ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング ₄介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

ロイコトリエンB4は、さまざまな炎症細胞上のGタンパク質共役受容体であるBLT1およびBLT2を介して作用する炎症性分子です。LTB4-BLT1経路は、喘息、関節炎、動脈硬化を含むいくつかの炎症性疾患において重要であることが示されています。Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、走化性、細胞内カルシウム放出、遺伝子調節などの細胞内応答を引き起こす細胞外信号の伝達を媒介します。

細胞外リガンドの結合は、ヘテロ三量体Gタンパク質の活性化につながる一連の構造変化を誘導します。その後、Gタンパク質は、環状アデノシン一リン酸、アデニル酸三リン酸、およびジアシルグリセロールなどのセカンドメッセンジャーのレベルを調節します。骨髄由来樹状細胞（BMDC）において、マイクロピペットからの制御されたフローでリガンドを投与しながら、ロイコトリエンB4が介在する細胞遊走をリアルタイムで観察します。遊走能を評価するために、タイムラプスイメージングを行います。

これらの生細胞リアルタイムイメージング技術を用いて、当研究室はleukotrien B4受容体BT1が樹状細胞に機能的に発現していることを発見しました。また、BT1の内部移行におけるリン酸化およびβ-アレスチン依存的なメカニズムも特定しました。当研究室の助教であり、これらの技術の多くを開発したDr. Jlaが、生細胞の遊走および受容体の内部移行の両方を実演します。細胞遊走アッセイ用に骨髄由来樹状細胞（BMDC）を準備するには、FBS、リコンビナントGM-CSF、およびリコンビナントFLT3を含むRPMI 1640培地を用いて、0.5 million個の細胞を35 mmガラスボトムディッシュに播種します。

播種後、細胞を37°C、5% CO2条件下で16時間インキュベートします。16時間後、3 mLのPBSを加え、その後吸引します。最後の吸引後、この洗浄をさらに少なくとも2回繰り返し、プレートに2 mLのPBSを加えます。

これで細胞の実験準備が整いましたので、37 °Cで保持してください。なお、本ビデオの実験で使用したイメージングシステムは、加熱ステージとcool SNAP hqデジタル白黒CCDカメラを備えたNikon eclipse TE 300倒立顕微鏡に、A-T-E-F-Mエピ蛍光システムを取り付けたものです。

励起波長および蛍光波長は、フィルターホイールとLambda 10-2フィルターホイールコントローラーによって制御されます。ハードウェア制御および画像の取得は、Metamorphソフトウェアで行います。ピペットを保持するために、2台のマイクロマニピュレーターを顕微鏡ステージに取り付けます。なお、ピペットは付属テキストの指示に従って作製するか、市販品を購入してください。

100 nanomolarのプロ炎症性リガンドleukotriene B₄（LTB₄）ストック溶液1.5 millilitersを、1.5 milliliter centrifugeチューブに移します。マイクロピペットのチップを溶液に浸し、溶液を吸い込ませることでバックフィルを行います。このロード方法により、マイクロピペットの先端に気泡が形成されるのを防ぐことができます。次に、microfillニードルを装着した1 cubic centimeterの結核用注射器に、LTB₄を1 milliliterロードします。

次に、それを用いてマイクロピペットを上部からゆっくりと満たし、チューブをLTB 4に接続します。続いて、リガンドで満たした1 mLシリンジに接続された21ゲージ1.5インチの針に、マイクロピペットとチューブを接続します。ここで、リガンドで満たしたマイクロピペットを顕微鏡ステージ上のマイクロマニピュレーターのいずれかに慎重に固定し、骨髄由来樹状細胞のライブセルイメージングを行います。

LTB 4リガンドを添加した後、プレートした未熟b MDCをインキュベーターから取り出し、顕微鏡の加熱ステージ上に置きます。60倍油浸レンズを用いて、細胞を視野に入れます。細胞の遊走を適切にモニタリングできるよう、細胞が密集しすぎていない領域を探します。

