Name: 周波数成分を用いたイオンチャネルのIV曲線の要約 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶ イオンチャネルの周波数応答特性評価法。ノイズ関数を用いた電圧クランプ法で複数チャネル同時計測を実現し、薬理学的遮断剤なしで電流変動を解析する革新的アプローチを解説します。

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この作品は、博士Poelzingに授与保健助成金番号R21 - HL094828 - 01の国立研究所によってサポートされていました。

1。ノイズ関数と入力信号を準備する<ol><li>所望の周波数成分を含むノイズ関数を作成します。これは、周波数領域で所望の周波数成分を記述し、逆高速フーリエ変換を計算することによって行うことができます。本研究では、1 - 15 kHzのを使用した。すべてのフーリエ変換、および本研究で説明されて逆フーリエ変換は、MatlabのFFTとIFFTの関数を用いて計算した。 </li><li>適切なノイズ関数の振幅をスケーリングします。本研究ではノイズ関数は、ノイズ関数の振幅をピークに、ゼロが50または100 mVであったようにスケーリングされた。 </li><li>使用されている買収のソフトウェアのための適切なメソッドを使用して、スティミュラスファイルを作成します。 Clampex 8では、まず、適切なヘッダーを持つテ​​キストフ​​ァイルを作成します。ヘッダの下に、最初の列にあるシングル掃引時間増分を挿入する。時間増分は、測定に使用されるサンプリング間隔と同じ時間間隔を持つ必要があります。電圧ステップのプロトコルで掃引ごとに各時間ステップごとに必要な正確な電圧を挿入する。これは、ノイズ関数を含める必要があります。 </li></ol> 2。電圧クランプ測定を実行<ol><li>以前に生成された刺激のファイルと互換性のある買収のソフトウェア内の測定プロトコルを作成します。 Clampexでは、ユーザーが現在のプロトコルで、スティミュラスファイルを関連付けることができるメニューがあります。 </li><li>測定機器のモデル（または生物学）細胞を取り付けます。 </li><li>予定通りの実験を行います。制御の目的のために、あらゆるノイズ関数が含まれていない定期的な測定値を含めるようにしてください。 </li></ol> 3。ポスト実験解析<ol><li>個々の記録のためのIV曲線を計算する。録音はノイズ関数が適用される定常状態にある場合は、IV曲線は、時間的にノイズ関数の範囲外の記録の定常状態の部分を使用して作成することができます。録音は、定常状態ではなかった場合、ノイズ関数は、IV曲線の計算を妨げる可能性、第2の記録が存在するノイズの機能なしで行われるはずです。 </li><li>記録の各電圧ステップのために高速フーリエノイズ関数が挿入された記録の部分の変換を計算する。 mはFFTの周波数の数であり、そしてnは電圧ステップ数であるamxn行列、に各電圧ステップのためのフーリエ変換を組み合わせる。この構成では、行列の各行は、実験のすべての電圧のステップで単一周波数の振幅を表しています。 </li><li>周波数ごとに（上記の行列の各行、すなわち）3.1で生成されたIV曲線を持つ行を相互に関連付けて、相関係数を記録。 </li><li>高度なIV曲線との相関の周波数を視覚化するために相関係数の対周波数のプロット。直流成分はFFTの最初の周波数に含まれているので、この周波数の相関係数は常に&gt; 0.99である必要があります。 </li></ol> 4。代表的な結果： 代表的な電圧クランプ測定は、電圧ステップのプロトコルに挿入されたノイズ関数なしで（図1A）と（図1B）を持つモデル細胞として使用されています。 