Name: ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶウェスタンブロッティングの標準プロトコル。サンプル調製から電気泳動、膜転写、抗体プローブまでの一連の手順を解説。高品質な試薬を使用することで、感度と再現性の高いタンパク質検出を実現する方法を紹介します。

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1。サンプル準備ウエスタンブロット法の最初のステップは、サンプルの準備です。ゲルの細胞や組織を実行するためのサンプルを準備するには、目的のタンパク質を解放するために溶解する必要があります。 <ul><li>汎用性と可溶性タンパク質の抽出のために使いやすい、便利、すぐに使用できる試薬はCytoBusterまたはPhosphoSafeです。これらの抽出バッファーには、哺乳類と昆虫細胞から可溶性タンパク質を効率的に抽出するために最適化された洗剤を含まれています。 CytoBusterのタンパク質抽出試薬の穏やかな、非イオン性組成物は、超音波処理や凍結/融解などの二次治療を必要とせずに機能的に活性な内因性または発現タンパク質の分離を可能にします。 PhoshoSafeは、4つのホスファターゼ阻害剤を含む付加的な利点を持っています。 <ol><li>低速の遠心分離（2500 xgで例えば5分）により細胞をペレット化は、よく細胞ペレットを排出。 </li><li> 10 6細胞（CytoBusterのタンパク質抽出試薬の最適量は、セルサイズに基づいて異なる場合があります）あたり150μLを使用してCytoBusterのタンパク質抽出試薬で細胞を再懸濁します。 </li><li> 5分間室温でインキュベートする。 </li><li>適切なチューブに移し、4℃で16000 × gで5分間スピン℃に</li><li>転送は、新しいチューブに（細胞抽出液）上清をクリアし、分析を進める。 </li></ol></li><li>特殊なタンパク質の抽出には、我々は高品質のプロテオキットを使用することをお勧めします。 EMDは、ミトコンドリアの分離、細胞内プロテオームの抽出、膜貫通タンパク質の抽出、および他の多くのためのダース以上のキットを持っています。詳細については、私たちのウエスタンブロットのランディングページをご覧ください。 </li><li> EMDはまた、プロテアーゼやホスファターゼ阻害剤のカクテルセットを幅広く販売しています。とすぐに溶解が発生すると、タンパク質分解、脱リン酸化し、変性が始まります。これらのイベントのサンプルは氷上または4℃で保管している場合は途方もなく遅くすることができます·すべての時間と適切な阻害剤でのCは、溶解バッファーに新鮮な追加されます。詳細については、私たちのウエスタンブロットのランディングページをご覧ください。 </li></ul> 2。 SDS - PAGE ウエスタンブロット法の第二段階は、タンパク質の分離です。タンパク質は分子量に基づいて分離されている。 <ul><li>あなたがあなた自身のPAGEゲルを作ることができる、しかし我々は市販のプレキャストゲルを使用することになります。 <ol><li>あなたのサンプルを準備した後、タンパク質濃度を決定する準備が整いました。 EMDの濃度を測定するには、このための2つのキットを持っており、一つは非干渉タンパク質アッセイキットおよびBCAタンパク質アッセイキットであることその他のであること。 </li><li>タンパク質濃度が評価されると我々は、ゲルをロードするための我々のサンプルを準備する準備が整いました。抗体は通常、目的のタンパク質の小さな部分（エピトープと呼ばれる）を認識し、このドメインは、タンパク質の立体構造内に存在していてもよい。この部分に対する抗体のアクセスを有効にするには、それはタンパク質を展開する必要があります。 </li><li>変性させ、アニオン変性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）とローディング緩衝液を使用し、5分間95〜100℃で混合物を沸騰。使いやすく、便利なローディングバッファーには、4Xサンプルバッファーです。 </li></ol></li><li>トレイルミックスのタンパク質マーカーとよく最初の車線をロードする。このマーカーは、電気泳動を監視できるようにする3つの基準バンドを持っています。ゲルを染色されると、10バンドは10から225 kDaのからまで表示されます。 </li><li>バッファを実行して電気泳動ユニットを埋める。 PAGEゲルの場合、これは通常1Xトリス - グリシンです。詳細なバッファのレシピの場合は、ウェスタンブロッティングのページをご覧ください。 EMDは、私たちのOmniPur化学ラインで高品質のバッファの試薬を提供しています。 1時間220Vでゲルを実行します。 </li><li>タンパク質が分離した後、蛋白質が均等にかつ均一に移行したことを確認するために、クマシーブルーでゲルを染色。 