Name: E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 4 s
Description: 学ぶE16ラット胚の子宮内脳室内注入とエレクトロポレーションの手法。遺伝子導入効率を高め、発生神経科学の研究に応用可能です。

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e16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

- 子宮内で胎児ラットの新皮質の生体内注射とエレクトロポレーションは、側脳室の壁の内側を覆う個々の前駆細胞を操作するための強力なツールが用意されています。この手法は、今や広く過剰発現や遺伝子をノックダウンし、細胞増殖、遊走、分化への影響を観察することによってcorticogenesisに関与するプロセスを研究するために使用されます。伝統的なノックアウト戦略と比較して、子宮内エレクトロポレーションは、特定の時間ウィンドウの間に細胞の集団を操作する迅速な手段を提供します。このビデオプロトコルでは、我々は、手術のためにラットを準備laporatomyを通して子宮角を露出、胚の側脳室内にDNAを注入し、横方向の壁を裏打ちする前駆細胞にDNAをelectroporating、および動物の世話のために実験方法の概要を説明後手術。当研究室ではこのビデオで示すようにしかしそれは最も一般的にE16で行われ、E15 - E21ラットの手術のためにこのプロトコルを使用します。

E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

ラット胚の新生皮質における子宮内in-vivo注入および電気穿孔法は、個々の前駆細胞を操作するための強力なツールとなります。

こんにちは、William Tiです。Arnold Creek Stein Labから参りました。本日は、私とチームのメンバーで、胎生16日目のラット胚への子宮内注入法について解説します。こんにちは、Laura Eliasです。本日は、本日行う脳室間注入およびエレクトロポレーションのためのマイクロインジェクションピペットの準備と充填方法について説明します。また、E16ラット胚における脳室間注入とエレクトロポレーションの実施方法についても解説します。ラットは遺伝的操作が容易ではない系であるため、ラットにおける子宮内注入およびエレクトロポレーションは特に有用です。さて、この処置では多くの手術器具を使用します。フリーア、および2種類の鑷子（せっし）を使用します。1方は鋸歯付きで、もう1方は先端に小さな歯があるものです。また、止血鉗子も使用します。こちらはハサミで、次にこれら2つのステープラーを使用します。大きい方はラットに使用するものです。小さい方はマウスに使用するもので、サイズ7のステープルを使用します。もう一方はサイズ9のステープルを使用し、どちらもスプリングロード式です。手術を補助するためにここで使用している器具の中には、ダブルヘッドを備えたシンプルな光ファイバー光源のものがあります。また、温水を循環させて温度を維持するための加熱パッドを使用しています。作業面には、BTX社製のエレクトロポレーションシステムを使用しています。胚の大きさに合わせて、数種類の異なるサイズのパドルを使用します。青色の側が陽極側です。それでは、次に注入用ピペットの斜面（ベベル）を作成します。DNAをロードできる十分な開口部があり、かつ注入時に胚を傷つけないよう非常に鋭利であることが極めて重要です。注入時に胚を傷つけてしまうと、死亡率が大幅に高まってしまうため、これは避ける必要があります。この工程は、本手術において非常に重要なプロセスです。まず、ここで回転している面取り砥石に水をかけます。次に、こちらにあるスティックを使用します。次に、今引き出したピペットをテープでこのスティックに固定します。そして、マイクロマニピュレーターを用いてピペットを保持し、ここでベベル加工（斜面形成）ができるようにします。これを配置し、顕微鏡を使用してピペットの先端を視認しながら作業を行います。そして、わずかな圧力がかかるように、先ほどのベベルの上に直接水中に配置します。チップがここにあるストーンに押し付けられているのがわかります。そのまま少なくとも15分間、ベベル加工を行います。私は、例えば1時間ほどそのままにしておくこともあります。そうすると、非常に鋭くなりますが、ピペットの面取りにどのくらいの時間をかけるかは、間違いなく人によって異なります。さて、こちらをご覧ください。上にあるのは、引き出されたままで、まだ面取りされていないピペットです。したがって、こちらは鋭利ではありますが、DNAをロードするための開口部がありません。一方、下のピペットは面取りされており、このように斜めの開口部があることがわかります。これによりDNAのロードが可能になりますが、先端は鋭利なままであるため、損傷を与えることなく注入することができます。それでは、注入用ピペットにDNAを満たします。したがって、DNAを注入する際にリポ多糖類が混入しないよう、エンドトキシンフリーの状態でDNAを調製することが重要です。それでは、DNAを用意し、あわせてパラフィルムの準備をします。ここでパラフィルムを広げ、DNAを少量採取して、パラフィルムの上に小さなドット状に置いてください。次に、DNA溶液 10 µL（通常 1.5〜1.7 µg/µL の濃度で使用します）に対し、Fast Green 染料を約 1 µL 加えます。これは、注入部位を特定し、脳室への注入が成功したことを確認するためのものです。