IV曲線は、モデル細胞（図1C）を算出した。掃引ごとに、図1からの録音で、FFTは、ノイズ関数が挿入された時間枠（図1A、1Bに赤いボックスを参照）を基に計算した。図2Aおよび2Bは、それぞれ、図1Aおよび1Bに示されている録音のために計算されたFFTを示しています。目視検査の際、DC成分は、（赤で強調表示）IVカーブの形状を模倣するように表示されます。ノイズ関数がなければ、DC上のすべての周波数がゼロ（図2A）の近くで振幅を持っているように見えます。ノイズ関数が挿入されると、1〜15 kHzの間の周波数では、視覚的に顕著な振幅（図2B）を持っている。図3は、IV曲線に対する電圧のステップの範囲で個々の周波数の振幅を相関の結果を示しています。実験はそれぞれ、制御条件（無ノイズ関数）の下、50〜100mVのノイズの振幅が行われていたときに、図3A - Cは、相関係数を示しています。すべてのケースでの通知は、DC成分は、IV曲線でほぼ完全に相関することが表示されます。確かに、すべての録画のために、この周波数の相関係数は0.99（R = 0.9996 ± 1E - 5、平均値±標準偏差）以上であった。我々は図3Aの（コントロール条件）を見ると、振幅が大幅にIVカーブと相関する直流成分以外にも周波数はありません。特に、これらの周波数はいずれも0.5以上の相関係数を持っていません。最小の振幅のノイズ関数（50 mVの）を挿入すると、これらの同じ周波数でも、0.5よりも相関係数が少なくていた。の相関係数ノイズの振幅が100 mVに増加したときにSEの周波数は、0.5より大きくなっていませんでした。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1モデルセル録音：電圧クランプ記録は、電圧ステップのプロトコルに含まれるノイズの機能なし（1A）と（1B）でモデル細胞として使用されています。各スイープの最初と最後の20ミリ秒の場合、電位が保持電位（0 mV）で維持した。各電圧ステップは80 msの長さだった、とノイズ関数は、ステップの開始後40 msを挿入した。ノイズ関数は、30ミリ秒と1〜15 kHzの間に含まれる周波数の持続時間を持っていた。電圧は5 mV刻みで-150〜+50 mVに、あちこちに辞任した。モデルのセルのIV曲線は、（1C）が表示されます。読みレコーディングを簡単にするために、唯一の五回ごとの掃引は、1Aおよび1Bに含まれていましたが、すべてのスイープは、1Cに含まれていた。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：録音のFFT：FFTのノイズ関数は、（領域が図1A、1Bの赤いボックスで囲まれた）挿入される各スイープの30ミリ秒の部分について計算した。図2Aおよび2Bは、それぞれ、ノイズ関数なしとで計算されたFFTを示しています。もう一度、明確にするために、五回ごとにスイープからのみFFTは、図には含まれていますが、すべてのスイープは、将来の計算で使用されていた。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3のIVの周波数相関：記録のIV曲線と電圧ステップの範囲で個々の周波数の振幅との相関の結果が表示されます。図1A - 1Cは、それぞれ、制御条件の下で0〜20 kHzまでの周波数、および50または100 mVのノイズ関数の存在下で相関係数を、示す。 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4のIV曲線の再作成：モデル細胞（図1Cと同じ）と2つの周波数の大きさのためのIV曲線を重ねていた。最初の周波数は、DC成分（R = 0.995）であり、2番目は低い相関（R = 0.3212）とランダムに選択された周波数でした。周波数の振幅は、IV曲線とほぼ同じ振幅に調整された。