RAPIDstainのに使える準備ができている超高感度の染色です。いいえ脱色は必要ありません。 </li></ul> 3。タンパク質の転送電荷を持つタンパク質が電界のゲルを通過するように誘導することができるのと同じように、タンパク質はPVDFまたはニトロセルロースのいずれかである、メンブレン上にゲルから電気的なフィールドで転送することができます。 <ul><li>今日は、ウェットの転送を行います。ウェット転送では、ゲルとメンブレンはスポンジと紙の間に挟まれている（スポンジ/紙/ゲル/メンブレン/紙/スポンジ）とすべてがない気泡はゲルとメンブレンの間に形成されている確認した後、しっかりと一緒にクランプされています。サンドイッチは、電界が印加される転写バッファーに浸漬される。負に帯電したタンパク質は、正に帯電した電極に向かって移動するが、膜はそれらを停止し、それらを結合する、との継続からそれらを防ぐことができます。 </li><li>膜の2種類が用意されています：ニトロセルロースおよびPVDF。どちらも動きます。今日は、PVDFを使用することになります。 PVDF膜は、メタノに浸かっRequireの5分間氷冷転送バッファに続いて数分の場合はl、。ゲルはまた、氷冷転送バッファの数分間平衡化する必要があります。そうしないと、転送中にゲルを減少することもあります。 </li><li>ウェット転送用バッファは、20％メタノールで1Xトリス - グリシンです。詳細なバッファーの調製は、当社のウェブサイトで入手できます。 </li><li>転送が完了したら、それは決して、エアポケットに転送さえ確保するためにタンパク質を可視化することをお勧めします。これは簡単にステインレッドアラートウエスタンブロットで行うことができます。この染色は、に使用準備ができており、脱色は水で簡単に行うことができます。 </li></ul> 4。抗体およびアクセサリの試薬<ul><li>抗原にプロービングし、抗体を行う最初のステップは、メンブレンをブロックすることです。メンブレンをブロックすると、非特異的バックグラウンドの結合を防ぎます。 </li><li>無脂肪牛乳やBSAのどちらかをブロッキング溶液として使用することができます。しかし、リン酸化特異的抗体を使用するとき、それは高いバックグラウンドの原因となるので、ミルクを使用することは推奨されません。 </li><li> EMDは、準備される非哺乳類遮断剤とブロットQuickBlockerであるSeaBlock、、など、いくつかの高品質なブロッキング試薬は、ブロッキング剤の使いすぐに提供しています。我々はまた、高品質のBSA（フラクションV）を利用している。 <ol><li>穏やかに撹拌しながら室温で膜1時間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、TBSTまたはPBSTで3回洗浄する。 TBSTまたはPBSTを作るのは簡単で便利な方法は（PBS TWEEN錠/ TBS TWEEN錠）私たちの錠剤を使用することです。 </li></ol></li><li>膜がブロックされたら、一次抗体とインキュベートする準備が整いました。 EMDは30年以上にわたって業界で最高の抗体の保証と例外的な抗体の包括的なポートフォリオを提供してきました。すべてのEMDの抗体を用いて、我々が100％リスクのない保証を提供することを忘れないでください。抗体を購入し、あなたが望むあらゆる種の特異性やアプリケーションのためにそれを使用してください。抗体は、あなたの満足に動作しない場合は、我々は、他の製品で使用される完全な信用を提供します。詳細については、私たちのウェスタンブロッティングのWebページをご覧ください。 <ol><li>今日、我々はSignalBoostの溶液1を使用して私たちの一次抗体をインキュベートされます。 SignalBoostは、信号が大幅に強化できるように偉大な製品です。単に解決方法1で一次抗体をインキュベートし、1時間または通常どおりインキュベートする。さらにブロッキング剤を追加する必要はありません。代わりに、ブロッキング剤としてBSAや脱脂粉乳を使用することができます。 </li><li> TBSTで洗浄する。我々は、既製溶解するTBSTのタブレットを使用してTBSTを行います。 </li><li> SignalBoostの溶液2を使用して、二次抗体をインキュベートする。 1時間をブロッキングバッファーで二次抗体をインキュベートする。 TBSTで再び数回膜を洗浄してください。 </li></ol></li></ul> 5。検出 HRPコンジュゲート二次抗体の場合、ECLは、伝統的に使用されます。私たちが提供する優秀なECL試薬はRapidStepです。 RapidStepの利点は、管腔またはエンハンサーのないミキシングが必要ないことです。単純に膜を数回スプレーし、X線フィルムを使用して開発する。 RapidStepは、基質の添加後2時間までに低ピクトグラムの感度だけでなく、発光光を提供しています。

