E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

こんにちは、William Tiです。Arnold Creek Stein Labから参りました。本日は、私とチームのメンバーで、胎生16日目のラット胚への子宮内注入法について解説します。こんにちは、Laura Eliasです。

本日は、本日行う脳室間注入およびエレクトロポレーションのためのマイクロインジェクションピペットの準備と充填方法について説明します。また、E16ラット胚における脳室間注入とエレクトロポレーションの実施方法についても解説します。ラットは遺伝的操作が容易ではない系であるため、ラットにおける子宮内注入およびエレクトロポレーションは特に有用です。

さて、この処置では多くの手術器具を使用します。フリーア、および2種類の鑷子（せっし）を使用します。1方は鋸歯付きで、もう1方は先端に小さな歯があるものです。また、止血鉗子も使用します。

こちらはハサミで、次にこれら2つのステープラーを使用します。大きい方はラットに使用するものです。小さい方はマウスに使用するもので、サイズ7のステープルを使用します。もう一方はサイズ9のステープルを使用し、どちらもスプリングロード式です。

手術を補助するためにここで使用している器具の中には、ダブルヘッドを備えたシンプルな光ファイバー光源のものがあります。また、温水を循環させて温度を維持するための加熱パッドを使用しています。作業面には、BTX社製のエレクトロポレーションシステムを使用しています。

胚の大きさに合わせて、数種類の異なるサイズのパドルを使用します。青色の側が陽極側です。それでは、次に注入用ピペットの斜面（ベベル）を作成します。

DNAをロードできる十分な開口部があり、かつ注入時に胚を傷つけないよう非常に鋭利であることが極めて重要です。注入時に胚を傷つけてしまうと、死亡率が大幅に高まってしまうため、これは避ける必要があります。

この工程は、本手術において非常に重要なプロセスです。まず、ここで回転している面取り砥石に水をかけます。次に、こちらにあるスティックを使用します。

次に、今引き出したピペットをテープでこのスティックに固定します。そして、マイクロマニピュレーターを用いてピペットを保持し、ここでベベル加工（斜面形成）ができるようにします。これを配置し、顕微鏡を使用してピペットの先端を視認しながら作業を行います。

そして、わずかな圧力がかかるように、先ほどのベベルの上に直接水中に配置します。チップがここにあるストーンに押し付けられているのがわかります。そのまま少なくとも15分間、ベベル加工を行います。

私は、例えば1時間ほどそのままにしておくこともあります。そうすると、非常に鋭くなりますが、ピペットの面取りにどのくらいの時間をかけるかは、間違いなく人によって異なります。さて、こちらをご覧ください。上にあるのは、引き出されたままで、まだ面取りされていないピペットです。

したがって、こちらは鋭利ではありますが、DNAをロードするための開口部がありません。一方、下のピペットは面取りされており、このように斜めの開口部があることがわかります。これによりDNAのロードが可能になりますが、先端は鋭利なままであるため、損傷を与えることなく注入することができます。それでは、注入用ピペットにDNAを満たします。

したがって、DNAを注入する際にリポ多糖類が混入しないよう、エンドトキシンフリーの状態でDNAを調製することが重要です。それでは、DNAを用意し、あわせてパラフィルムの準備をします。ここでパラフィルムを広げ、DNAを少量採取して、パラフィルムの上に小さなドット状に置いてください。

次に、DNA溶液 10 µL（通常 1.5〜1.7 µg/µL の濃度で使用します）に対し、Fast Green 染料を約 1 µL 加えます。これは、注入部位を特定し、脳室への注入が成功したことを確認するためのものです。

次に、このファストグリーン染料をDNAと混合します。そして、注入電極を用意し、プランジャーを引いてピペットを満たします。ここで、ピペットが適切で開口部が十分に大きければ、DNAが非常にスムーズにロードされることがわかります。

プランジャーを何度か前後に動かすことで、正しく液体を吸い上げることができる場合があります。このようにしてピペットに充填します。これでDNAがピペットに完全に充填され、注入できる状態になりました。

それでは、動物に麻酔をかけます。これらの脱頸円錐（デキャップコーン）を使用します。持ちやすくするために、縁の部分を少し後ろに曲げます。

それでは始めましょう。通常、このようにケージの端に置いて、彼が入っていけるような小さなトンネルを作ります。さて、この個体はダウンしているようです。

それを確認するために、足指へのピンチ刺激を行います。足指をつかみ、しっかりとつまみます。強くやりすぎないでください。動物を傷つけないように注意し、麻酔が十分に効いていることだけを確認します。