フルオロディッシュから蓋を取り外します。次に、粗動マニュアルマニピュレーターを使用して、リガンドを充填したピペットを慎重に降ろし、油圧微動マイクロマニピュレーターを用いて細胞に近づけます。

ピペットに焦点を合わせます。シリンジからわずかに圧力を加え、LTB four ligandを先端からゆっくりと放出させます。リガンドは拡散によって培地中へ緩やかに広がります。次に、metamorphソフトウェアを使用して、2時間にわたり15秒ごとに明視野像を取得するように画像取得パラメータを設定します。

リガンドへの遊走の進行を5分ごとにモニタリングし続けてください。本プロトコルで説明した方法は、ロイコトリエンB4に向かう樹状細胞の遊走を決定するために用いられました。ここでは、100に向かうマウス骨髄由来樹状細胞の遊走について説明します。

このタイムラプスイメージングビデオでは、LTB4に向かうBMDCの生細胞遊走が示されています。同様の手法を用いて、さまざまな化学走性を誘導する物質に対する多くの細胞種の化学走性応答を決定することができます。この種のイメージングを蛍光タンパク質タグ分子と組み合わせることで、生細胞内における分子の移動や相互作用をリアルタイムで追跡することが可能です。

ここでは、蛍光タグ付きロイコトリエンB4受容体1とβ-アレスチンとの相互作用をリアルタイムで実証します。RBL2H3は、ATCCから入手可能なウィスターラット由来のラット好塩基性白血病細胞株です。これらの細胞は多くのケモカイン受容体を発現していませんが、ケモカイン依存性シグナル伝達経路を媒介するための細胞成分を備えています。

リガンド誘導性のBT1内部移行をリアルタイムで評価するため、RBL 2H3細胞にBT1 RFPおよびβ-arrestin GFPをトランスフェクトします。タイムラプスイメージング中にプレートにリガンドを添加します。これらのタンパク質の局在の変化は、画像解析によって評価できます。

G PCR Rの内在化をリアルタイムで研究するため、付属テキストの手順に従って、RBL 2H3細胞にB LT one RFPとbeta arrestおよびGFPをトランスフェクトします。次に、エレクトロポレーション後の細胞と通常増殖培地の混合液300 µLを、2 mLの通常増殖培地を含む35 mmフルオロ皿に移します。細胞を37 °C、95%空気および5%二酸化炭素の加湿雰囲気下に置き、皿の底に接着させます。

1時間後、トランスフェクション培地を通常の増殖培地に交換し、細胞をインキュベーターに戻してさらに18～24時間培養します。培養後、10 mMのHEPESを含む温めたフェノールレッド不含RPMI 2 mLをプレートに直接加え、培地を吸引することで、細胞を2～3回洗浄します。その後、さらに1.8 mLを加えます。

次に、培養皿を加温顕微鏡ステージ上に置きます。60倍のオイルイマージョンレンズを用いて、600倍の倍率で画像を収集します。その後、適切な蛍光フィルターに切り替えます。

細胞表面にHBL BT one RFPを発現している健全な細胞を選択し、ここで画像をキャプチャします。RFPフィルターからGFPフィルターに切り替え、細胞質にbeta arrest-GFPが発現していることを確認して画像をキャプチャします。その後、マージされた擬似カラー画像を確認し、ミスによって起こりうる蛍光のブリードスルーがないか確認してください。

RFPとGFPの間で受容体の標的化は起こりません。次に、タイムラプスイメージングのパラメータをここに入力します。16ビット画像は、カメラのビンニングを1×1に設定して取得します。

RFPおよびGFP蛍光フィルターを用い、R-F-P-G-F-Pビームスプリッターを介して赤色および緑色の蛍光画像を順次キャプチャします。ソフトウェアの設定を行い、1時間にわたり32秒間隔で画像をキャプチャします。同様のダイナミックレンジが得られるように、カメラの露光時間を設定します。