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

作家アンナEslamiとジェシールハンは、この記事で使用する試薬や器具を生産するEMDケミカルズ社によって採用されています。

このビデオプレゼンテーションでは、我々は、サンプル調製、SDS - PAGE、抗体、および検出とブロッキング/プロービング膜であるウエスタンブロット法の主な手順を強調している。プロセスの各ステップについては、適切なプロトコルと適切な試薬は、高品質な結果を達成するために使用する必要があります。

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; タンパク質抽出試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; 抽出試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>非干渉性タンパク質定量アッセイ&amp;#8482; キット</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCAタンパク質定量キット </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDSサンプルバッファー </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;ウェスタンブロッティングは、組織ホモジネートまたは抽出物のサンプル中から特定のタンパク質を検出するために用いられる分析手法である。本手法では、ゲル電気泳動を用いて、ポリペプチドの長さ（変性条件下）またはタンパク質の三次元構造（天然／非変性条件下）に基づいて、天然または変性タンパク質を分離する。その後、タンパク質をメンブレン（通常はニトロセルロースまたはPVDF）に転写し、標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブ（検出）を行う。&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>トレイルミックス&amp;#8482; タンパク質マーカー</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>タンパク質&amp;#8211;抽出物&amp;#8482; タンパク質抽出キット</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;抽出物&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;抽出物&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;抽出物&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;抽出物&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; 製品</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; 試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10倍濃縮ウェスタンブロット染色液</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; 試薬、サケ血漿</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン 分画V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;ウェスタンブロッティングは、組織ホモジネートまたは抽出物のサンプル中から特定のタンパク質を検出するために用いられる分析手法である。本手法では、ゲル電気泳動を用いて、ポリペプチドの長さ（変性条件下）またはタンパク質の3次元構造（ネイティブ/非変性条件下）に基づいて、天然または変性したタンパク質を分離する。その後、タンパク質をメンブレン（通常はニトロセルロースまたはPVDF）に転写し、標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブ（検出）を行う。&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; 錠剤</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-Tween&amp;#174; 錠剤</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; 免疫反応増強キット</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。それは、ポリペプチドの長さ（変性条件）またはタンパク質の3次元構造（ネイティブ/非変性条件）で、ネイティブまたは変性タンパク質を分離するゲル電気泳動を使用しています。タンパク質を標的タンパク質に特異的な抗体を使用してそれらがプローブされる膜（通常はニトロセルロースまたはPVDF）、（検出）に転送されます。

ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。

ウェスタンブロッティングは、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中に存在する特定のタンパク質を検出するために用いられる分析手法である。この手法では、ゲル...

