 UPM）に室温で15分間、暗所でチューブをインキュベートします。すべてのワームのシンクを聞かせ、10分間垂直に覆われた管を設定します。 </li><li>パスツールピペットでチューブの底からワームを削除し、シーディングされていないNGMプレートに移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、上清を捨てる。 </li><li>過剰なTMPが板に吸収されるまでは暗いところでプレートを保管してください。 </li><li>紫外線強度計を用いて、プレート上の強度は500μW/ cm 2と4であることを長波UV光源とそのようなプレート間の距離を設定します。アルミカバーと蓋を取り外し、50秒間長波長紫外線にTMP扱わワームを含むプレートをカバーし、公開します。 </li><li>室温で5時間、暗所でワームをカバーしておきます。 </li><li>ピックと新鮮なシードのプレートに健康なJ4幼虫を移す。あなたの機関の有害化学物質のガイドラインに従って、原版を破棄。 </li><li>実体顕微鏡を使用して、関心の突然変異のためにF2世代の表現型をスクリーニングする。 </li></ol>パート7：代表的な結果 P.のいくつか変異誘発（どちらかEMSまたはTMP / UVによる）に起因するpacificus変異体の表現型は図1に示されています。それぞれの変異体は野生型の動物から容易に区別できる特徴的な表現型を持っています。ワームからその変異で処理した、親世代（P0）から30 J3/J4幼虫は、別々のプレートに配置し、F1世代な卵を、レイアウトを許された。健康なF1子孫を示したプレートから、1000 F1Sの合計は、個々のプレートに移し、F2子孫は、表現型をスクリーニングした。みすぼらしい5,6、非協調6と変圧器7の表現型を有する動物が発見された。 <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。Pristionchus pacificus野生型および変異動物。 A.重量両性B.重量男性C. ほかの細胞系列変異体D. UNC変異体E. TRA変異体。残りのパネルで別の変異体と比較する野生型雌雄同体（左）とオス（右）の動物を示す上の2つのパネル。

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

変異導入は、様々な実験モデル生物で遺伝学的研究に広く使用される技術です。変異導入実験はしばしば遺伝子2の機能を識別するために使用されます。ここで説明する変異誘発の手順は、P.のためだけでなく、使用することができます。 pacificusだけでなく、Cの虫や他の関連線虫の種。ここでは二つの方法、EMSおよびTMP / UV変異導入を説明します。 EMSは、ゲノム3,8を通して点変異または小欠失を誘導する化学物質です。ソラレン変異誘発（TMP / UV）は、主に紫外光により誘導される可能性が破損のためにDNAの欠失変異を誘発する。削除の断片は長さ3の0.10〜15キロバイトの範囲にある。 我々は見つけることが比較的一般的な表現型をスクリーニング。 EMSを使って画面で、F2動物との各400プレートに、約1プレートはdpy、UNCまたはトラを持っていた。非対称分裂は、雄の表現型とXX核型<sup...

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

紫外線（TMP / UV）と組み合わせエチルメタンスルホネート（EMS）と4,5&#39;、8 - トリメチル：このプロトコルは、実験室で、どのように2つの代替方法を使用して突然変異を起こさせるために線虫を維持するために手順を説明します。線虫が原因の自己施肥雌雄同体と動物あたりの子孫の数百を生成することができる男性で構成される彼らのシンプルなボディプランと配偶システムの遺伝学研究のための強力な生物学的なシステムです。線虫は、細菌の芝生を含有する寒天プレートに保持され、簡単にプレートからピックを使用して別のに転送することができます。 TMP / UVは、主に欠失を誘導しながらEMSは、一般的に点突然変異と小さな欠失を誘導するために使用されるアルキル化剤です。使用されている線虫の種によっては、EMSとTMPの濃度は、最適化する必要があります。線虫Pristionchusのpacificusの劣性変異を分離するには、F2世代の動物が視覚的に表現型のスクリーニングを行った。これらのメソッドを説明するために、我々は、ワームの突然変異誘発し、非協調（UNC）、みすぼらしい（DPY）と変圧器（トラ）変異体を探した。

表現型欠陥の変異体のスクリーニングは、特定の生物学的プロセスで機能する遺伝子を同定するための簡単​​な方法です。この記事では、どのように文化の自由生活のワーム（例えば、への説明<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;）実験室で、二つの異なる突然変異誘発法、EMSおよびTMP / UVを示しています。

