Name: 振動プローブによる生体電気の電流の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ振動プローブを用いた生体電流の非侵襲的測定法。金メッキステンレス製プローブの製造・校正から生物試料の電流測定まで、高感度・高S/N比の手法で創傷治癒や発生研究に応用する。

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我々は教授のリチャードBorgens、振動プローブシステムを組み立てるに助け麻痺の研究、パデュー大学、センターに感謝しています。この研究は、MZとBRに、そして一部の再生医療研究所カリフォルニアRB1 - 01417、NSF MCB - 0951199、からの補助金によって、失明を防ぐための研究からUnrestrictedグラント、カリフォルニア大学デ​​ービス校の眼科でNEIの助成金NIH 1R01EY019101によってサポートされていました。

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li>
<li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+rat+cornea%3A+the+role+of+electric+currents%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li>
<li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li>
<li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation%3A+an+additional+factor+in+secondary+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li>
<li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Derm%22%5BJournal%5D)">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li>
<li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ.</a> 442, 457-460 (2006).</li>
<li>Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li>
<li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics+Supplement%22%5BJournal%5D)">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+mechanisms+in+regeneration%3A+Unique+aspects+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は低コスト、基本的な、しかし生物系の様々な非侵襲的に電流を測定するための高感度な振動プローブシステムを説明します。 可能な限り修正<ol><li>プラチナ/イリジウム電極（世界の精密機器、猫＃PTM23B20が）場合、ステンレス鋼の代わりに使用されている、その後、金めっきの段階を排除することができます。 </li></ol>アプリケーション我々は、で電流を測定するために振動プローブを使用している：ラットの角膜2、ラットのレンズ3,4、マウスの皮膚5、 アフリカツメガエルのオタマジャクシ6、人間の皮膚7、人間の角膜8;ゼブラフィッシュ胚1、細胞性粘菌1、ラットの脳1。振動プローブは、最初のジャフとNuccitelli 9によって記述されていた。二次...

<table><tbody><tr><td>Eligoyステンレス電極</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SSM33A70</td><td>76 mm, 7 M&amp;#937;, 1-2&amp;#x03BC;m チップ</td></tr><tr><td>ゴールドR30コネクタ</td><td>www.vectorelect.com</td><td>R30</td><td>再利用可能</td></tr><tr><td>銀充填エポキシ</td><td>3M</td><td>SL65</td><td>樹脂1部と硬化剤1部を混合</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>SZ40</td><td>倍率 x6 〜 x40</td></tr><tr><td>ジシアノ金酸カリウム (KAu(CN)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379867</td><td>注意：毒性あり</td></tr><tr><td>塩化白金酸水和物 (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PtCl&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; x 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520896</td><td>注意：毒性あり</td></tr><tr><td>酢酸鉛(II)三水和物 (Pb(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185191</td><td>注意：毒性あり</td></tr><tr><td>ナノアンペア電源</td><td>自製</td><td>－</td><td>1.5 V (AAA) 電池 6本で駆動</td></tr><tr><td>3次元マイクロポジショナー</td><td>Line Tool Co.</td><td>Model H</td><td></td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>デジタルI/Oインターフェース</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6220</td><td></td></tr><tr><td>BNC接続付きシールドコネクタブロック</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Strathclyde電気生理学ソフトウェア</td><td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td><td>WinWCP V4.1.5</td><td>無料ダウンロード： &lt;a href=&quot;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>キャリブレーションチャンバー</td><td>自製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定電流キャリブレータ</td><td>Vibrating Probe Company</td><td></td><td>9 V (PP3) 電池 1本で駆動</td></tr></tbody></table>

振動プローブによる生体電気の電流の測定

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

イオンの能動輸送によって生成された電場は、、多くの生物系に存在し、多くの場合、組織や臓器の重要な役割を果たします。例えば、彼らは、創傷治癒中に細胞遊走を誘導する上で重要な役割を果たします。ここでは、細胞外の電流を測定するための超高感度振動プローブの製造と使用について説明します。プローブは、生理食塩水でμA/ cm 2の範囲でイオン電流を検出できる小型の白金黒の先端（30〜35ミクロン）、との絶縁、尖った金属線です。プローブは、圧電ベンダーによって約200 Hzで振動する。イオン電流の存在下では、プローブはその運動の両極端の間の電圧差を検出する。ロックイン振動のプローブの周波数にロックすることで外部ノイズ増幅器出力フィルタ。データはコンピューターに記録されます。プローブは、正確に1.5μA/ cm 2の電流を適用するチャンバーを使用して、適切な生理食塩水での実験の開始時と終了時に較正されています。我々は、プローブを作るシステムを設定し、キャリブレーションする方法について説明します。我々はまた、角膜の測定の手法を明らかにし、別の標本（角膜、皮膚、脳）からいくつかの代表的な結果を示す。

