発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

電気生理学は、培養されたヒト胚性腎臓細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの活性を研究するために一般的に使用されます。記録を成功させるには、細胞が検出のために細胞膜で十分なレベルでチャネルを発現し、個々の細胞を単離するために細胞を十分に低い細胞密度でプレーティングする必要があります。細胞記録の実行は、通常、細胞接着と膜の安定性が失われるような発現に必要な摂氏28度での長いインキュベーション期間によってしばしば妨げられます。

ここでは、これらの問題を回避するための細胞培養とトランスフェクションの最適化された方法が実証されています。細胞を適度な流暢さでトランスフェクションし、適切なイオンチャネル発現が得られるまで摂氏28度でインキュベートします。次に、トランスフェクションした細胞をガラスカバースリップに低密度で播種し、摂氏37度で数時間インキュベートして、細胞の接着と膜の安定化を可能にします。

適切にプレーティングされた細胞は、共発現したEGFPと全細胞パッチクランプによって同定されます。記録を行うことも、細胞を再び摂氏28度でインキュベートすることもできます。チャネル表面発現をさらに増加させるために、L CAV 1、L CAV 2、L cav 3などの電位依存性カルシウムチャネルをトランスフェクトした細胞での実験の記録実験の結果は、チャネルが細胞によって成功裏にトランスフェクションおよび発現されたことを示しています。

L CAV 3の代表的な結果のみを示していますが、当研究室では、ヒト細胞株におけるパッチクランプ記録のために、発現しにくいイオンチャネル遺伝子の発現を増強する方法を開発しました。現在、従来のアプローチは、まずカバースリップ上の細胞を分割し、イオンチャネル遺伝子を含む血漿CDNAでトランスフェクションし、次に摂氏28度で何日もインキュベートすることで、電気生理学的記録の前に高効率のイオンチャネル発現を達成するというものでした。私たちの新しいアプローチは、記録前に摂氏28度で必要なインキュベーション時間を大幅に短縮します。

28度のインキュベーション時間を短縮することで、細胞膜がはるかに安定し、トランスフェクションされた細胞がカバースリップにはるかに多く付着することがわかりました。これにより、記録可能な細胞の数が増え、実験の効率が大幅に向上します。トランスフェクションの前に、HEK 2 9 3 T細胞の完全にコンフルエントなフラスコを1つから4つを新しい25cm四方のフラスコに分割し、細胞を摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。

細胞を4時間後に3〜4時間接着させ、微分干渉コントラストで細胞を調べて付着を確認します。セルが丸く見えなくなり、フラット化されていることに注意してください。エクステンションまたは偽足が表示されます。

コンフルエンスセルが少ないほど、同じように見えますが、間隔が広くなります。細胞が付着したら、必要な試薬を組み合わせて、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションを行います。フラスコあたり600マイクロリットルのトランスフェクション溶液に合計12マイクログラムのDNAを調製します。

ここでは、さまざまなイオンチャネルからのCDNAがP-I-R-E-Sにクローニングされ、この発現ベクターの哺乳類細胞株への2つのEGFPプラスミドトランスフェクションが行われます。イオンチャネルコーティング配列のすぐ下流およびEGFPコーティング配列の上流にある内部リボソーム入口部位で開始される翻訳により、クローニングインサートと同じmRNAから増強された緑色蛍光タンパク質が産生されます。これにより、EGFPタンパク質を目的のタンパク質に直接融合させることによって引き起こされる可能性のあるタンパク質機能への干渉なしに、陽性トランスフェクションされた細胞を同定することができます。

トランスフェクション溶液を細胞上に滴下し、フラスコを静かに渦巻かせ、翌日37°Cのインキュベーターに一晩置く。トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡で細胞を観察して確認してください。陽性でトランスフェクションされた細胞は、細胞全体で緑色に見えるはずです。

トランスフェクションが確認されたら、4〜5ミリリットルの温かい培地を逆フラスコに慎重にピペットで入れます。細胞表面が下になるようにフラスコをゆっくりと裏返し、フラスコを揺らして洗浄液が細胞の上を穏やかに移動するようにして、細胞を洗浄します。メディウムを取り出し、この洗浄を繰り返します。

さらに 2 回ステップを実行します。次に、フラスコに6ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。無脊椎動物のイオンチャネルの発現には、いくつかの課題があります。

まず、それらはサイズが大きいことが多いため、小胞体での翻訳に時間がかかる場合があります。また、哺乳類の細胞株では、細胞膜を効率的に標的にできない可能性があります。最後に、種によってコドンの使用頻度が異なるため、異種CDNAは、これらの困難の一部を克服するために、HEK 2 9 3 Tなどの哺乳類細胞では珍しい高頻度のコドンを保有する可能性があります。

トランスフェクトを洗浄した後、摂氏37度で2時間のインキュベーションを行った後、フラスコを摂氏28度のインキュベーターに2〜6日間移し、発現期間を延長します。インキュベーション時間は、発現するイオンチャネルの種類ごとに経験的に決定する必要があります。摂氏28度で長時間インキュベートすると、細胞が剥離し、膜の安定性が低下するためです。

電気生理学的研究を行う前に、さらなる細胞調製が必要です。まず、トランスフェクションした細胞からトランスフェクションした培地を吸引ピペットで1ミリリットルの摂氏37度のトリプシン溶液に逆フラスコに入れます。次に、フラスコを細胞表面を下の位置にゆっくりと戻し、トリプシンが細胞上を穏やかに流れるようにします。

フラスコを裏返し、トリプシンを取り除きます。次に、250マイクロリットルの温かいトリプシンを細胞に直接加え、細胞が剥離するまで摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。その間に、3〜8ポリLリジンコーティングされたカバーを60ミリメートルの培養皿に入れ、5ミリリットルの温かい培地を追加します。

