ラットにおけるアクティブ遅延型過敏（DTH）の誘導とモニタリング

こんにちは、クリスティン・ビートンです。私はUCIの生理学・生物物理学部門にあるジョージ・チャンディー研究室で働いています。本日は、ラットにおける能動的DTHの誘導方法について説明します。

そのため、抗原となるKLHとフロイント完全アジュバントを用いてエマルションを調製します。次に、このエマルションをルイスラットの尾根に注射します。これにより、ラットにKLHに対する免疫を誘導します。1週間後、ラットにKLHでチャレンジを行い、腫脹の測定によってDTH反応を測定します。

そこがチャレンジ部位であり、DTHのような炎症反応に対するPOチャネル遮断薬の影響を調べるために、ラボでこれを活用しています。ここでは、エマルションの作成に使用する不完全フロイントアジュバントを用意しました。完全フロイントアジュバントを使用することも可能です。

こちらが本日の抗原となるKLHのクオーツで、2 mg/mLの溶液を用意しています。PBS溶液です。この5 mLシリンジを使用して、不完全アジュバントを吸い取り、15 mLチューブに移します。次に、チューブをボルテックスミキサーに固定し、ボルテックスしながら、抗原をアジュバントに一滴ずつ加えます。

その後、さらに5分間ボルテックスします。完了後、この5 mLガラス製シリンジに混合液を満たします。アジュバントにはプラスチックを腐食させる傾向があるため、必ずガラス製シリンジを使用してください。乳化には5 mLシリンジが最適であることがわかっています。

サイズがこれより小さい、あるいは大きいものは適していません。混合液でシリンジを満たしたら、このメタルブリッジを使用して、このガラスシリンジを別の5 mLガラスシリンジに接続します。次に、シリンジに圧力をかけ、エマルションが非常に硬くなるまで、混合液を一方のシリンジからもう一方のシリンジへできるだけ速く移動させます。硬くなれば、注入準備が完了です。

次に、アジュバントを2.5 mL加えます。アジュバントをより簡単に抽出できるように空気を注入し、その後、すべてのアジュバントをチューブに入れます。そして、それらを2.5 mL取り、ボルテックスミキサーで混合します。

アジュバントを2.5 mL使用したので、KLHも2.5 mL使用します。一滴ずつ加えていくと、混合物の色が変化して白くなっていくのが分かります。これで、すべてのアジュバントに抗原を添加しました。

次に、混合物をさらに5分間ボルテックスします。しかし、5分間チューブを持ち続けることは困難なため、チューブをボルテックスミキサーにテープで固定します。チューブ内で渦が発生するようにしますが、液が溢れない範囲で可能な限り高速に設定してください。この状態で5分間放置します。

5分が経過しました。ここでボルテックスを停止します。混合液は白色になっています。チューブを取り出します。おっと。

混合液は完全に白くなりましたが、まだかなり液体状です。注入にはより硬い状態が望ましいため、混合液全体を5 mLのガラス製注射器に移します。

これらのシリンジはオートクレーブ滅菌済みです。まず、シリンジ一式をブリッジに接続します。そして、もう一方のシリンジからは、バレルのみを接続します。

プランジャーを外した状態で、上部のシリンジに混合液を注ぎます。その後、すべてを下部のシリンジに移します。そして、ここにある気泡を押し出します。

そこで、上のシリンジを取り外し、気泡を追い出します。気泡は見えにくいですが、ここにあります。このようにして気泡を追い出します。

また、ブリッジ内からこれを追い出し、その後、上部のシリンジを再接続します。すべてがしっかりと接続されていることを確認し、混合物を一方のシリンジからもう一方のシリンジへと移します。最初は容易ですが、すぐに混合物が硬くなってきます。

