環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝
January 26th, 2011
ゲノムと表現型変異のサブセット内にゲノム変異の栄養ストレスの結果の下にある亜麻の品種を育てる。特定のサイトでの複雑な挿入は、様々な栄養素体制の下で成長したとこのサイトの周り遺伝子発現の変化と関連付けられています。
この手順の全体的な目標は、遺伝性のゲノム変異をもたらす条件下で誘導性亜麻仁変種を成長させる方法を実証することです。さらに、ゲノム変化が監視され、誘導された植物の次の世代の成長がさまざまな環境下で観察されます。これを達成するために、亜麻はさまざまな誘導条件下で栽培されます。
その後、葉とマリスの茎組織は、さまざまな環境下での植物の成長中のさまざまな時期に収集されます。次に、組織サンプルからDNAとRNAを単離します。手順の最後のステップは、DNAサンプルを使用してPCRを実行し、単離されたRNAを使用してQ-R-T-P-C-Rを実行して、さまざまな環境条件下での増殖に起因するゲノム変化と遺伝子発現の変化を特定することです。
最終的には、ゲノム内の特定の点にLIS1挿入エレメントが出現することによる成長条件に対するゲノム応答、および処理された植物の組織から単離された核酸を用いて行われるPCRおよびR-T-P-C-Rによって視覚化されるそのエレメントの存在に関連する発現の違いを示す結果を得ることができる。こんにちは、ケース・ウェスタン・リザーブ大学生物学部のクリス・カルです。私はカルラボのコリー・ジョンソンです。
そして、私はティファニー・モスで、同じく淘汰研究所の出身です。そして、私はマーシャル・ルーカスです。カル研究所での学部研究のためのサマープログラムの学部生。
当研究室では、この手順を用いて、生育環境の変化によるゲノムや遺伝子発現の変化を研究しています。それでは始めましょう。誘導条件下で亜麻を育てるには、5インチの鉢に土を入れて固めることから始めます。
次に植える、ポットごとに3つの亜麻の種子、4分の1インチの深さ。次に、非誘導制御条件のための種子の上の土壌から。100ミリリットルの10分の10強度の奇跡の解決策で植物に水をやります。
高栄養条件下で植物を100ミリリットルの全強度で処理します。奇跡が成長します。最後に適用します。
水道水は栄養価の低い植物のみ。植物が成長するにつれて、夏の間、自然光の下で植物を育てます。1日2回、5分間の自動スプレーシステムですべての植物に水をやります。
週に一度、植物に成長条件を適用します。毎週おきに葉をマリの茎に集めます。DNA抽出には6枚の葉を採取し、採取後のRNA抽出には3本のme茎を採取し、植物材料をクライオバイアルに入れ、液体窒素で急速凍結し、抽出するまでサンプルをマイナス80°Cで保存します。
3つの遺伝子型は、条件に応じて異なる相対速度で成長します。制御条件下では、近交系の亜麻品種ストームまたはPL系統が最もよく成長します。この親からいくつかの系統が派生し、大型またはLの品種は小型またはSの品種よりも活発です。
ただし、低栄養素では、SはLまたはplよりもよく成長します。そして、高栄養条件下では、Lはplよりもよく成長しますが、PLはS.Aよりもわずかに良く成長します。3つの異なる処理の下で成長した各系統を比較すると、PLは制御条件下で最もよく成長することが明らかになります。Lは高栄養条件下で最もよく成長し、Sは高栄養条件と制御条件の両方で同様に成長します。
これらのデータは、3つのラインが3つの環境下での成長に基づいて区別できることを示しています。PLとLは特定の環境下でよりよく成長しますが、Sは3つの条件すべてでほぼ同じように成長します。Sは改善された栄養条件を利用することができませんが、非常に低い栄養条件下ではよりよく成長することができます。
DNA抽出には、QiagenからのAP1、DNEZ植物、DNA調製キットを6枚の葉に加え、マイクロフュージチューブに滅菌砂を入れ、塊が見えなくなるまでマイクロ乳がんで組織を粉砕します。キットの指示に従って抽出を続行し、RNA抽出、3つのマリスステム、および保存用クライオバイアルからマイクロフュージチューブへの周囲の葉の転写を開始します。滅菌砂をチューブに加え、マイクロベイトルを使用して組織を細かく粉砕します。
サンプルを 15 秒間ボルテックスして溶解を補助し、その後 13 、 000 RPM で 1 分間回転して砂や破片を収集します。SNATをスピンカラムに加え、製造元の指示に従ってRNA調製を続行します。組織からRNAが抽出されたら、RNAサンプル量の10分の1の10のXDNAバッファーを反応に移します。
そして、30ユニットのDNで、反応を摂氏37度で30分間インキュベートし、続いて摂氏70度で5分間インキュベートします。Applied Biosystems RNA to CD NAキットを用いて逆転写を行います。メーカーとSの指示に従って、反応を摂氏37度で1時間インキュベートし、次に摂氏95度で5分間インキュベートします。
最後に、1.5%AROSゲル上で5マイクロリットルのCDNAを泳動し、収率を測定します。亜麻CD NAが調製されたら、QPCRに用います。A BI Step one システムを使用して QPCR を実行します。
各ランですべてのアッセイをトリプリケートで実施し、ハウスキーピングのGene Actonをコピー数コントロールとして使用して、QPCRの反応を調製します。各チューブに適切なプライマーペアを1マイクロリットル追加します。CD NAを適切な濃度に希釈し、各チューブに9マイクロリットルを追加します。
最後に、2 x cyberg green PCR master mix を 10 マイクロリットルずつ各チューブに加えます。次に、増幅に続いて増幅プログラムを設定します。ステップ1ソフトウェアのデフォルトパラメータによって決定され、増幅曲線の検査によって確認されるしきい値のサイクル番号から相対的な発現レベルを計算します。
茎に沿ったさまざまな位置の葉から単離されたDNAからのPCR増幅は、植物が誘導条件下で成長した場合、5.7キロベースの単一コピー、ライン挿入配列と呼ばれるDNA断片、またはLIS1の出現を示しています。LIS1は、PLが低栄養誘導条件下で成長され、最終的にホモ接合体になると現れます。ここは。葉のサンプル1から6は週間隔で単離され、サンプル1は縫合後に最も早いものとなり、その後、サンプルからDNAを抽出しました。
PCR増幅により、最初のサンプルを除くすべてのサンプルにLASの末端が1つあることが明らかになります。これは、uninに挿入された部位の消失と一致し、5番目の葉のQPCRによるその証拠はありません。結果は、誘導に関連するLASの1つまたは他のゲノム変化の存在が、Sの遺伝子のすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与えることを示しています。
ここに示されている6つの遺伝子はすべてPLで差次的に発現しており、Sの4つの遺伝子はPLでより高い発現を持っていますが、これはLISの発現を持っていません。逆に、2つはSでより高い発現を持ち、LISは1つあり、誘導性亜麻仁の線を育てる方法を紹介しました。そのため、ゲノムは生育環境やその後の世代の生育特性に応じて変化します。
この手順を実行するときは、変化の再現性のある誘導のために成長条件を再現する必要があることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。あなた方の多くがこの現象に懐疑的であることは承知していますが、今、あなた方自身で観察結果を再現することができます。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この研究は、ゲノム変異を誘導するために栄養ストレス下で亜麻品種を育てる方法を実証します。この研究は、亜麻植物における特定のゲノム変化と表現型反応の関連性を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物遺伝学
- ゲノム変異
- 表現型分析
背景