細胞が蘇生から分離したら、マイクロピペットの先端を使用して、次に約6回ピペッティングして4ミリリットルの温かい培地に細胞を懸濁し、カバースリップを押し下げて皿の底にあることを確認します。次に、250〜500マイクロリットルの再懸濁細胞を追加します。細胞を37°Cで3時間インキュベートし、カバースリップに接着させます。

細胞を37°Cで長時間放置すると、トランスフェクションされたプラスミドの細胞分裂と希釈が生じます。トランスフェクションされた細胞は、ここに示すように、互いに単離されるように、十分に低い密度でプレーティングする必要があります。これにより、電気生理学的記録が容易になります。

アクセサリーサブユニットを必要とする細胞の場合、細胞を摂氏28度に移し、電気生理学的にさらに3〜4日間インキュベートする必要があります。記録は、アクセサリサブユニットを必要としないセルに対して実行されます。このインキュベーションの直後に記録を行うことができます。

ここで使用される電気生理学装置には、アンプ、電動、デュアルピペットマニピュレーター、エピ蛍光顕微鏡、灌流システムが含まれます。装置は防振テーブルに取り付けられており、迷子になっています。電気ノイズは、数字データ1440、Pクランプ10.1ソフトウェアと連動したアナログ-デジタルコンバータインターフェースを備えたPCを含む40インチの高さのタイプ2フェレットケージ電子制御システムによって制限されます。

コンピュータモニターアンプ、電動マニピュレータ、バルブリンク増殖制御システムは、すべてファラデーケージの外側に取り付けられています。自立型の19インチ金属製電気ラックでは、すべての電気機器が銅製のディストリビューターに接地され、医療グレードの絶縁トランスに接続されています。これにより、ライン絶縁、一貫した接地、およびサージ抑制が提供されます。ヘッドステージのマイクロピペットホルダーに2〜5メガオームの抵抗を持つファイヤーポリッシュマイクロピペットを取り付けて実験の準備をします。

パッチピペットには、気泡を取り除くための内部溶液フリックが充填され、最終的にヘッドステージに取り付けられます。次に、鉗子を使用して、細胞をメッキした1枚のカバースリップを、室温で3ミリリットルの外部記録溶液が入った35ミリメートルのプラスチックペトリ皿に移します。既知量の薬物をマイクロピペットで皿に加え、顕微鏡ステージに皿を置く薬物実験を行う場合、記録溶液の量を正確に測定する必要があります。

次に、マイクロ電極ホルダーのハーフセルに3モルの塩化セシウムを充填します。次に、参照電極をハーフセルに挿入し、マイクロマニピュレータを使用して接地電極をバスに入れ、パッチピペットをバス溶液に下げます。細胞を蛍光モードで可視化し、単離された陽性トランスフェクトされた接着性緑色細胞を視野の中央に配置します。

バスモードで、パッチピペットを細胞に近づけます。コンピューター画面で観察された方形波のトレースをゼロにします。パッチピペットの位置を調整して、パッチピペットがセルにちょうど触れ、画面上の正方形の電流トレースが変動し始めるようにします。

付属のシリンジでギガオームシールが形成されるまで優しく吸引します。ギガオームシールが達成されたら、プログラムをパッチモードに切り替えます。細胞膜を突破するために、シリンジで吸引の迅速なパルスを適用します。

次に、セルモードに切り替えて、アンプで全セルパラメータを使用します。容量性過渡性を補償するためには、細胞内記録溶液がパッチされた細胞に透析されるようにパッチを平衡化する必要があります。この実験用に書かれた電圧クランププロトコルをここに入力します。

実験者は、細胞膜を横切る電圧が変調されたときに生じる電圧依存性イオンチャネルを通るイオン電流を測定するプロトコルを設計しました。この場合、ソフトウェアがセルをマイナス 110 ミリボルトに保持し、その後 SEP をマイナス 70 ミリボルトに 250 ミリ秒保持するように指定する IV プロトコルを検討しています。その後、ステップが10ミリボルト増加するたびにマイナス110ミリボルトの保持電位に戻り、ステップがマイナス70ミリボルト、マイナス60ミリボルトなどになり、最後のステップがプラス20ミリボルトになるまで続きます。

記録された電流を増幅器上のローパスベッセルフィルターを使用して10キロヘルツでフィルタリングし、クランプX10.1ソフトウェアを使用して2キロヘルツのサンプリング周波数でデジタル化し、10%未満の最小限のリークでの記録のみを使用します分析のために、HEK2 93T細胞を培養し、L Cavでトランスフェクトしました。ここに示すように、3つのカルシウムチャネル。異種イオンチャネルCDNAのトランスフェクションの成功は、P-I-R-E-S two eeg FPベクターから生成された蛍光によって示されました。

ここでは、無脊椎動物のcavの3電圧カルシウムチャネルの発現の成功を示しています。細胞がトランスフェクションされていない場合、カルシウム電流は引き出されません。一方、トランスフェクションされた細胞は、全細胞電圧クランププロトコルが細胞に適用されると大きな電流を発生します。

実験者は、要件に応じて、さまざまな電気生理学的条件とデータ解析レジメンを使用できます。この手順を試みる際には、実験のタイミングについて自分自身の判断を下すことを忘れないでください。チャネルが異なれば、細胞膜で発現する効率も異なるため、細胞の生存率を高め、関心のあるチャネルの表面発現を最大化するために使用する最適な戦略を決定するのは、お客様次第です。

このビデオをご覧になった方で、ヒト細胞株の培養方法と維持方法、および異種イオンチャネルCDNAとサブユニットCDNAをこれらの細胞にトランスフェクションする方法について、ご理解いただけたでしょうか。電気生理学的記録用。