次に、このファストグリーン染料をDNAと混合します。そして、注入電極を用意し、プランジャーを引いてピペットを満たします。ここで、ピペットが適切で開口部が十分に大きければ、DNAが非常にスムーズにロードされることがわかります。プランジャーを何度か前後に動かすことで、正しく液体を吸い上げることができる場合があります。このようにしてピペットに充填します。これでDNAがピペットに完全に充填され、注入できる状態になりました。それでは、動物に麻酔をかけます。これらの脱頸円錐（デキャップコーン）を使用します。持ちやすくするために、縁の部分を少し後ろに曲げます。それでは始めましょう。通常、このようにケージの端に置いて、彼が入っていけるような小さなトンネルを作ります。さて、この個体はダウンしているようです。それを確認するために、足指へのピンチ刺激を行います。足指をつかみ、しっかりとつまみます。強くやりすぎないでください。動物を傷つけないように注意し、麻酔が十分に効いていることだけを確認します。動物が完全に麻酔で沈みましたので、腹部の除毛を行います。乳頭を切り落とさないよう、乳頭部分は避けて除毛します。動物にとって非常に苦痛を伴う可能性があるため、動物の被毛を剃毛します。それでは、動物をフードの中に入れます。洗浄を行い、処置を開始します。さて、この動物が再び麻酔状態にあることを確認しましたので、まずは洗浄を行います。まず、両目に眼軟膏を少量塗布し、目の乾燥を防ぎます。次に、アルコール綿とヨード綿を用いて交互に洗浄します。これを3回、交互に拭き取ります。この操作を行う際は、胚を損傷させないよう、非常に慎重に行う必要があります。このように、そのまま真っ直ぐ下に拭き、真っ直ぐ後ろに拭きます。これが1番目の手順です。拭き取りを行う前に、まず十分に濡らす必要があります。これで大丈夫です。これで2つ、そして3つ目です。さて、滅菌状態を維持するためにこのカバーを掛けましたので、これから個体を開腹します。では、切開しましょう。まず最初に行うのは、滅菌手袋の着用です。滅菌手袋を着用し、切開の準備を整えます。動物が引き続き麻酔下にあることを必ず確認してください。それでは、もう一度足指のピンチ操作を行います。この操作は手技の間を通じて繰り返し行います。通常の手順としては、まず組織を少量つまみます。素早く切開を加え、上端を掴んで切り下げ、もう一方の鉗子で組織を広げて保持します。次に、目的の筋肉を掴み、血管や神経を損傷しないよう正中線上で切除します。掴む際に注意してください。これで、十分な収量が得られたようです。乾燥を防ぐため、十分に潤滑状態を維持するようにします。念のため、もう一度確認して、問題ないか確かめます。状態は良好なようです。統一性を保つため、私は常に胚の頭が母ラットの右側に来るように配置しています。それでは、開始します。ここに胚が見えます。こちらに尾と後肢があり、さらに上方に頭部があります。ここでは、この胚の頭部を見ています。この暗い線が正中線であることがわかります。左半球と右半球、そして後脳が確認できます。次に、左半球に注入を行います。ピペットで注入し、少し引き上げてから色素を注入します。このように、左側脳室に広がっていくのが分かります。これで注入が成功したようです。さて、心室が十分に満たされたことがわかります。色素が実際に左心室から右心室へと移動しています。これで、両側の脳室にDとDNAが入りました。ここで、エレクトロポレーション用電極を脳にわたるように配置し、左側に陽極を置きます。これにより、DNAが左半球の前駆細胞および皮質壁に導入されます。それでは、電流を流します。電流を流し始めると、電極の負極側に泡が発生するのがわかります。これは、正しく接触できていることを示す安心材料となります。さて、胚の電穿孔が完了しましたので、胚を戻して縫合します。次に、10 mLの抗生物質を投与し、外科的な縫合を行います。私はブロックステッチ（断続縫合）を用いる方法を推奨しています。その後、スキンステープラーを用いて皮膚を縫合します。いいですね。麻酔から覚めた際に痛みを感じないよう、ブプレノルフィンを投与しておきました。それでは、彼女をインキュベーターに入れます。これにより、覚醒までの間、体温を維持させ、低体温症にならないようにします。さて、これまで子宮内での脳室内注入およびエレクトロポレーションの方法について説明しました。ラットでは、さまざまな物質を注入することが可能です。例えば、レンチウイルスやレトロウイルスなどのウイルスを脳室内に直接注入することもできます。今回のケースでは、ウイルスが細胞内に組み込まれるため、エレクトロポレーションを行う必要はありません。今日行ったようにプラスミドDNAを注入する場合は、脳室壁の細胞内にプラスミドを導入させるためにエレクトロポレーションを行う必要があります。したがって、これらのベクターをさまざまな目的に合わせて使い分けることができます。これらを用いて単に細胞を追跡しGFPを発現させることで、前駆細胞の分裂と移動を観察することができます。また、これらのベクターを使用して細胞を操作することも可能です。例えば、shRNAヘアピンを発現させることで、特定の遺伝子をノックダウンさせることができます。特定の遺伝子を過剰発現させることで、エレクトロポレーションやウイルス感染させた細胞を操作することも可能です。これは、関心のあるプロセスにおける特定のタンパク質の役割を研究するための非常に強力な手法となります。特にラットを用いた研究において重要であるためです。なぜなら、ラットではマウスほど容易に遺伝子操作を行うことができないからです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin...

