Name: 発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぼう、HEK-293T細胞における電位依存性イオンチャネルの最適化トランスフェクション法と電気生理学的記録技術。このプロトコルは細胞接着と膜安定性を向上させ、信頼性の高い個別細胞記録を実現します。

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この作品は、グラント、カナダの自然科学と工学研究評議会（NSERC）、NSERCアレクサンダーグラハムベルカナダ大学院奨学金（博士課程）（A. Senatoreまで）と心臓脳卒中財団からJDSに検出動作グラントによってサポートされていました＃6284 NA -補助。

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

記載されているプロトコルとソリューションを使用して、細胞全体の電流を記録するためにできることは、トランスフェクションが成功したことを、所望の電圧依存性イオンチャネルやイオンチャネル複合体は細胞膜でかなりの量で存在していることを示しています。細胞は積極的にトランスフェクト（すなわち蛍光緑）が記録可能な電流、28で追加のタイム° Cが適切にパッケージ化し、細胞膜に挿入されるチャネルタンパク質を可能にするために必要となる場合がありますが持っていない必要があります。 28でその長時間のインキュベーションを注意してください°パッチクランプ記録は、より困難なこと、Cは細胞がカバーガラスからデタッチされます、そして膜が死んだ細胞からごみを不安定化して蓄積する。このプロトコルで提案されている時間のすべては、私たちの特定のチャンネル用に最適化されています。他のチャネルとそのサブユニットは、より長いまたはより短いインキュベーション時間を必要とするかもしれません、そして、必要に応じて我々のプロトコルは、さらに調整することができます。特定のチャネルのために貧しい人々のトランスフェクション効率は、（すなわち少ない蛍光細胞と細胞当たりの低蛍光強度）を効率的にトラン...

<table border="1"><tr><td>材料</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> pIRES2 - EGFPプラスミド</td><td>クロンテック</td><td> 6029から1 </td><td></td></tr><tr><td>サークルガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12-545-80 </td><td>丸1号 - 厚さ0.17ミリメートル〜0.13、サイズ：12ミリメートル</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Axopatch 200BまたはMulticlamp 700B </td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td>電気生理学ソフトウェア</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットマニピュレータ</td><td>サター器械（株） </td><td> MPC - 385から2 </td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光倒立顕微鏡</td><td>ツァイスカナダ</td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> CV - 7B </td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージの電極ホルダー</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td>接地電極のための微小電極ホルダー</td><td>世界の精密機器</td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td>電気生理学キャピラリーチューブ</td><td>サター器械（株） </td><td> BF - 150 - 86から15 </td><td>フィラメント、OD 1.5ミリメートル、外径0.86ミリメートル、長い15センチメートルとホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラーフレイミング</td><td>サター器械（株） </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット火災ポリッシャー</td><td>ナリシゲ</td><td>マイクロフォージMF - 830 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ薬剤灌流系</td><td>サイエンティフィック自動化</td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td>薬剤の潅流システム</td><td>サイエンティフィック自動化</td><td>テフロンバルブ付きValvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

発現とhek - 293t細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

in vitro発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録（HEK - 293T） におけるユビキタス研究の戦略です。彼らは、隣接セルとの接触による交絡影響することなく電気生理学的記録を可能にするために、互いに接触していないようにHEK - 293T細胞は、十分に低い密度でカバーガラス上にプレーティングする必要があります。トランスフェクトされたチャネルは、ノイズレベルを超える検出可能な電流の細胞全体のパッチクランプ記録のための細胞膜に高効率で表現しなければなりません。異種イオンチャネルは、多くの場合、十分な膜発現を達成するために28℃でトランスフェクション後にCを長い潜伏期間が必要ですが、この温度で​​細胞カバースリップの接着と細胞膜の安定性の損失が高まっている。この問題を回避するために、我々は、トランスフェクションとプレートHEK - 293T細胞に最適化された戦略を開発した。このメソッドは、セルが28で比較的高いコンフルエントでトランスフェクトされた、とインキュベートされている必要があります°十分なイオンチャネルタンパク質の発現を可能にするために潜伏期間後のトランスフェクションを変えるためのC。トランスフェクトした細胞をガラスカバースリップ上に播種し、37℃でカバーガラスと膜のrestabilizationに硬い細胞接着を可能にするいくつかの時間、インキュベートする。細胞はすぐにメッキの後に記録することができます、または° C、さらにインキュベーションを28に転送することができます。我々は28時の初期インキュベーション℃で、トランスフェクション後、メッキの前には、通常は細胞膜でも発現しない異種イオンチャネルの効率的な発現のための鍵であることがわかります。積極的にトランスフェクション、培養細胞は、単に上流の内部リボソーム侵入部位およびEGFPをコードする配列のcDNA組換えイオンチャネルを含むバイシストロンベクター（例えばpIRES2 - EGFP）から発現共発現EGFPまたはeGFPので識別されます。ホールセルパッチクランプ記録は、特殊な装置を必要とする、加えて洗練された記録電極とホウケイ酸ガラスからL字型の接地電極の策定。イオンチャネルの薬理学を研究する薬物送達は、直接録音皿に薬をmicropipettingことにより、またはmicroperfusionまたは記録された細胞を介して薬液の中断のないストリームを生成する重力流システムを使用することによって達成することができます。