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu%5Dl+Na%2B+channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells%3A+Biochemical+and+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li>
<li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na%2B+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li>
<li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li>
<li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil%2C+D600%2C+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li>
<li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Na%2FCa+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2%2B+Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li>
<li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li>
<li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li>
<li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li>
<li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+K%2B-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li>
<li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li>
<li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li>
<li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Properties+of+hERG+1a%2F1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li>
<li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li>
<li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li>
<li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na%28%2B%29+and+Li%28%2B%29+binding+sites+within+the+KcsA+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

現在、後で各チャンネルの種類に起因することがどの程度の電流を決定することを意図して同時に複数のイオンチャネルの種類の測定から研究者を防ぐための技術的な障害があります。この制限のため、イオンチャネルは、通常そのような、電圧電流、および活動電位クランプなどの手法を用いて図1は個々のチャネルの種類を調べるために、異種発現系を頻繁に使用されて個別に検討されている2などの心筋細胞などの組織から単離した細胞を操作するとき、他の手段は様々なイオンチャネルをブロックするために使用されている必要があります。例えば、ナトリウムチャネルが遅い脱分極電圧のランプにより失活することができる、3内向き整流カリウムチャネルは、細胞外BaCl2でブロックすることができる、4、カルシウムチャネルは、ベラパミルを使用してブロックすることができます5。 部分的にこの制限を克服する使用される一つの方法は、選択的に適切なエージェントを一つのチャネルタイプをブロックした後、測定を繰り返すと同時に、2つのチャネルタイプを介して現在のフラックスを測定することです。 2つの測定値の減算は、ブロックされたチャネルの種類に、現在の帰属する量を推定するために使用することができます。6しかし、この手法には2つの主要な制限があります。最初に、化学物質を選択的にそれぞれのイオンチャネルをブロックすることができます特定する、、と、いくつかの広く使用されている薬剤は、他の種類のチャネルとの非特異的相互作用を持ってされていない。5,7第二に、それは一つのチャネルが別によって変調されるかどうか、このテクニックから決定することはできないチャンネル。例えば、右心室の高いキール2.1式は伝導速度を押し下げるように、NAV 1.5、キール2.1の異種発現は、モルモットの心室に示されている、そしてそれが相乗関係が2つのチャネル間に存在することが示唆されている。現在8 、これは検証できません。 本研究では、インピーダンス分光法は、同時に測定した複数のイオンチャネルのタイプを研究するための有用なツールであることを示唆している。提示方法が同時に測定された2つのチャネルタイプから電流を識別するために使用されてもいないのに、インピーダンス分光法は、イオンチャネルの機能の他の面の数を研究するために使用されています。グッドマンとアートは、電流クランプのプロトコルが異なる周波数のセルを調整するように変更することができるカメの聴覚有毛細胞を用いて示し、膜電位の振動が内向き整流K +チャネルとCa 2 +チャネルの間の相互作用によるものです。 9漢とFrazier氏はそのインピーダンスは周波数の広い範囲（100 Hzから5 MHzの）上の単一のセルで測定することができます実証、及びK +又はCa 2 +チャネルがブロックされていたがための簡単な手段かもしれないときにインピーダンスの増加が観察さ高スループットの薬物画面でチャンネルのブロックを検出する。10林とフィッシュマンは、内向き整流K +チャネル。11その他のグループが異なる種類のチャネルの電圧クランププロトコルに単一の周波数を挿入しての運動特性を研究するために複雑なコンダクタンスを使用していることを示したこと予想されるいくつかの周波数の応答ではなく、他の人と合意された観測周波数応答。12,13 MillonasとHanckいくつかの周波数が予期される応答は、マルコフモデルで複数の速度定数の存在であることができなかった理由を提案した。このような12件の研究、としてだけでなく、他の人、インピーダンス分光法を使用しながら、イオンチャネルから測定したイオン電流は、理論的な周波数応答と一致していないインスタンスがあることを明らかにした。この研究ではメソッドの目的は、膜の電気回路の基礎的前提の独立した電流振幅との相関の周波数を識別することであるため、これは本研究では問題になりません。 Furtheremoreは、現在の振幅は、それらに挿入されたノイズ関数を持っていない記録の部分から計算されます。他の多くの研究が多数実施し、すべて自分の速度定数と非導通状態を示す多数のイオンチャネルのも現在のモデル。14,15,16 ThompsonらはKCSAチャネルの選択フィルターがNaのための別の結合部位を有することを示した+、Li +（リチウムイオン）、およびK +、および選択性フィルタを介してイオンの動きはチャネルが優先的に細孔を介してK +イオンを行って作るものであるとして1つの結合部位から別のものへ移るの精力的なコスト。17本稿では、範囲を挿入電圧ステップのプロトコルへの周波数（ノイズ関数）のと、その振幅は非常に全体の電流の振幅と相関して周波数を探した。強力な証拠が示唆して提示されているので、複数の速度定数は、差動を介してイオンの伝導の役割を果たすtのチャネルは、これらの速度定数に関連付けられている周波数の導入は、特定の周波数が共振するか非常に特に必要がないという現在の振幅、と相関する可能性があります。本研究で示さ技術は通常、電圧クランプ回路および収集装置をテストするために使用される並列RC回路であるモデルのセルで実行されます。それは、DC以外の任意の周波数が現在の大きさと相関することが期待されていない、とこれは私たちのデータで示されています。我々はまた、ノイズ関数の追加は任意の周波数が高く電流振幅と相関する可能性はなかったことを示している。彼らは、測定機器やノイズ関数は、それ自体で任意の周波数が電流振幅と相関が引き起こされないことを示すため、これら二つの知見は重要である。今後の研究は、イオンチャネルを含む膜を使用して測定を行う場合、それが使用されるチャネルに応じて、多分選択フィルターや細孔の速度定数に対応する周波数は、チャネルの周波数応答に影響を及ぼし、周波数が高い持っている影響を与える、ことが期待される電流振幅を持つか低い相関。 この方法はイオンチャネルを研究するための新しい手法であるため、今後の研究が続くことができる方向の数があります。最初に、技術は特定の絶縁チャンネルの周波数応答を特徴付けるために使用する必要があります。追加の作業はまた、現在の振幅に周波数の振幅を校正するために行われる必要があります。複数のチャネルを個別に特徴づけされると、複数のチャネルタイプを同時に測定する必要があります。技術はまた、活動電位クランプ、電流クランプ、およびフィールドの刺激の研究に使うために改変することができる。これは新しい手法ですが、これまで不可能だった電気生理学的測定を行い、イオンチャネルの生理的役割に貴重な新しい洞察を提​​供する強力な方法かもしれないかを示しています。

