Name: 環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ栄養ストレス下で亜麻を栽培し、LIS one挿入要素を伴う遺伝的変異と遺伝子発現変化をPCRとQ-R-T-P-C-Rで解析する方法。作物の環境適応性向上に貢献します。

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1。誘導条件下での亜麻の成長。 <ol><li> 5"ポットは、土壌を充填し、確定されています。 </li><li>ポットごとに3つの種子が植えられている¼インチ深いと土は、種子を介して確認した。 </li><li>ポットは、適切な栄養溶液100mlのと水遣りされています<ol><li>非誘導コントロール（C）の条件は、毎週1 / 10の強度ミラクル-グロを使用してください。高栄養状態（NPKの治療は）完全な強度のミラクルは毎週適用育てていた。低栄養 - 植物は彼らの成長全体に適用される水道水を持っていた。 （デュラン1971、カリス1980）。 </li></ol></li><li>植物は夏の間、自然光の下で栽培されています。冬の間、彼らは8分の16時間の明/暗サイクルでナトリウム灯の下で栽培されています。 </li><li>週間間隔で葉や分裂組織が収集されます。 </li><li>植物材料は、迅速に液体窒素中で凍結されています。 </li></ol>結果 3つの遺伝子型は、条件（図1）に応じて異なる相対的な速度で成長する。したがって、制御条件の下でのPLラインは、LはS（図1a）よりも活発であることで最高の成長。低栄養素（水）の下で、SはLまたはPL（図1b）のいずれかより良い成長。高栄養下で（NPK）、LはSよりわずかに良い成長（図1c）PLよりも優れて成長する。 F. - 3つの異なった治療法で育成した行のそれぞれの間の比較を図1のDに示されていますPLは高い栄養と制御条件（図1F）の両方で同様に高栄養（図1e）とSで最高の、Lを制御条件下で最高の成長（図1d）。 これらのデータは3行が3つの環境下での彼らの成長に基づいて区別できることを示している。注目すべきは、LはNPKの条件（それが誘導されたの下）の下で最高の成長ながら、PLは制御条件の下で最高の成長ということです。 Sが3つの条件すべてに同じ程度成長する、つまり、それは改善された栄養条件を活用することではありませんが、良い、非常に低栄養条件下で成長することが可能です。 植物の分化に関連する成長パラメータは、植物の高さ（とそれぞれの葉の間の距離ですこの節間長、関連付けられている）、葉の大きさや分岐の程度が含まれています。 plに関する制御条件の下で植物は枝と背が高いと葉が大きく、濃い緑色です。低栄養素の下で植物が非常に短い場合、各葉の間の距離も非常に短く、葉が小さく、薄い緑色です。先端の葉が茎ダウン低いものよりも暗い緑です。高い栄養素の下で植物は主茎や側枝の両方がコントロール植物に比べて短いことを除いて、制御条件の下でそれと非常によく似ています。大genotrophのための植物は高い栄養素の下で最も活発な成長点を除いてPLのものと非常によく似ています。再び低栄養素で植物は非常に短く、光の緑の葉を持っています。葉は低い栄養素の下に軽く緑色ですがS genotrophは、3種類の環境すべてで同じように成長する。しかし、低栄養状態でS genotrophはPLまたはLラインのどちらよりもはるかに活発です。 2。亜麻の分裂と葉からRNAとDNAの抽出を別々に行われます。ロシュトータルRNAプレップキットはRNA抽出のために使用され、キアゲンDNeasy植物DNAプレップキットは、DNA抽出に使用されていました。 RNA抽出<ol><li> 3分裂組織およびいくつかの周囲の葉は、エッペンドルフチュー​​ブにストレージクライオバイアルから移動し、地面になる準備ができるまで、液体窒素中に配置されます。 </li><li>滅菌砂をチューブに添加され、組織は罰金までmicropestleを使用して粉砕される。 </li><li>ロシュトータルRNAプレップキットから400 ulの溶解/結合バッファーを添加していない塊が表示されていないまで、組織はさらにグランドです。 </li><li>サンプルは、砂やごみを収集するために13,000 rpmで1分間スピンして溶解を助けるとに15のために秒をボルテックスしています。 </li><li>上清をカラムにスピンに追加され、指示されたとおりにRNAプレップキットの説明書の残りの部分が続いている。 </li></ol> DNase処理<ol><li> 10XのDNaseバッファーの1 / 10のRNAサンプルの量が追加されます。 </li><li> DNaseの30単位を添加し、反応を37℃でインキュベートされた℃で30分間、70℃で5分間のためのC。 </li></ol>逆転写<ol><li> cDNAをキットにアプライドバイオシステムズRNAが当たり方向、37度でインキュベート反応℃で1時間および95℃で5分間として使用されます。 </li></ol> cDNAは、PCRや定量PCRに使用されます定量PCR 定量PCRはABIのステップOneシステムを用いて行った。すべてのアッセイは、実行ごとに三連で行った。アクチン遺伝子はコピー数の制御などに使用された利用可能な最善のハウスキーピング遺伝子。 <ol><li>適切なプライマー対は、1μlの各チューブに添加した。 </li><li> cDNAは、適切な濃度と9μlに希釈し、各チューブに添加</li><li> 2倍のパワーSYBRグリーンPCRマスター（ABI）の10μlを、各管に添加した</li><li>プログラムの増幅プログラムがあった。 <ul><li> 95℃で10分° C </li><li> 95℃15秒の40サイクル° C、60 ° Cで1​​分</li></ul> 増幅の特異性を確認するために熱変性のステップ</li><li>相対的な発現レベルは2の値（ - CTactin CTunknown）により決定した。 </li></ol> DNA調製<ol><li>キアゲン社DNeasy植物DNAプレップキットからバッファAP1は、マイクロ遠心チューブに滅菌砂で6葉に追加されます。ない塊が表示されていないまで、組織はmicropestleで粉砕される。 </li><li>キットの指示は、指示どおりに続いている。 </li></ol>結果幹に沿って様々な位置での葉から単離したDNAからのPCR増幅は植物が誘導条件（4）の下で成長している間にLIS - 1の外観が発生したことを示しています。定量PCRの結果は、LIS - 1（または誘導に関連する他のゲノムの変化）の存在が、LIS - 1のすぐ近く（図2）の遺伝子の発現に影響を​​及ぼすことを示している。図2に示す6つの遺伝子は、すべての差動4つ以上のPLの発現（LIS - 1を適用していない）とSのより高い発現を（LIS - 1を持っていない）有する二つを持って使用して、PLとSで表されます。パネル1と2は、LIS - 1の挿入ポイントに近い位置にある2つの遺伝子である。大genotrophでこれらの遺伝子の発現（これは誘導される変化があったがLIS - 1を持っていない）とは異なる成長条件での発現は、LIS - 1と発現の変化との間に因果関係を判断するために必要となる。 <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。PL、LとSは、3種類の栄養素体制の下で成長した。パネル - コントロール、B - 低栄養素およびc - NPK。 D - PL、E - S、F - D L.パネル - fを左から右へ：低栄養素、コントロールとNPK。 D - PL、電子 - L、F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="図2 親指" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2親指"> LIS - 1の挿入ポイントの周りの図2。遺伝子発現。遺伝子1（成長の阻害剤）LIS1にすぐに5'であり、LIS - 1の遺伝子2（キップ関連のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のID 3"。他の遺伝子はすべてから構築された同一の足場（〜500KB）に沿っている亜麻のゲノム配列を完了してください。下さい<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">大きな図をご覧いただくにはこちらをクリック</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。低栄養条件下で栽培ストーモントシーラスの植物の個々の葉から抽出したDNAのPCR増幅。 PCR産物を2％アガロース- TBEゲル上で分離した。 uninsertedサイトがパネルに示されている、挿入部位の両端は、パネルBおよびCに示されています葉のサンプル1から6は、サンプル1は、播種後早いいると毎週の間隔で分離した。