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

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妊娠中期のマウス胚の低菱形リップの in vitroエレクトロポレーションで

体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。...

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

このビデオは、マウス胚の小脳ニューロン細胞にプラスミドDNAを子宮内エレクトロポレーションを使用して送達する方法を示しています。この方法は、正常な脳の発達における遺伝子のin...

子宮内エレクトロポレーションに基づく遺伝子導入:マウス胚の胚性小脳細胞にプラスミドDNAを注入する技術

遺伝子は、成体動物における行動や神経病のその後の研究のために、神経細胞の接続性における迅速かつターゲットの変更を可能にするために、E16での子宮内電気穿孔（IUE） ビア皮質またはラットの海馬の開発中に操作することができます。 IUE成功を制御するためのインビボイメージングにおける出生後の共トランスフェクトし、ルシフェラーゼの生物発光を活性化することによって行われる。...

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

脳室周囲結節性異 (PNH) は、成人期の皮質発達 (MCD) の奇形の最も一般的な形式が、その遺伝的基盤はほとんど散発的ケースで不明のまま。我々 は最近 MCDs...

脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。...

アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集

学ぶE16ラット胚の子宮内脳室内注入とエレクトロポレーションの手法。遺伝子導入効率を高め、発生神経科学の研究に応用可能です。

E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

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