- 亜麻品種は、様々な栄養条件下で異なる成長反応を示します。
- ゲノム変異は、植物の表現型変化につながる可能性があります。
- これらの変異を理解することで、農業実践に情報を提供できます。
- この研究は、成長適応におけるLIS one挿入要素の役割に焦点を当てています。
研究目的
- 栄養ストレスが亜麻のゲノム変異に与える影響を調査すること。
- 世代を超えてゲノムと遺伝子発現の変化を監視すること。
- 異なる条件下での成長に関連する特定のゲノム要素を特定すること。
使用された方法
- 制御された栄養条件下で亜麻を育てること。
- 分析のために葉と茎の組織サンプルを収集すること。
- 植物組織からDNAとRNAを分離すること。
- ゲノムと発現の変化を評価するためにPCRとQ-R-T-P-C-Rを実行すること。
主な結果
- 異なる栄養条件下で亜麻品種にゲノム変異が観察されました。
- LIS one挿入要素が成長適応の重要な要因として特定されました。
- 異なる亜麻系統は、栄養素の利用可能性に基づいて様々な成長速度を示しました。
- 表現型反応は特定のゲノム変化に関連付けられました。
結論
- 栄養ストレスは亜麻に重要なゲノム変異を誘導する可能性があります。
- これらの変異を理解することで、作物の耐性を高めることができます。
- この知見は、植物適応メカニズムの幅広い知識に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Environmentally induced heritable genomic changes in flax provide a model for understanding how stress conditions can drive stable, inheritable phenotypic and molecular variation. This system enables the interrogation of stress-responsive genomic elements and their transmission, informing predictive confidence in trait stability across generations. Such insights are strategically relevant for early discovery and translational research pipelines focused on adaptive mechanisms and epigenetic inheritance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stress-induced genomic elements for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by linking environmental triggers to heritable genomic changes.
- Facilitates predictive confidence in trait inheritance and stability across generations.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for monitoring genomic and expression changes under defined conditions.
- Enables reproducible detection of insertion events and associated gene expression via PCR and QRT-PCR.
- Supports assay standardization for quantifying heritable molecular responses to environmental stress.
Translational & Preclinical Research
- Offers a model for studying the continuity of stress-induced genomic changes from discovery through preclinical validation.
- Aligns with translational biomarker strategies by linking molecular events to phenotypic outcomes.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on heritable trait predictability.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing on environmental induction, mechanistic de-risking, and trait transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the induction and inheritance of genomic changes under stress.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative PCR-based outputs for insertion detection and gene expression profiling.
- Analytics: Provides measurable readouts for comparing genotypes and environmental responses.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of heritable adaptation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying environmentally induced heritable changes in other systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in the stability and inheritance of stress-induced genomic changes.
- Operational Value: Standardizes protocols for reproducible induction and detection of genomic events.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions based on heritable trait predictability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adaptive trait programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and nucleic acid analysis.
- Needs access to PCR, QRT-PCR, and sample storage infrastructure.
- Demands rigorous replication of growth conditions for reproducibility.
- May require adaptation for use in other plant or model systems.
- Dependent on the ability to monitor both genomic and expression changes in parallel.