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

フラックスは、本質的に不安定なゲノムを持っているように見えます。数世代にわたり増殖させた場合の商用繊維亜麻の種の数は急速に不均一になる。同じ観察結果は、石油の亜麻の種のために真のまま表示されません。したがって、繊維の質とゲノム不安定性のための選択の間に関連があるように見える。亜麻の環境誘発遺伝性の変化は、もともと繊維作物の成長の農業観測の調査によって確認された。特定の表現型とゲノムの変化のこれらの再現性の観察結果は、環境ストレスが発生する可能性がゲノム再編成のスイートに影響を与えることができるかという疑問が生じる。特定の環境に応じて、LIS - 1の繰り返し出現は、この変異が直接または間接的に選択されていると一致している。様々な処理により誘導される行の成長はまた、関連する誘導条件下でのパフォーマンスの向上を示している。また、LIS - 1の存在に関連した発現の変化は、再びこの挿入は、プラントのパフォーマンスに影響を与えることを示しています。ビデオプレゼンテーションは、従来の印刷物を通じて伝えることが不可能な方法で植物の表現型の変化を観察するためのフォーラムを提供しています。

<ul><li>オリジナルストーモントシーラス品種の亜麻の種子は、PLとgenotrophs LとSを表す</li><li> 5&quot;ポット</li><li>土壌をポッティング</li><li>ミラクル-グロ</li><li>温室効果</li><li>高圧ナトリウム灯</li><li>液体窒素</li><li>モルタルと乳棒</li><li> Micropestlesおよびマイクロチューブ</li><li>クラー</li><li>アガロースゲル電気泳動装置</li><li>デジタルイメージングセットアップ</li><li> StepOne定量PCRモジュール</li><li>キアゲン社DNeasy植物DNAプレップキット</li><li> cDNAをキットにアプライドバイオシステムズRNA </li><li>ロシュトータルRNAプレップキット</li></ul>