動物が完全に麻酔で沈みましたので、腹部の除毛を行います。乳頭を切り落とさないよう、乳頭部分は避けて除毛します。

動物にとって非常に苦痛を伴う可能性があるため、動物の被毛を剃毛します。それでは、動物をフードの中に入れます。

洗浄を行い、処置を開始します。さて、この動物が再び麻酔状態にあることを確認しましたので、まずは洗浄を行います。まず、両目に眼軟膏を少量塗布し、目の乾燥を防ぎます。

次に、アルコール綿とヨード綿を用いて交互に洗浄します。これを3回、交互に拭き取ります。この操作を行う際は、胚を損傷させないよう、非常に慎重に行う必要があります。

このように、そのまま真っ直ぐ下に拭き、真っ直ぐ後ろに拭きます。これが1番目の手順です。拭き取りを行う前に、まず十分に濡らす必要があります。これで大丈夫です。

これで2つ、そして3つ目です。さて、滅菌状態を維持するためにこのカバーを掛けましたので、これから個体を開腹します。では、切開しましょう。

まず最初に行うのは、滅菌手袋の着用です。滅菌手袋を着用し、切開の準備を整えます。動物が引き続き麻酔下にあることを必ず確認してください。

それでは、もう一度足指のピンチ操作を行います。この操作は手技の間を通じて繰り返し行います。通常の手順としては、まず組織を少量つまみます。素早く切開を加え、上端を掴んで切り下げ、もう一方の鉗子で組織を広げて保持します。

次に、目的の筋肉を掴み、血管や神経を損傷しないよう正中線上で切除します。掴む際に注意してください。これで、十分な収量が得られたようです。

乾燥を防ぐため、十分に潤滑状態を維持するようにします。念のため、もう一度確認して、問題ないか確かめます。状態は良好なようです。統一性を保つため、私は常に胚の頭が母ラットの右側に来るように配置しています。

それでは、開始します。ここに胚が見えます。こちらに尾と後肢があり、さらに上方に頭部があります。

ここでは、この胚の頭部を見ています。この暗い線が正中線であることがわかります。左半球と右半球、そして後脳が確認できます。

次に、左半球に注入を行います。ピペットで注入し、少し引き上げてから色素を注入します。このように、左側脳室に広がっていくのが分かります。

これで注入が成功したようです。さて、心室が十分に満たされたことがわかります。色素が実際に左心室から右心室へと移動しています。

これで、両側の脳室にDとDNAが入りました。ここで、エレクトロポレーション用電極を脳にわたるように配置し、左側に陽極を置きます。これにより、DNAが左半球の前駆細胞および皮質壁に導入されます。

それでは、電流を流します。電流を流し始めると、電極の負極側に泡が発生するのがわかります。これは、正しく接触できていることを示す安心材料となります。

さて、胚の電穿孔が完了しましたので、胚を戻して縫合します。次に、10 mLの抗生物質を投与し、外科的な縫合を行います。私はブロックステッチ（断続縫合）を用いる方法を推奨しています。

その後、スキンステープラーを用いて皮膚を縫合します。いいですね。麻酔から覚めた際に痛みを感じないよう、ブプレノルフィンを投与しておきました。それでは、彼女をインキュベーターに入れます。これにより、覚醒までの間、体温を維持させ、低体温症にならないようにします。

さて、これまで子宮内での脳室内注入およびエレクトロポレーションの方法について説明しました。ラットでは、さまざまな物質を注入することが可能です。例えば、レンチウイルスやレトロウイルスなどのウイルスを脳室内に直接注入することもできます。

今回のケースでは、ウイルスが細胞内に組み込まれるため、エレクトロポレーションを行う必要はありません。今日行ったようにプラスミドDNAを注入する場合は、脳室壁の細胞内にプラスミドを導入させるためにエレクトロポレーションを行う必要があります。したがって、これらのベクターをさまざまな目的に合わせて使い分けることができます。

これらを用いて単に細胞を追跡しGFPを発現させることで、前駆細胞の分裂と移動を観察することができます。また、これらのベクターを使用して細胞を操作することも可能です。例えば、shRNAヘアピンを発現させることで、特定の遺伝子をノックダウンさせることができます。

特定の遺伝子を過剰発現させることで、エレクトロポレーションやウイルス感染させた細胞を操作することも可能です。これは、関心のあるプロセスにおける特定のタンパク質の役割を研究するための非常に強力な手法となります。特にラットを用いた研究において重要であるためです。なぜなら、ラットではマウスほど容易に遺伝子操作を行うことができないからです。