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>パッチクランプ積分アンプ</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>16ビットデータ収集システム</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>モデルセル</td><td>Molecular Devices</td><td>Patch 1 Model Cell</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

周波数成分を用いたイオンチャネルのiv曲線の要約

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

はじめに：現在、同時に複数のイオンチャネルの種類を測定し、各チャネルの種類に起因する部分に測定された電流を分解するための確立された方法がない。この研究では、インピーダンス分光法は、高度電圧クランプの実験中に測定された定常状態の電流振幅が相関する特定の周波数を識別するために使用できる方法を示しています。方法は、電圧ステッププロトコルに固有の周波数を含むノイズ関数を挿入する伴います。出品作品では、モデル細胞がない、高い相関がなく、イオンチャネルが存在しないときにノイズ関数自体は高い相関を導入していないことも、電圧クランプ回路によって導入されない、とされていることを実証するために使用されます。技術がイオンチャネルを含有する製剤に適用する前にこの検証は必要です。提示プロトコルの目的は、ノイズ関数への単一のイオンチャネル型の周波数応答を特徴づける方法を示すことです。特定の周波数が個々のチャネルのタイプで識別されると、それらは定常状態の電流電圧（IV）曲線を再現するために使用することができます。非常に一つのチャンネルの種類と相関し、最低限、他のチャネルタイプと相関する周波数はして同時に測定された複数チャネルタイプの現在の貢献度を推定するために使用されることがあります。 【方法】電圧クランプの測定は、標準電圧のステップのプロトコール（-150〜+50 mVに、5mVのステップ）を使用して、モデルセルで行った。 1から15 kHzの周波数（ゼロのピーク振幅：50または100mV）の等しい大きさを含むノイズ関数は、各電圧ステップを挿入した。出力信号の高速フーリエ変換（FFT）の実際のコンポーネントは、各ステップの可能性のノイズがある場合とない場合を計算した。電圧ステップの関数として各周波数の大きさは、対応する電圧では電流振幅と相関していた。 結果と結論：ノイズの有無（制御）においては、直流成分を除く全ての周波数の大きさが不十分な相関（| R | &lt;0.5）IVカーブと、DC成分がすべての測定値で0.999よりも大きい相関係数を持っていたのに対し。ノイズ関数は、電圧ステップのプロトコルに追加されたときに、個々の周波数とIV曲線の間に相関関係の質は変化しなかった。同様に、ノイズ関数の振幅を大きくすると、相関を増加させなかった。コントロールの測定値は、それ自体で電圧クランプ回路が0 Hzより上の周波数は非常に定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。同様に、ノイズ関数の存在下での測定は、ノイズ関数は、イオンチャネルが存在しない場合には0 Hzより上の周波数は定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。この検証に基づいて、メソッドは現在、その振幅がそのチャネルの種類と特異的に相関の周波数を識別する目的で、単一のイオンチャネルの種類を含有する製剤に適用することができます。

貫​​通電流の一部は、各チャネルの種類に起因するものがある、同時に複数のイオンチャネルを流れる電流磁束を測定するための技術的な障害があり、後に目の肥えた。このニーズに対応するため、このメソッドは、特定の周波数成分を使用して、個々のチャネルタイプのIV曲線を生成する方法を示します。