環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

いくつか亜麻の品種は、そのゲノムを変更することによって、栄養ストレスに応答し、これらの変更は、多くの世代にわたって継承することができます。また、これらのゲノムの変化に関連付けられていると表現型のバリエーションの1,2を遺伝している。つの異なる栄養条件下で栽培亜麻多様ストーモントシーラス（PL）のどちらか（対照条件下）誘導性のまま、または安定的にそれぞれの高または低栄養条件下での成長が大きいか小さいgenotrophのいずれかに変更になることができます。これらの各条件の下で初期成長に起因する線は、PLラインが両方ともハイとローの栄養素で植物栽培が下にあることを示す制御処理で最高の成長著しく、その後の世代で同じ条件下で増殖した場合より良い成長に見えるストレス。植物が栄養ストレス下で成長している間に遺伝性変化の誘導に関連付けられているゲノムの変化の一つは、挿入要素の外観（LIS - 1）3、4です。この挿入イベントに関しては、つの異なる栄養条件下で栽培亜麻多様ストーモントシーラス（PL）のどちらか、（制御条件の下で）変更されないまま挿入はすべての植物に表示される（低栄養素の下）と、これが送信されていることができます次の世代に、または挿入（またはその一部）を持って表示されますが、世代（高い栄養素下）4を介して送信することはできません。この挿入の出現頻度は、それはまた次の世代の成長の応答と一致している正の選択、下にあることを示しています。成長の様々な段階で収穫された葉や分裂は、DNAとRNAの分離に使用されます。 RNAは、様々な成長の環境および/またはt彼LIS - 1の存在/不在に関連付けられている式の中で変化を識別するために使用されます。単離されたDNAは、挿入が発生しているそれらの植物を識別するために使用されます。

ゲノムと表現型変異のサブセット内にゲノム変異の栄養ストレスの結果の下にある亜麻の品種を育てる。特定のサイトでの複雑な挿入は、様々な栄養素体制の下で成長したとこのサイトの周り遺伝子発現の変化と関連付けられています。

一部の亜麻の品種は、ゲノムを変異させることで栄養ストレスに応答し、これらの変異は多くの世代にわたって継承されることがあります。また、...