高効率、信頼性の高い方法<em&gt; in vitroで</em&gt;発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネル（HEK - 293T）のその後の電気生理学的記録。

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

培養ヒト胚性腎細胞（HEK-293T）における再組した電位依存性イオンチャネルのin vitro発現および電気生理学的記録...

電位依存性イオンチャネルを組み換え発現させた培養ヒト胚性腎細胞の活性を研究するには、一般的に電気生理学的な手法が用いられます。正常に記録を行うには、細胞膜上に検出可能なレベルでチャネルが十分に発現していること、および個々の細胞を単離できる十分に低い細胞密度で播種されていることが必要です。しかし、このような発現には通常28 °Cでの長時間のインキュベーションが必要であり、その過程で細胞の接着性や膜の安定性が低下することが多く、細胞記録の妨げとなっています。ここでは、これらの問題を回避するために最適化された細胞培養およびトランスフェクションの手法を実演します。細胞を適度なコンフルエンシーでトランスフェクションし、十分なイオンチャネル発現が得られるまで28 °Cでインキュベートします。その後、トランスフェクションした細胞を低密度でガラスカバースリップ上に播種し、細胞の接着と膜の安定化を促すため、37 °Cで数時間インキュベートします。適切に播種された細胞を、EGFPの共発現およびホールセルパッチクランプ法によって同定します。そのまま記録を行うか、あるいは細胞を再度28 °Cでインキュベートします。チャネルの細胞表面への発現をさらに高めるため、L CAV 1、L CAV 2、または L cav 3 などの電位依存性カルシウムチャネルを導入した細胞で記録実験を行った結果、これらのチャネルが細胞に正常に導入され、発現していることが示されました。ここではL CAV 3の代表的な結果のみを示していますが、当研究室では、ヒト細胞株におけるパッチクランプ記録のために、発現効率の低いイオンチャネル遺伝子の発現を高める手法を開発しました。従来のアプローチでは、まずカバースリップ上に細胞を播種し、イオンチャネル遺伝子を含むプラスミドcDNAをトランスフェクションし、電気生理学的記録を行う前に、高効率なイオンチャネル発現を実現させるため、28 °Cで数日間インキュベートします。我々の新しいアプローチでは、記録前に行う28 °Cでの必要インキュベーション時間を大幅に短縮できます。次に、28°Cでのインキュベーション時間を短縮することで、細胞膜の安定性が大幅に向上し、トランスフェクション後の細胞のカバーガラスへの接着性が向上することがわかりました。これにより、記録可能な細胞数が増加し、実験効率が著しく向上します。トランスフェクションの前に、完全にコンフルエントになったHEK 2 9 3 T細胞のフラスコを1:4に分割して新しい25 cm²フラスコに移し、細胞を37°C、5% CO2インキュベーター内に配置します。細胞を3〜4時間静置して接着させます。4時間後、微分干渉顕微鏡（DIC）で細胞を観察し、接着を確認します。細胞が丸い形状ではなくなり、扁平化していることに注意してください。突起また

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Biology

生物学

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。...

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。...

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。...

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。...

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。...

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

心臓再生医療の新規治療戦略人間の使用を考慮することができます彼ら前に大規模な前臨床動物モデルで広範かつ詳細な研究が必要です。ここでは、このような新規薬剤の有効性の仮説のために貴重であるウサギでは、経皮的コントラスト心エコー法誘導心筋注入法を示す.

経皮的造影エコー ガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。...

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。...

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。...

未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

学ぼう、HEK-293T細胞における電位依存性イオンチャネルの最適化トランスフェクション法と電気生理学的記録技術。このプロトコルは細胞接着と膜安定性を向上させ、信頼性の高い個別細胞記録を実現します。

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

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