周波数成分を用いたイオンチャネルのIV曲線の要約

はじめに：現在、複数のイオンチャネル型を同時に測定し、測定された電流を……に分解するための確立された手法は存在しません。

本手順の全体的な目的は、複数のチャネル型を介した電流フラックスを同時に測定するために、イオンチャネルの周波数応答を特性評価する手法を実演することです。これはまず、電圧ステッププロトコルに組み込むノイズ関数を作成し、それを刺激ファイルに組み込むことで達成されます。これは、clamp Xソフトウェアでカスタム波形を使用するために必要です。本手順の第2ステップでは、作成した電圧ステッププロトコルを、標準的なホールセル電圧クランプ法を用いてモデル細胞に適用し、得られた電流を記録します。第3ステップでは、細胞のIVカーブと、各スイープのうちノイズ関数を含む部分のFFTを算出します。手順の最終ステップは、すべての電圧ステップにおける各周波数の振幅を、その細胞のIV曲線と個別に相関させることです。結果として、モデル細胞のIV曲線と高く相関する周波数は認められませんでした。標準的なホールセル電位固定法のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、薬理学的遮断剤や活性化プロトコルにおける電圧を使用することなく、複数のイオンチャネル型を同時に測定する手段を提供できる可能性があることです。この手法は、あるイオンチャネル型の発現レベルが、同一組織内の他のイオンチャネル型の活性にどのような影響を与えるかなど、イオンチャネル生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。プロトコルの最初のステップは、目的の周波数成分を含むノイズ関数を作成することです。そのためには、まず周波数領域において目的の周波数成分を定義します。本研究では、1から15 kHzの周波数成分を使用します。次に、MATLABのIFFT関数を用いて逆高速フーリエ変換を計算し、選択した周波数を時間領域に変換します。その後、ノイズ関数の振幅を適切にスケーリングします。本研究では、ノイズ関数を2回スケーリングし、1回目はノイズ関数のゼロからピークまでの振幅を50 millivoltsに、2回目はゼロからピークまでの振幅を100 millivoltsに設定します。次のステップは、matlabなどのプログラムを使用して刺激ファイルを作成することです。刺激ファイルとは、clamp X eight収集ソフトウェアに対し、各時点での正確な印加電圧を指示するヘッダー付きのテキストファイルのことです。刺激ファイルを作成するには、まず適切なヘッダーを持つテキストファイルを作成し、そのヘッダーの下の第1列に単一スイープの時間増分を挿入します。時間増分は、測定に使用したサンプリング間隔と同じ時間間隔にする必要があります。本プロトコルでは、200 kilohertzのサンプリングレートを使用します。各スイープについて、各タイムステップで必要とする正確な電圧を挿入してください。各列は個別のスイープと見なされます。したがって、-150 mVから+50 mVまで5 mV刻みで変化させるプロトコルの場合、時間列の後に41列を追加する必要があります。指定された電圧には、clamp X内のノイズ関数を含める必要があります。実験ごとにプロトコルを作成する必要があるため、次のステップでは、以前に作成した刺激ファイルと互換性のある測定プロトコルを作成します。clamp Xで、刺激ファイルを現在のプロトコルに関連付けることができる「acquirer edit protocol wave zero」メニューオプションを選択してください。次のステップは、定義した刺激を細胞に与えることです。このプロトコルでは、並列RC回路を持つモデル細胞を使用します。モデル細胞を測定装置に取り付け、「record」ボタンをクリックし、「clamp X」を実行してください。この実験はコントロール目的で計画されています。データ収集後、ノイズ関数を含まない定期的な測定を必ず含めるようにしてください。次のステップは、IV曲線の作成と高速フーリエ変換（FFT）の実施です。個々の記録のIV曲線を算出するには、ノイズ関数の時間範囲外にある記録の定常状態部分を使用して、電流振幅を測定します。ノイズ関数を適用した際に記録が定常状態にない場合、ノイズ関数がIV曲線の計算を妨げる可能性があるため、その場合はコントロール記録を使用してください。記録中の各電圧ステップについてIV曲線を計算する代わりに、ノイズ関数が挿入された記録部分のFFTを計算します。各電圧ステップのフーリエ変換をM×N行列にまとめます。ここでMはFFTの周波数数、Nはこの構成における電圧ステップ数です。行列の各行は、実験におけるすべての電圧ステップでの単一周波数のFFT振幅を表しています。