Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

こんにちは、スティーブです。私はカリフォルニア大学アーバイン校病理学部のFlanagan博士の研究室に所属しています。今日は、maxis核移行因子を用いてヒト神経前駆細胞をトランスフェクションする方法をご紹介します。

まず、大量の細胞が必要になります。このプロトコルでは非常に高い細胞密度が要求されるため、少なくともコンフルエントなT 25フラスコ1本分、つまり最低100万個の細胞を用意してください。はじめに、細胞解離バッファーを用いて細胞を表面から剥離させ、その数をカウントします。

その手順については、私のパッケージングプロトコルをご参照ください。また、導入実験にAmaxaを好んで使用する理由は、Amaxaが特定の細胞型、私の場合では神経幹細胞向けにカスタマイズされた導入プロトコルを開発しているためであり、非常に優れた結果が得られています。

非常に高い transfection 効率と非常に高い細胞生存率が得られます。それでは、始めていきましょう。これで transfection の準備が整いました。

このトランスフェクションの準備として、あらかじめ組織培養皿にフィブリンをコーティングし、一晩置いておきました。その後、増殖培地を加えています。現在はインキュベーター内で、細胞を播種するまで待機している状態です。

また、すべての試薬、DNAベクター、およびトランスフェクション溶液の準備が整っています。これらはすべて氷上で待機させています。これでトランスフェクションを開始する準備ができました。

これがM max核因子です。フードに入れる前に、70% ethanolで消毒し、ペーパータオルで拭き取ります。合計400万個の細胞になるよう計数して播種しました。これで、トランスフェクションを開始する準備が整いました。

まず、細胞が入っている培地を除去します。ここに細胞ペレットがありますので、使用していた培地を吸引して取り除きます。トランスフェクション培地の中にタンパク質などが含まれていると、トランスフェクションプロトコルに影響を及ぼす可能性があるため、できるだけ多くの培地を除去するようにします。

ほぼすべての培地を除去しましたので、ここからこの細胞ペレットを、特別に調製された100 µLのマウス神経幹細胞核因子溶液に再懸濁します。Mxa社はマウス神経幹細胞のトランスフェクション用溶液を販売しており、ヒト神経幹細胞用のものはありませんが、マウス細胞用のものを使用しても非常にうまくいくことがわかりました。したがって、このマウス神経幹細胞核因子溶液を100 µL加えます。

次に、細胞ペレットを十分に再懸濁し、細胞の凝集塊が残らないようにします。これにより、ほぼ均一な細胞懸濁液を作成します。ピペッティングを10回ほど繰り返します。

十分に均質な混合液が得られたと思われますので、これを1.5 mLのオープンエンドマイクロチューブに移します。P1000ピペットを使用し、溶液をすべて回収するようにします。これで、4 × 10⁶個の細胞がマウス用新 transfection 溶液に再懸濁されました。ここに、ベクターを5 µL添加します。

これまでずっと氷上で保存していました。まず、5 µLを分注します。次に、これを細胞懸濁液に加えます。

次に、約50 µLに設定したP 200を使用し、細胞とベクターを十分に混合します。ピペッティングを10回繰り返します。これで準備が整いました。

それでは、トランスフェクションの準備が整いました。新しいエッペンドルフチューブを開け、Amaxa社提供の専用ピペットを用意します。

キャップを取り外し、この混合液をゆっくりと吸い上げます。次に、ピペットをチューブの底まで差し込み、溶液をゆっくりと分注します。そして、max nuclear factorの電源を入れ、設定を33 0 3 3に合わせ、エンターキーを押します。

次に、VetteをVetteホルダーにセットし、ホイールを回転させます。これでトランスフェクションの準備が整いました。ただし、その前に、トランスフェクション後の細胞にすぐに添加できるよう、温めた培地を用意しておきます。トランスフェクション直後に温めた培地をVetteに添加することで、細胞生存率を高めることができます。

そこで、P 1000を準備します。また、細胞をすぐに培地へ移せるよう、現在インキュベーター内にある培地を入れたプレートを用意します。では、もう一度エンターキーを押します。これで完了です。

そして、成功したトランスフェクションでは、このように非常に厚い気泡の層が見られ、これがトランスフェクションの成功を示しています。そこで、予め温めておいた培地500 µLをV-bottomプレートに加えます。細胞が必要としている培地をさらに添加し、同じMXピペットを使用してプレートから細胞を回収します。

細胞は現在非常にストレスを受けている状態です。そのため、温めた培地をさらに加え、直接投入します。そして最後のステップとして、Q veteをあらかじめ温めておいた培地でさらに洗浄し、すべての細胞を確実に回収してから、同じウェルLに入れ、直ちにプレートをインキュベーターに設置します。

この画像では、核移行因子を導入し、グリッド付きカバーガラス上に播種したヒト神経前駆細胞を示しています。導入から2日後であっても、GFPの発現によって確認できる通り、約50%の導入効率が得られています。本日は、Xis核移行因子を用いたヒト神経前駆細胞への遺伝子導入方法について解説しました。

トランスフェクションの成功をお祈りします。