RFPおよびGFPの蛍光強度について。1分間画像を収集し、t＝0の時点で、プレートを乱さないようにリガンド 200 µLを直接添加します。

さらに60分間、蛍光画像の収集を継続します。リガンド添加後、取得された画像は連番のファイル名を持つTIFF形式の画像として自動的に保存されます。これらのファイルは、ソフトウェアを用いて個別の画像として、または統合された画像として閲覧することができます。

最後に、すべての細胞画像の取得が完了した後、同じ設定を用いて細胞を含まない培地のみの画像を取得します。これらのファイルを、画像解析用の背景画像として保存してください。MetaMorphの画像減算（image subtract）機能を使用して、上述のデータ画像から背景を減算します。

これにより、培地によるバックグラウンドや自家蛍光を補正します。次に、ファイルメニューから「final generated stack file」オプションを開き、個々のスタック画像を開きます。続いて、領域計測（region measurements）で「eclipse region trace region」を選択し、関心領域（ROI）を描画します。BLT1およびβ-arrestinの転位に対応するRFPおよびGFPの蛍光強度を測定するために、表面領域および細胞質領域を選択します。

logデータオプション（Excelに自動的にリンクされる）を使用して、時間の関数として蛍光強度の量をプロットします。このグラフにより、特定の分子の転位キネティクスに関する情報が得られます。画像解析では、GPCR、細胞質タンパク質、および核の局在を明らかにすることができます。

ここでは、RBL 2 H 3 細胞の表面における BT1 RFP の発現が示されています。この画像では、同一細胞の細胞質における beta arrestin と GFP の局在が示されており、核内には pNuke CFP が認められます。ここに表示されている合成カラー画像は、各蛍光色素の明確な細胞内局在を示しています。また、表面 GPCR と細胞質タンパク質とのリガンド誘導性相互作用についても、ここで評価することが可能です。

リガンド誘発性のBLT1受容体およびβ-アレスチンの転移。このビデオでは、BLT1-RFPおよびβ-アレスチン-GFPを発現している細胞のライブイメージングを示しています。1 µMのLTB4を添加すると、Metamorphソフトウェアを用いて転移パターンの定量分析をモニタリングできます。

代表的な細胞における蛍光強度のラインスキャンをT=0で示しています。β1 RFPは膜に、β-arrestin GFPは細胞質に観察されます。リガンドの添加後、RFPとGFPのラインの重複が観察され、受容体とβ-arrestinの共局在が示唆されます。

さらに、ここではタンパク質の移動速度を測定することができます。1 µMのLTB4添加後の、受容体のインターナリゼーションおよびβ-アレスチンの移行のキネティクスを検討しました。

蛍光強度は、細胞の膜および細胞質における時間関数として測定されました。LTB4リガンドをB LT1 RFPおよびbeta arrestin 1 GFPをトランスフェクションしたRRB 2 H3細胞に添加すると、beta arrestin 1 GFPが細胞質から膜へ移行し、1分以内に黄色いリングの形成として観察されます。beta arrestin 1 GFPとの相互作用により、BT1 RFPは受容体-beta arrestin 1 GFP複合体を形成し、5分以内に黄色い点状構造（puncta）が出現することから明らかなように、エンドソームの形態で細胞質を介して移行します。これらの手法を用いることで、リガンド依存的な受容体の活性化状態、および受容体活性化に関与する重要なモチーフやプロセスを決定することが可能です。

この実験において最も重要な点は、操作中のプレート内のバッファーに注意を払うことです。実験は開始から1時間以上経過して進行します。この手法は、さまざまな哺乳類細胞種における細胞遊走および受容体リガンド相互作用を探索するために、ケモカインおよび受容体分野の研究者によって開発されました。

このビデオを視聴することで、ケモカインとその受容体、およびβ-arrestinなどの細胞質タンパク質との相互作用を含むリアルタイムイメージング実験のセットアップ方法について、十分な理解を得ることができます。