ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

この手順の全体的な目標は、適切な製品を使用した場合のウェスタンブロットの容易さを実証することです。サンプル調製後、タンパク質はサイズに基づいて分離され、固相に移されます。その後、タンパク質を抗体でプローブし、適切なプロトコルを使用して検出すると、高品質で費用対効果の高い試薬により、ウェスタンブロッティングの結果が向上します。

こんにちは、カリフォルニア州サンディエゴのEMD ChemicalsのR&DサイエンティストであるJesse Luhanです。EMDは、ドイツのDharm statにあるMerck、KGAAの関連会社です。今日は、ウェスタンブロッティングの手順をご紹介します。

それでは始めましょう。ウェスタンブロッティングの最初のステップは、サンプル調製です。サンプル調製は、重力の2,500倍で5分間などの低速遠心分離を使用して細胞をペレット化することから始めます。

遠心分離後、細胞ペレットを排出します。6つの細胞に10個あたり150マイクロリットルのCytoBuserタンパク質抽出試薬で細胞をよく再懸濁します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。

次に、遠心分離後、4°Cで重力の16,000倍でサンプルを5分間回転させます。クリアしたSNAを新しいチューブに移し、分析を続行します。サンプルのタンパク質濃度を評価した後、ゲルをロードしてタンパク質を変性させるためのサンプルを準備します。

ナトリウムやSDSなどのオン性変性洗剤を含むサンプルバッファーを使用してください。混合物を摂氏95〜100度で5分間沸騰させます。市販のプレキャストゲルを使用すると、分子量に基づいてタンパク質を迅速に分離できます。

電気泳動ユニットに、Omni PUケミカルラインを通じて提供される試薬から作ることができるランニングバッファーを充填します。ウェルの最初のレーンにトレイルミックスプロテインマーカーをロードします。このマーカーには、電気泳動中のモニタリングを可能にする3つのリファレンスバンドがあります。

ゲルを染色すると、10〜225キロのダルトンの範囲で10のバンドが見えます。変性したサンプルを残りのウェルにロードします。ゲルを220ボルトで1時間運転します。

タンパク質が分離したら、ゲルをクマシブルーで染色し、DSを使用しない準備ができている急速染色と超高感度染色を使用して、タンパク質が均一かつ均一に移動していることを確認します。電荷を持つタンパク質が電場中でゲル中を移動するように誘導されるのと同様に、染色が必要です。したがって、タンパク質はゲルから電場内でニトロセルロースやPVDFなどの膜に転写されます。PVDFメンブレンを使用する場合は、メンブレンをメタノールに数分間浸した後、氷冷転写バッファーで5分間平衡化します。また、ゲルを氷冷転写バッファーE平衡化に数分間浸すことで、転写中のゲルの収縮を防ぎます。

ウェット転写の場合は、スポンジと紙の間にゲルとメンブレンを挟んで組み立てます。次に、ゲルとメンブレンの間に気泡が形成されていないことを確認した後、アセンブリをしっかりと固定します。サンドイッチをトランスファーバッファーに浸し、電界を印加します。

負に帯電したタンパク質は、正に帯電した電極に向かって移動します。その後、膜はそれらを止め、結合し、それらが続けるのを防ぎます。転写が完了したら、タンパク質を視覚化して、エアポケットのない均一な転写を確保します。

これは、レッドアラートウェスタンブロット染色で簡単に行うことができます。この染色はすぐに使用でき、水で簡単に脱汚すことができます。これは、膜が抗体で証明される前に水で洗浄して染色した後、膜が詰まったゲルです。

非特異的結合を防ぐために、高品質のブロッキング試薬でメンブレンをブロックします。バックグラウンドの増加を避けるために、ブロッキング溶液中で室温で1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートし、インキュベーション後にTBSTまたはPBSTでメンブレンを3回洗浄します。これらのバッファーは、TBSトゥイーン錠およびPBSトゥイーン錠をそれぞれ使用して、簡単かつ便利に作製できます。

メンブレンをブロックして洗浄したら、一次抗体とインキュベートできます。シグナルブーストの1つである溶液を使用して一次抗体を適用すると、シグナルが大幅に増強されます。溶液1で一次抗体を調製し、メンブレンを1時間インキュベートします。

インキュベーション後にブロッキング剤を追加する必要はありません。TBSTでメンブレンを洗浄します。次に、シグナルブーストの溶液2で希釈した二次抗体とメンブレンを1時間インキュベートします。

最後に、TBSTでメンブレンを再度数回洗浄し、HRPを結合させます。ここでは、化学発光強化(ECL)による二次抗体検出が伝統的に使用されています。ECL試薬ラピッドステップは、ルミノールやエンハンサーの混合を必要としないため、使用されます。

メンブレンに数回スプレーし、2分間インキュベートし、X線フィルムで現像するだけです。Rapid Stepは、低ピコグラム感度と、基板添加後最大2時間の軽量ミッションを提供します。Trail Mixタンパク質マーカーは、標準的なウェスタンブロットプロトコルと比較した場合、電気泳動中のタンパク質追跡を可能にします。

シグナルブーストにより、ダイナミックレンジと感度が向上します。最後に、従来のECL試薬の代わりにRapid stepを使用することで、優れた感度を得ることができます。私たちは、包括的な製品群を使用して、ウェスタンブラインドを効率的かつ費用対効果の高い方法で行う方法を示しました。

結果の品質は試薬の品質にかかっていることを忘れないでください。それです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。