本プロトコールでは、研究室における線虫の維持管理手順、および2つの代替手法（エチルメタン……）を用いた変異導入の方法について解説します。

本手順の全体的な目的は、C. elegansやP. pacificusなどの線虫において変異体を作成するために一般的に用いられる2種類の異なる変異導入プロトコルを実施することです。変異導入は、遺伝子の機能を明らかにするための強力なツールとなります。まず、成虫になる直前の最終幼虫期にある線虫を大量に含む培養液を調製し、それを用いて変異導入を行います。次のステップは、エチルメタンスルホナート処理、または紫外線照射を併用したソア変異導入の2つの代替手順を用いて、線虫に変異を導入することです。手順の3番目のステップでは、健康そうに見える線虫を、餌となる細菌を新しく播種したNGMプレート（アガロースプレート）に移します。手順の最終ステップは、第1世代、第2世代、または第3世代において、目的の変異表現型をスクリーニングすることです。こんにちは。テキサス大学アーリントン校生物学部のDr.Andre Perez de Silvaの研究室のJoreです。TMPUVおよびEMS変異導入の手法は、発生過程で重要な役割を果たす生物学的プロセスにどの遺伝子が関与しているかなど、遺伝学研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。こんにちは、Manish Pharです。ここで実演する変異導入法はPristionchus pacificusを対象としていますが、線虫のCaenorhabditis elegansや、ゼブラフィッシュのような脊椎動物など、他の実験モデルにも非常に一般的に応用可能です。それでは始めていきましょう。線虫をある場所から別の場所へ移動させるために使用するピックは、30ゲージの白金90％、イリジウム10％の合金線で作られています。研究者によってはピックの作製にわずかに異なる金属組成を好む場合もありますが、ピックを保持するためにパスチャーピペットも使用します。まず、パステアピペットの伸長した先端を必要な長さに折ります。針金を約3〜4 cm切り取り、そのうち0.5 cmをパステアピペットの先端内部に入れます。ブンゼンバーナーを用いて、針金をガラス内に封入します。ガラスから突き出ているワイヤーの長さは約3〜3.5 cmですが、個人の好みに応じて調整可能です。突き出たワイヤーの先端をプライヤーで平らに潰します。次に、平らにした部分を上方に曲げてスクープ状に形成します。最後に、ワームやアガーを傷つけないよう、サンドペーパーでピックの鋭い端を滑らかにします。ワームをピックアップするには、ピックのワイヤーを火炎滅菌し、NGMPツリープレート上の細菌ローンに平らな先端を沿わせて引きずり、先端に粘性のある細菌を厚く塗布します。実体顕微鏡を用いて、アガロ表面を突き刺したり傷つけたりしないよう、非常に軽く操作してください。ピックの粘着面をワームに触れさせ、ワームがピック上の細菌に付着するまで操作します。ワームがピックの先端に付着したら、すぐに新しいプレートの細菌層に触れるか、または先端を滑らせるようにして移動させます。この際、プレートのアガー表面を傷つけないよう注意してください。表面に穴が開くと、ワームがその中に潜り込み、回収が困難になる場合があります。ピックの先端を細菌のローンに触れさせるか、あるいは滑らせることで、虫をピックから離脱させます。虫を長時間ピックに乗せたままにすると乾燥する可能性があるため、注意してください。ここでは、L3段階にある直径6cmのペトリ皿4〜5枚に分注したprisca pacificusを用いて、EMS変異導入を実演します。各プレートにつき2〜3 mLの滅菌M9バッファーを用いて、プレート上の線虫を洗い流します。線虫の数は数百匹になるはずです。回収した線虫を滅菌済みの使い捨て15 mL遠心チューブに集めます。1500 Gsで5〜7分間、または線虫がペレットを形成するまで遠心分離します。上清を吸引し、二重手袋を着用してドラフト内で作業しながら、2 mLのM9バッファーを用いて線虫を再懸濁します。2 mLのM9バッファーを含むチューブに20 µLのEMSを加え、振盪して溶解させます。その後、これを2 mLの線虫懸濁液に加え、静かに回転させて混ぜ合わせます。EMSの最終濃度は47 millimolarになります。パラフィルムで密閉した遠心チューブをドラフト内の低速ロッカースタッカーに設置し、線虫を3時間半インキュベートします。3時間半のインキュベーション後、チューブを垂直に立てて、線虫が沈下するまで放置します。次に、上清を吸引し、上清中のEMSを不活性化するため、1 Nの水酸化ナトリウム溶液を入れたビーカーに廃棄します。