この手順の全体的な目的は、適切な製品を使用することでウェスタンブロットを容易に実施できることを実証することです。サンプルの調製後、タンパク質をサイズに基づいて分離し、固相に転写します。その後、抗体を用いてタンパク質をプローブし、検出します。適切なプロトコルと高品質でコストパフォーマンスの高い試薬を使用することで、ウェスタンブロッティングの結果を向上させることができます。こんにちは。私はカリフォルニア州サンディエゴにあるEMD Chemicalsの研究開発科学者、ジェシー・ルーハンです。EMDは、ドイツのダルムシュタットにあるMerck KGaAの関連会社です。本日は、ウェスタンブロッティングの手法についてご紹介します。それでは始めていきましょう。ウェスタンブロッティングの最初のステップはサンプルの調製です。まず、2,500 ×gで5分間などの低速遠心分離を行い、細胞をペレット化してサンプル調製を開始します。遠心分離後、細胞ペレットをデカントします。10⁶個の細胞あたり150 µLのCytoBusterタンパク質抽出試薬を用いて、細胞を十分に再懸濁します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、遠心分離後、サンプルを4°Cで16,000 ×g、5分間遠心分離します。上清のSNAを新しいチューブに移し、解析に進みます。サンプルのタンパク質濃度を測定した後、タンパク質を変性させるため、ゲルのロード用サンプルを調製します。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのイオン性変性剤を含むサンプルバッファーを使用します。混合物を95から100°Cで5分間加熱してください。市販のプレキャストゲルを使用することで、タンパク質を分子量に基づいて迅速に分離できます。電気泳動装置に、Omni PUケミカルラインで提供されている試薬から調製可能な走行緩衝液を満たします。ウェルの最初のレーンにトレイルミックス蛋白質マーカーをロードします。このマーカーには3本の参照バンドがあり、電気泳動中のモニタリングが可能です。ゲルを染色すると、10 kDaから225 kDaの範囲に10本のバンドが確認できます。変性させた試料を、残りのウェルにロードします。ゲルを220 Vで1時間電気泳動させます。タンパク質の分離後、Rapid StainおよびUltrasensitive Stain（DS不要の既製品）を用いてゲルをクマシーブルーで染色し、タンパク質が均一に移行していることを確認します。電荷を持つタンパク質が電場によってゲル内を移動するように、電場を用いてタンパク質をゲルからNITROCELLULOSEまたはPVDFなどのメンブレンに転写するため、染色が必要となります。PVDFメンブレンを使用する場合は、メンブレンをメタノールに数分間浸した後、氷冷した転写バッファーで5分間平衡化させます。また、ゲルも氷冷した転写バッファーに数分間浸してください。この平衡化により、転写中のゲルの収縮を防ぐことができます。ウェット転写を行うには、スポンジとペーパーの間にゲルとメンブレンを挟んでサンドイッチ状に組み立てます。次に、ゲルとメンブレンの間に気泡が入っていないことを確認し、アセンブリをしっかりとクランプで固定します。このサンドイッチを転写バッファーに浸し、電場を印加してください。負に帯電したタンパク質は正電極に向かって移動します。その後、メンブレンがタンパク質を停止させ、結合させることで、それ以上の移動を防ぎます。転写が完了したら、タンパク質を可視化し、気泡がなく均一に転写されているかを確認してください。これはred alert Western blot stainを用いて簡単に行うことができます。この染色はそのまま使用可能であり、水で容易に脱染色ができます。これは、抗体でプローブ処理する前に水で洗浄して脱染色した後のゲルです。その後、メンブレンをブロッキングします。非特異的な結合を防ぐため、高品質なブロッキング剤を用いてメンブレンをブロッキングします。バックグラウンドの上昇を避けるため、ブロッキング溶液中で室温にて1時間、緩やかに攪拌しながらインキュベートし、その後メンブレンをTBSTまたはPBSTで3回洗浄します。これらのバッファーは、それぞれTBS tweenタブレットおよびPBS tweenタブレットを用いて簡単かつ便利に調製できます。メンブレンのブロッキングと洗浄が完了したら、一次抗体でインキュベートします。シグナルを大幅に増強させるSignal Boost溶液を用いて、一次抗体を適用します。溶液1で一次抗体を調製し、メンブレンを1時間インキュベートしてください。インキュベーション後にブロッキング剤を追加する必要はありません。メンブレンをTBSTで洗浄します。次に、signal boostの溶液2で希釈した二次抗体を用いて、メンブレンを1時間インキュベートします。最後に、HRP結合二次抗体の検出のために、メンブレンをTBSTで数回洗浄します。ここでは通常、化学発光増強法（ECL）による二次抗体の検出が行われます。ルミノールやエンハンサーの混合が不要なECL試薬のラピッドステップ（rapid step）を使用します。メンブレンに数回スプレーし、2分間インキュベートした後、X線フィルムを用いて現像します。Rapid Stepは、低ピコグラムレベルの感度を提供し、基質の添加後最大2時間にわたって発色が持続します。Trail mixプロテインマーカーを使用することで、標準的なWestern blotプロトコルと比較して、電気泳動中のタンパク質の追跡が可能になります。Signal Boostを使用することで、ダイナミックレンジと感度を向上させることができます。最後に、従来のECL試薬の代わりにRapidステップを使用することで、より優れた感度を得ることが可能です。以上で、包括的な製品ラインナップを用いて、効率的かつコストパフォーマンス高くウェスタンブロッティングを行う方法を説明しました。結果の質は、使用する試薬の質に依存することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。...

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

蛍光を用いたウェスタンブロッティングの進歩により、タンパク質発現の微妙な変化の検出が可能になり、定量分析が可能になりました。ここでは、さまざまな種や組織タイプにわたるさまざまなタンパク質を検出するための堅牢な分析法について説明します。一般的な技術的問題を克服するための戦略も提供されます。...

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

このメソッドでは、標準化された定量的西部のしみが付くアプローチを使用して異なる発達縦長で種々...

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI -...

MALDIサンプル調製：超薄層法

アーカイブホルマリン固定し、パラフィンに包埋（FFPE）の臨床試料は、病気の調査のための貴重な資料である。ここでは、顕微解剖FFPE組織の詳細なプロテオーム解析を可能にする試料調製のワークフローを示す。...

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

学ぶウェスタンブロッティングの標準プロトコル。サンプル調製から電気泳動、膜転写、抗体プローブまでの一連の手順を解説。高品質な試薬を使用することで、感度と再現性の高いタンパク質検出を実現する方法を紹介します。

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

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