この手順の全体的な目的は、遺伝可能なゲノム変異が生じる条件下で、誘導性の亜麻品種を栽培する方法を実演することです。さらに、ゲノムの変化をモニタリングし、誘導された植物の次世代以降の成長をさまざまな環境下で観察します。これを達成するため、亜麻をさまざまな誘導条件下で栽培します。その後、さまざまな環境下で植物を成長させ、異なるタイミングで葉とMarisの茎組織を採取します。次に、組織サンプルからDNAおよびRNAを単離します。手順の最終ステップとして、DNAサンプルを用いてPCRを、単離したRNAを用いてQ-R-T-P-C-Rを行い、異なる環境条件下での成長によって生じたゲノム変化および遺伝子発現変化を特定します。最終的に、処理した植物の組織から単離した核酸を用いてPCRおよびR-T-P-C-Rを行うことで、ゲノム上の特定の位置におけるLIS one挿入要素の出現と、その要素の存在に関連する発現差を可視化し、成長条件に対するゲノム応答を示す結果を得ることができます。こんにちは、ケース・ウェスタン・リザーブ大学生物学部のクリス・カルです。カル研究室のコリ・ジョンソンです。私はティファニー・モス、同じくカル・ラボの所属です。そして私はマーシャル・ルーカスです。カル・ラボの学部生向け夏季研究プログラムに参加している学部生です。当研究室では、成長環境の変化に伴うゲノムおよび遺伝子発現の変化を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。誘導条件下で亜麻を栽培するため、まず5インチのポットに土を満たし、軽く固めます。次に、1つのポットにつき3粒の亜麻種を、深さ1/4インチに植えます。次に、非誘導コントロール条件のため、種子の上の土を覆います。1/10濃度のMiracle-Gro溶液100 millilitersで植物に灌水します。高栄養条件下の植物に、フルストレングスのMiracle growを100 milliliters投与します。最後に適用します。低栄養植物には水道水のみを供給します。夏季は、植物の成長に合わせて自然光の下で栽培してください。すべての植物に対し、自動スプレーシステムを用いて1日2回、5分間灌水します。週に1回、植物に成長条件を適用します。1週間おきに葉と主茎を採取します。DNA抽出用に6枚の葉を、RNA抽出用に3本の主茎を採取し、採取後、植物材料をクライオバイアルに入れ、液体窒素で急速凍結させ、抽出まで−80°Cで保存します。これら3つの遺伝子型は、条件に応じて異なる相対成長速度を示します。対照条件下では、純系亜麻品種のStormまたはPL系統が最も良好に成長します。この親系統から複数の系統が派生しており、大粒（L）品種は小粒（S）品種よりも生育旺盛です。しかしながら、低栄養条件下では、SはLまたはplよりも良好に成長します。また、高栄養条件下では、Lはplよりも良好に成長し、plはSよりもわずかに良好に成長します。3つの異なる処理条件下で育成した各系統を比較すると、PLはコントロール条件下で最も良好に成長することがわかります。Lは高栄養条件下で最も良好に成長し、Sは高栄養条件とコントロール条件の両方で同様に成長します。これらのデータは、3つの系統が3つの環境下での成長に基づいて区別できることを示しています。PLおよびLは特定の環境下でより良好に成長しますが、Sは3つの条件すべてにおいてほぼ同様に成長します。Sは栄養条件の改善を利用することはできませんが、非常に低い栄養条件下ではより良好に成長することができます。DNA抽出を行うには、Qiagen社のDNeasy Plant DNA Prep Kitに含まれるバッファーAP1を、滅菌済み砂を入れたマイクロ遠心チューブ内の葉6枚に加えます。マイクロペッスルを用いて、塊が見えなくなるまで組織を研磨します。その後、キットの指示に従って抽出を継続してください。RNA抽出を開始するには、保存用クライオバイアルからMarisの茎3本と周囲の葉を数枚、マイクロ遠心チューブに移します。チューブに滅菌済み砂を加え、マイクロペッスルを用いて組織が微細になるまで研磨します。サンプルの溶菌を促進するため、15秒間ボルテックスした後、13,000 RPMで1分間遠心分離し、砂および不純物を回収します。SNATをスピンカラムに加え、メーカーの指示に従ってRNA調製を続けます。組織からRNAを抽出後、RNAサンプル量の10分の1量の10 XDNAバッファーを反応液に加えます。D Nsを30 units添加し、反応液を37 °Cで30分間、続いて70 °Cで5分間インキュベートします。Applied Biosystems RNA to cDNA kitを用いて逆転写を行います。製造元の指示に従い、反応液を37 °Cで1時間、その後95 °Cで5分間インキュベートします。最後に、収量を決定するために、5 µLのcDNAを1.5%アガロースゲルで電気泳動します。亜麻のcDNAが調製されたら、それをqPCRに使用します。qPCRはABI StepOneシステムを用いて実施してください。各ランにおいてすべての測定を3回繰り返し、コピー数コントロールとしてハウスキーピング遺伝子のActinを用い、qPCR用の反応液を調製します。各チューブに適切なプライマーペアを1 µL加えます。CD DNAを適切な濃度に希釈し、各チューブに9 µL加えます。最後に、各チューブに2倍濃度のcyberg green PCR master mixを10 µL加えます。次に、増幅プログラムを設定し、増幅を行います。StepOneソフトウェアのデフォルトパラメータによって決定され、増幅曲線の確認によって検証された閾値のサイクル数から、相対発現量を算出します。茎のさまざまな位置から採取した葉より単離したDNAのPCR増幅により、誘導条件下で植物を育成した場合、line insertion sequence（LIS 1）と呼ばれる5.7 kilobaseのシングルコピーDNA断片が出現することが示されます。LIS 1は、PLを低栄養の誘導条件下で育成したときに出現し、最終的にホモ接合体となります。ここでは、播種後、サンプル1を最古として1週間間隔でサンプル1から6までの葉を採取し、その後、これらのサンプルからDNAを抽出しました。PCR増幅により、最初のサンプルを除き、すべてのサンプルにLAS oneの両末端が存在することが明らかになりました。これは、unins挿入部位の消失、および5枚目の葉のQPCRでその痕跡が認められなかったことと一致します。結果から、LAS oneの存在または誘導に伴うその他のゲノム変化が、LAS oneの直近にある遺伝子の発現に影響を与えることが示されました。ここで示した6つの遺伝子はすべて、PLとSで差次的に発現しています。4つの遺伝子は、LIS1を持たないPLでより高く発現しています。逆に、2つの遺伝子はLIS1を持つSでより高く発現しています。以上で、誘導性フラックス系統の育成方法について説明しました。このように、ゲノムは成長環境に応じて変化し、次世代の成長特性に影響を与えます。この手順を行う際は、変化を再現性よく誘導するために、成長条件を正確に複製することが重要であるという点に留意してください。以上です。多くの方がこの現象に懐疑的であることは承知していますが、これで皆さんご自身で観察結果を再現できるはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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