ドラフトチャンバーから手を出すたびに、必ず1 N水酸化ナトリウム溶液で手をすすいでください。EMSを不活化させるため、線虫にM9バッファーを5 mL加えます。チューブを25〜30回転倒混和して線虫を洗浄し、1500 ×gで5〜7分間、または線虫がペレット状に固まるまで遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、1 N水酸化ナトリウム溶液のビーカーに廃棄してください。M9緩衝液を加えて遠心分離し、上清を除去するというこの洗浄工程を、少なくとも3回繰り返します。最終洗浄後、虫体のペレットを最小限量のM9で再懸濁し、OP50細菌のローンを形成させたNGMプレート上に虫体懸濁液をピペットで分注します。液体を数分間乾燥させた後、健康そうなJ4幼虫をピックアップし、新たに播種したプレートに転移させます。変異原処理した虫を約8〜10日間自然受精させ、実体顕微鏡を用いてF2世代の表現型から目的の過剰変異体をスクリーニングします。この変異導入の手順を、直径6cmのペトリ皿4〜5枚から15mL遠心チューブに回収したppac pacificusを用いて実演します。虫のペレットに10mLのM9バッファーを加えます。20回反転させて虫体を洗浄し、1500 Gsで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。M nineを用いて虫体の洗浄を計3回繰り返します。最後の洗浄後、液体を吸引し、虫体の体積の約10倍量のM nineに再懸濁します。次に、最終濃度が 30 µg/mL になるように、3 mg/mL ストック溶液から 4,5,8-trimethyl SOREIN（TMP）を添加します。TMP 添加後、チューブを遮光し、室温で低速ロッカーを用いて 15 分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを垂直に 10 分間静置し、すべての線虫を沈降させます。このビデオではチューブの蓋が開いた状態で示されていますが、実際には TMP 溶液を光にさらしてはいけません。この化学物質は光感受性であるため、パスピペットを用いてチューブの底から虫を取り出し、播種していないNGMプレートに移します。過剰なTMPがプレートに吸収されるまで、プレートを暗所で保持してください。TMPがプレートに吸収された後、虫に紫外線照射を行うことができます。TMP UV神経発生手順において最も重要なステップの一つは、長波長UV光源とプレートの間の距離を適切に設定することです。そのため、プレートに照射されるUV光の強度を適切にするために、距離を数回調整する必要があります。強度は強度計で記録し、500 µW/cm²とする必要があります。UVライトによる潜在的なリスクがあるため、このステップでは適切な保護メガネを着用してください。UV強度計を用いて、長波長UV光源から強度が500 µW/cm²となる距離を決定します。次に、アルミホイルと蓋を取り除き、TMP処理した線虫が入ったプレートを、プレート上の強度が500 micro watts per centimeter squaredになるようランプから離して配置します。プレートに長波長UV放射を50 seconds間照射し、蓋をして室温で5時間暗所に放置します。5時間後、健康そうに見えるJ4幼虫をピックアップし、新たに播種したプレートに移植します。最後に、実体顕微鏡を用いて、F1、F2、またはF3世代から目的の表現型をスクリーニングします。ここに示されているのは、EMSまたはTMPUV変異導入後、F2世代で同定されたppac pacificus変異体の表現型の一部です。これらの画像の上段2つのパネルは、野生型の雌雄同体と野生型の雄の例です。各変異体は、野生型個体と容易に区別できる特徴的な表現型を示します。パネルCはdumpy変異体の例です。パネルDはuncoordinated変異体、パネルEはtransformer変異体を示しています。習得すれば、適切に実施した場合、EMS変異導入は4時間半で、TMP uuv変異導入は5時間半で完了させることができます。この時間帯にはインキュベーション時間も含まれます。EMSおよびTMPは極めて危険であるため、取り扱う際は、白衣の着用、二重手袋の使用、ドラフトチャンバーおよび保護メガネの使用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りします。

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