環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝

この手順の全体的な目的は、遺伝可能なゲノム変異が生じる条件下で、誘導性の亜麻品種を栽培する方法を実演することです。さらに、ゲノムの変化をモニタリングし、誘導された植物の次世代以降の成長をさまざまな環境下で観察します。これを達成するため、亜麻をさまざまな誘導条件下で栽培します。

その後、さまざまな環境下で植物を成長させ、異なるタイミングで葉とMarisの茎組織を採取します。次に、組織サンプルからDNAおよびRNAを単離します。手順の最終ステップとして、DNAサンプルを用いてPCRを、単離したRNAを用いてQ-R-T-P-C-Rを行い、異なる環境条件下での成長によって生じたゲノム変化および遺伝子発現変化を特定します。

最終的に、処理した植物の組織から単離した核酸を用いてPCRおよびR-T-P-C-Rを行うことで、ゲノム上の特定の位置におけるLIS one挿入要素の出現と、その要素の存在に関連する発現差を可視化し、成長条件に対するゲノム応答を示す結果を得ることができます。こんにちは、ケース・ウェスタン・リザーブ大学生物学部のクリス・カルです。カル研究室のコリ・ジョンソンです。

私はティファニー・モス、同じくカル・ラボの所属です。そして私はマーシャル・ルーカスです。カル・ラボの学部生向け夏季研究プログラムに参加している学部生です。

当研究室では、成長環境の変化に伴うゲノムおよび遺伝子発現の変化を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。誘導条件下で亜麻を栽培するため、まず5インチのポットに土を満たし、軽く固めます。

次に、1つのポットにつき3粒の亜麻種を、深さ1/4インチに植えます。次に、非誘導コントロール条件のため、種子の上の土を覆います。1/10濃度のMiracle-Gro溶液100 millilitersで植物に灌水します。

高栄養条件下の植物に、フルストレングスのMiracle growを100 milliliters投与します。最後に適用します。

低栄養植物には水道水のみを供給します。夏季は、植物の成長に合わせて自然光の下で栽培してください。すべての植物に対し、自動スプレーシステムを用いて1日2回、5分間灌水します。

週に1回、植物に成長条件を適用します。1週間おきに葉と主茎を採取します。DNA抽出用に6枚の葉を、RNA抽出用に3本の主茎を採取し、採取後、植物材料をクライオバイアルに入れ、液体窒素で急速凍結させ、抽出まで−80°Cで保存します。

これら3つの遺伝子型は、条件に応じて異なる相対成長速度を示します。対照条件下では、純系亜麻品種のStormまたはPL系統が最も良好に成長します。この親系統から複数の系統が派生しており、大粒（L）品種は小粒（S）品種よりも生育旺盛です。

しかしながら、低栄養条件下では、SはLまたはplよりも良好に成長します。また、高栄養条件下では、Lはplよりも良好に成長し、plはSよりもわずかに良好に成長します。3つの異なる処理条件下で育成した各系統を比較すると、PLはコントロール条件下で最も良好に成長することがわかります。Lは高栄養条件下で最も良好に成長し、Sは高栄養条件とコントロール条件の両方で同様に成長します。

これらのデータは、3つの系統が3つの環境下での成長に基づいて区別できることを示しています。PLおよびLは特定の環境下でより良好に成長しますが、Sは3つの条件すべてにおいてほぼ同様に成長します。Sは栄養条件の改善を利用することはできませんが、非常に低い栄養条件下ではより良好に成長することができます。

DNA抽出を行うには、Qiagen社のDNeasy Plant DNA Prep Kitに含まれるバッファーAP1を、滅菌済み砂を入れたマイクロ遠心チューブ内の葉6枚に加えます。マイクロペッスルを用いて、塊が見えなくなるまで組織を研磨します。その後、キットの指示に従って抽出を継続してください。RNA抽出を開始するには、保存用クライオバイアルからMarisの茎3本と周囲の葉を数枚、マイクロ遠心チューブに移します。チューブに滅菌済み砂を加え、マイクロペッスルを用いて組織が微細になるまで研磨します。

サンプルの溶菌を促進するため、15秒間ボルテックスした後、13,000 RPMで1分間遠心分離し、砂および不純物を回収します。SNATをスピンカラムに加え、メーカーの指示に従ってRNA調製を続けます。組織からRNAを抽出後、RNAサンプル量の10分の1量の10 XDNAバッファーを反応液に加えます。

D Nsを30 units添加し、反応液を37 °Cで30分間、続いて70 °Cで5分間インキュベートします。Applied Biosystems RNA to cDNA kitを用いて逆転写を行います。製造元の指示に従い、反応液を37 °Cで1時間、その後95 °Cで5分間インキュベートします。

最後に、収量を決定するために、5 µLのcDNAを1.5%アガロースゲルで電気泳動します。亜麻のcDNAが調製されたら、それをqPCRに使用します。qPCRはABI StepOneシステムを用いて実施してください。

各ランにおいてすべての測定を3回繰り返し、コピー数コントロールとしてハウスキーピング遺伝子のActinを用い、qPCR用の反応液を調製します。各チューブに適切なプライマーペアを1 µL加えます。CD DNAを適切な濃度に希釈し、各チューブに9 µL加えます。

最後に、各チューブに2倍濃度のcyberg green PCR master mixを10 µL加えます。次に、増幅プログラムを設定し、増幅を行います。StepOneソフトウェアのデフォルトパラメータによって決定され、増幅曲線の確認によって検証された閾値のサイクル数から、相対発現量を算出します。

茎のさまざまな位置から採取した葉より単離したDNAのPCR増幅により、誘導条件下で植物を育成した場合、line insertion sequence（LIS 1）と呼ばれる5.7 kilobaseのシングルコピーDNA断片が出現することが示されます。LIS 1は、PLを低栄養の誘導条件下で育成したときに出現し、最終的にホモ接合体となります。ここでは、播種後、サンプル1を最古として1週間間隔でサンプル1から6までの葉を採取し、その後、これらのサンプルからDNAを抽出しました。

PCR増幅により、最初のサンプルを除き、すべてのサンプルにLAS oneの両末端が存在することが明らかになりました。これは、unins挿入部位の消失、および5枚目の葉のQPCRでその痕跡が認められなかったことと一致します。結果から、LAS oneの存在または誘導に伴うその他のゲノム変化が、LAS oneの直近にある遺伝子の発現に影響を与えることが示されました。

ここで示した6つの遺伝子はすべて、PLとSで差次的に発現しています。4つの遺伝子は、LIS1を持たないPLでより高く発現しています。逆に、2つの遺伝子はLIS1を持つSでより高く発現しています。以上で、誘導性フラックス系統の育成方法について説明しました。このように、ゲノムは成長環境に応じて変化し、次世代の成長特性に影響を与えます。

この手順を行う際は、変化を再現性よく誘導するために、成長条件を正確に複製することが重要であるという点に留意してください。以上です。多くの方がこの現象に懐疑的であることは承知していますが、これで皆さんご自身で観察結果を再現できるはずです。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。