様々な生物学的システムにおける生体電流を測定する非侵襲的な振動プローブの製造、キャリブレーションおよび使用が記載されている。

イオンの能動輸送によって生じる電場は、多くの生物学的システムに存在し、組織や器官においてしばしば重要な機能を果たしている。

このビデオでは、生物試料からの生体電気電流を測定するために使用される振動電極の作製および使用手順について解説します。まず、ステンレス製のブランク電極の先端に金を電気メッキして電極を作製します。その後、周波数や位相角などの白金電極の設定を決定し、電極の校正を行います。その後、目的のサンプルから測定を行い、生物学的サンプルによって生成され、その周囲を流れる生体電気電流の特性を明らかにするデータを取得します。既存の手法に対するこの手法の主な利点は、非侵襲的で感度が高く、S/N比が高いことです。この手法は、創傷電界がどのように細胞を刺激して創傷治癒を促進するかなど、医学分野における重要な疑問に答えることができます。生体電気を測定するための振動プローブを製作するため、まずはWorld Precision Instruments社からブランクプローブを購入します。まず、先端から25～30 mm後ろでプローブをカットし、11番メスを用いて、カットした端から約5 mmのパラリン絶縁被覆を削り取り、確実に接続できるようにします。次に、導電性銀充填エポキシ樹脂を使用して、プローブをゴールド R 30 コネクタに取り付けます。エポキシを翌日まで硬化させるため、プローブを室温で一晩保存します。プローブチップに金、次いで白金をコーティングします。そのために、まずプローブチップをアセトンで洗浄し、ナノアンペア電源のマイナス出力に接続します。次に、プローブを解剖顕微鏡の下に置き、金メッキ溶液に入れます。正極出力に接続され、溶液内に配置された参照電極によって回路が完成します。5 nAの電流を5分間流し、その後、先端が目的とする最終サイズの約半分になるまで、電流を20 nAに上げます。次に、プローブチップを蒸留水で洗浄し、電解液に浸します。250 nano ampsの電流を5分間流し、その後、チップが目的の最終サイズの約80%になるまで電流を500 nano ampsに上げます。さらに電流を1 micro ampに上げ、最終的なチップ径が30 to 35 micrometersになるまで、1秒間のパルス状に電流を印加します。最後に、チップをすすぎます。蒸留水プローブは室温で無期限に保存可能です。それでは、作製したプローブシステムを確認しましょう。プローブをピエゾ電気ベンダーに取り付けます。3次元マイクロポジショナーにプローブが装着されています。振動は振動プローブ電源によって制御され、この電源で振動、振幅、および周波数の調整も可能です。プローブ電源はロックインアンプリファイアに参照信号を送信し、ロックインアンプリファイアは振動周波数と位相角を表示します。アンプリファイアはアナログ・デジタルインターフェースを介してコンピュータに接続されています。データは、Strat Clyde Electrophysiologyソフトウェアのホールセルプログラムを用いて記録します。ロックインアンプおよび電気生理学ソフトウェアの設定については、本プロトコルの記述部分を参照してください。それでは、新しいプローブのセットアップ方法を確認しましょう。新しいプローブを使用するには、まずテストを行い、固有の周波数と位相角を決定する必要があります。新しいプローブと参照電極およびアース線を、生理食塩水が入った校正室内に配置します。電源を入れ、最大振動が観察されるまで周波数を上げます。これがプローブの共振周波数となります。この共振周波数でプローブを使用すると、記録に不安定性やノイズが生じる可能性があります。そのため、共振周波数から10 hertzを減算して、プローブの動作周波数を設定します。プローブの振動距離がチップ径と同じになるように、振動振幅を調整してください。このように、プローブを振動させると、プローブ先端の二重像が見えます。位相角を決定するには、キャリブレーションチャンバー内の生理食塩水にプローブを浸し、1.5 microamps per centimeter squaredの電流を印加します。応答がなくなるまで、ロックインアンプの位相角を繰り返し調整してください。90度を加算または減算することで最大応答が得られ、この角度がプローブの動作位相角となります。実験中は、周波数、位相、角度、および振幅のこれらの設定を変更しないことが重要です。変更するとプローブの応答に影響を及ぼすためです。なお、南から北へ流れる電流は、上方向の偏向を生じさせます。北から南へ流れる電流は下向きに偏向することになります。校正チャンバー内でプローブに印加された正確に 1.5 microamps per centimeter squared の標準電流に対するプローブの応答を用いて、試料測定前の試料中の電流を算出します。その後、適切な溶液中でプローブを校正し、実験終了時には使用した溶液で再びプローブを校正することで、蒸発による浸透圧の変化を補正します。データを分析する際は、実験の前半の測定値は開始時の校正値を用いて算出し、後半の測定値は終了時の校正値を用いて算出します。サンプルの測定には、サンプルを保持し、かつ可動させるように設計されたチャンバーを使用します。例えば、角膜の測定では、眼球を固定するためのワイヤーループを備えたペトリ皿を使用します。サンプルを測定するには、生理食塩水を入れた皿を解剖顕微鏡の下に置き、サンプルの測定対象領域を視野内に配置します。次に、プローブを試料表面と平行になるように溶液中に配置し、測定対象となる試料上の点と同じ高さになるようフォーカスを合わせます。プローブを試料から約1cm離し、コンピューターソフトウェアで記録しながら振動を開始させ、安定したベースラインを確立します。その後、プローブを表面から約50 µmの測定位置まで移動させます。新しいピーク値が安定したら、プローブをリファレンス位置に戻します。すると、トレースはベースラインに戻ります。この操作を一定の時間間隔で繰り返すことでタイムラプスデータを取得したり、サンプルをわずかに移動させて異なる位置で測定を行ったりすることができます。ここからは、TE空間電流マッピングデータの代表的な結果を示します。この角膜創傷の電流プロファイルは、創傷縁で最大電流が流れていることを示しています。タイムラプスデータは、皮膚創傷における電流変化の時間経過を示しています。赤点は、創傷前後の電流を示しています。一過性の内向き電流が発生し、その後、外向き電流へと反転します。ラット脳の測定では、嗅球で外向き電流が、側脳室で内向き電流が観察されます。ここでは、この処置後の角膜創傷における電流の空間マッピングを示します。選択的マイクロ電極などの他の手法を用いることで、電流の発生後、どのESが電流の伝導を担っているかといった追加の疑問を解明することができます。この技術は、医学研究分野の研究者が、創傷治癒、胚発生、および脊髄損傷を研究するための道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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