今夜は（液が）固まりやすくなっているため、ブリッジを壊したくないので、シリンジを回転させます。時間がかかることもあります。これはエマルションによって異なります。

おそらく温度や、湿度などのレベルにも依存すると思われます。ですが、エマルションの準備が整ったようです。注いだ時よりもかなり粘度が高くなっています。

完全に白くなっており、相は1つだけです。ACO相がオイルから分離してはいけません。

これで注入の準備が整いました。浸漬液の注入準備が完了しました。注入には、1つのハットあたり200 µLを使用します。

そのため、3 mLシリンジを使用します。エマルションは非常に粘度が高く注入が困難な場合があるため、針が抜けないようルアーロック式のシリンジを使用します。また、針については、エマルションが通過できる範囲で可能な限り細いものを使用するようにしています。

今回のエマルションには20 3Gのものが十分であると分かりました。より粘度の高いエマルションの場合は、より大きなシリンジが必要になる可能性があります。手順としては、一人がラットを保持し、もう一人が注入を行います。

最大限の安全を確保するため、ラットを保持する担当者は、たとえラットが非常に穏やかでハンドリングに慣れているとしても、齧歯類用の耐噛みつき手袋を着用します。これは、最大限の安全を期し、ラットに噛まれないようにするためです。次に、エマルションをすべて1本のガラス製シリンジに入れ、ブリッジから空のガラス製シリンジを取り外します。そして、その代わりに3 mLのルアーロックプラスチックシリンジを装着します。

次に、エマルション1溝分に必要な量よりも多めに移送します。気泡を追い出します。1溝あたり200 µL注入するため、シリンジ内には300 µLを残しておきます。

ブリッジを取り外し、プラスチック製シリンジに針を取り付けます。次に針内に液体を満たし、プランジャーを200 µLまで下げます。これにより、気泡が入っていないことを確認します。これで注入の準備が整いました。

ラットが動かないように固定します。片方の手で、肩の上に一本、下に一本指を添えてラットを掴み、もう片方の手で後ろ脚と尾を保持します。次に、側腹部のこちら側に数µL、もう一方の側腹部に数µLを注入します。先週、抗原としてKLHを含むエマルジョンを用いてラットに免疫を行いました。

本日は、抗原であるKLHおよび関連抗原である卵白アルブミンを、ラットの背中に皮内投与して感作を行います。まず、背中への皮内投与を可能にするため、脱毛させる必要があります。ここでは、シンプルな電気シェーバーを使用します。また、針の鈍化を防ぐため、ラット1匹ごとに針を交換します。

これにより、特に各抗原を20 µLという少量で投与する場合、皮内注射が非常に容易になります。これで、すべてのラットに2つの抗原を注射し終えましたので、明日までケージに入れておきます。明日になれば、炎症を確認できるはずです。

注射部位が赤く腫脹するため、その炎症部位の直径を測定することで炎症の程度を評価することができます。昨日、ラットの背中に、関連抗原であるKLHおよび非関連抗原である albumin を皮内投与しました。投与から24時間が経過しましたので、ラットを確認し、炎症が起きているかを確認します。

したがって、KLH投与部位のみに炎症が起こると予想され、その炎症は発赤と腫脹として現れます。炎症が確認された後、炎症部位の直径を測定することで、炎症範囲を定量します。ここがKLH投与部位であり、明らかな強い炎症が認められます。

通常の皮膚と比較して非常に赤く、腫れています。次に、アルブミンを投与したもう一方の部位を見ると、ここに注射部位が確認できますが、著しい赤みや腫れは見られません。したがって、陰性対照は機能しました。

次に、炎症部位の大きさを測定します。ここでは一般的な定規を使用し、ミリメートル単位で測定します。こちらは6 mmであり、続いて2回目の測定を行います。

これは5 mmです。赤みはほとんどありません。測定しますが、かろうじて1 mm程度です。以上が、抗原を用いてエマルションを調製する方法、このエマルションでラットに免疫する方法、その1週間後に免疫に使用した抗原および関連抗原でチャレンジする方法、そしてChan研究室で用いられている炎症の程度の可視化および測定方法の説明となります。

我々は、ラットにおける炎症に対するカリウムチャネル遮断薬の影響を測定するための簡便なアッセイとして、この手法を日常的に使用しています。