次のステップは、各周波数の相関係数を算出することであり、その行と以前に作成したIV曲線との相関を取ります。相関係数を記録してください。次に、IV曲線と高い相関を持つ周波数を可視化するため、相関係数を周波数に対してプロットします。ここでは、ノイズ関数を挿入せずに電圧クランプ測定を行った結果を示します。各スイープの最初と最後の20 millisecondsの間、電位は0 millivoltsの保持電位に維持されました。その間に、電圧を-150 mVから+50 mVまで5 mV刻みで階段状に変化させました。各電圧ステップの時間は80 msです。図を読みやすくするため、5回ごとのスイープのみを図に記載しています。赤色の枠は、これらのスイープにノイズ関数が適用されていた場合に、いつ適用されたかを示しています。この図は前図と同様ですが、電圧ステッププロトコルの開始から 40 milliseconds 後にノイズ関数が挿入されており、赤色の枠でノイズ関数が挿入された箇所を示しています。ノイズ関数の持続時間は 30 milliseconds で、1 から 15 kilohertz の周波数を含んでいました。この図は、モデル細胞に対して計算された IV 曲線を示しています。このIV曲線は線形であり、これはモデルセルが単純な並列RC回路であるため期待される結果です。この図は、各スイープにおけるノイズ関数なしのFFT結果を示しています。モデルセルの記録では、ノイズ関数が挿入された時間枠にわたってFFTが算出されました。赤色で強調表示されているDC成分は、IV曲線の形状を模倣しているように見えます。DCより上のすべての周波数の振幅はほぼゼロであるため、分かりやすくするために5回ごとのスイープからのFFTのみを図に含めています。ノイズ関数を挿入して記録を行いFFTを算出した場合、1～15 kilohertzの間の周波数に顕著な振幅が見られます。電圧クランプ実験では通常現れないこれらの高周波成分が存在することは、これらの周波数のいずれかの大きさが電流振幅に比例して変化するかどうかという疑問を提起します。続く3つの図は、個々の周波数の振幅と記録されたIV曲線の相関係数を示しています。1番目の図ではノイズ関数を使用していません。2番目の図では、ノイズ関数のピーク振幅を50 millivoltsとし、3番目の図ではノイズ関数のピーク振幅を100 millivoltsとしています。いずれの場合においても、DC成分、すなわち0ヘルツにおける応答の相関係数は0.99を超えており、IV曲線とほぼ完全に相関していることがわかります。また、3つの図のすべてにおいて、他の周波数の相関係数はどれも0.5を超えていない点に注目してください。さらに、50または100ミリボルトの振幅でノイズ関数を挿入しても、このパターンに変化は見られませんでした。これらの結果は、ボルテージクランプ回路およびノイズ関数自体が、IV曲線に高い相関を導入しないことを示しています。この検証は、イオンチャネルを含む調製物に本手法を適用するために重要です。この図では、2組の周波数データにおける相関の有無を示すために、IV曲線を再現しています。この図でactual IVとラベル付けされたモデルセルのIV曲線は、赤色の破線に重なっているように見える点線です。赤色の破線はDC成分を示しており、actual IVのラインとの相関係数は0.995です。表示されている3番目の曲線であるギザギザのラインは、ランダムに選択された4.399 kilohertzの周波数を示しており、相関性は低くなっています。この直線とIV曲線との相関係数は0.3212です。これらの結果は、測定機器およびノイズ関数自体が、電流振幅と相関する周波数を発生させないことを示しています。この検証に基づき、ボルテージクランプ実験中の電圧ステップにノイズ関数を挿入する本手法は、まず単一のイオンチャネル種を含む膜標本に、次いで複数のチャネル種を含む標本に適用することが可能です。単一イオンチャネル実験の結果は、ここで提案したFFTおよび相関分析を用いて解析できます。この分析を用いることで、その振幅が特定のチャネルタイプと特異的に相関する周波数を特定できます。異なるチャネルを介したイオン伝導において、複数の速度定数が役割を果たしていることを示唆する強力な根拠が提示されています。したがって、一度周波数が特定されれば、それらは一つのチャネルタイプと高く相関し、他のチャネルタイプとの相関は最小限となります。これらの周波数は、本手順に従って同時に測定された複数のチャネルタイプの現在の寄与度を推定するために利用できます。薬理学的ブロックやプリパルスなどの他の手法を用いることで、イオンチャネルがブロックされた状態や不活性化状態にあるときに、チャネルの周波数応答がどのように挙動するかといった追加の疑問に答えることができます。

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