Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト
2007年7月19日
細胞内に目的の遺伝子を導入することは生体内でその機能を解明するための強力な方法です。このプロトコルは、AmaxaによるNucleofectorエレクトロポレーション装置を用いてヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の文化をトランスフェクションの効率的な方法を説明します。
こんにちは、スティーブです。私は、アーバインにあるカリフォルニア大学医学部の病理学科のフラナガン博士の研究室で働いています。今日は、maxis核因子を使用してヒト神経前駆細胞をトランスフェクションする方法をお見せします。
最初に始めると、たくさんのセルが必要になります。このプロトコルでは非常に高い細胞密度が必要なため、少なくともコンフルエントなT 25フラスコが必要だと思いますので、少なくとも100万個の細胞が必要になります。まず、細胞解離バッファーを使用して細胞を表面から取り出し、次にそれらをカウントすることから始めます。
そして、その手順については、私のパッケージングプロトコルを参照してください。そして、私がトランスフェクション実験でmax maxaを好む理由は、amaxaが特定の細胞タイプ、私の場合は神経幹細胞に対してオーダーメイドのトランスフェクションプロトコルを開発しているからです。そして、それは素晴らしい働きをします。
非常に高いトランスフェクト効率と非常に高い細胞生存率を提供します。それでは、始めましょう。だから今、トランスフェクションを行う準備ができました。
そのため、このトランスフェクションの準備として、私はすでに組織培養皿にフィブリンを一晩中コード化しています。その後、成長培地を入れました。ですから、今はインキュベーターに座って細胞を受け取るのを待っています。
また、すべての試薬、DNAベクター、トランスフェクション溶液もすべて準備しました。だから、みんな氷の上で待っているんだ。そして、トランスフェクションを開始する準備が整いました。
これがMの最大核因子で、フードに入れる前に70%エタノールで消毒し、ペーパータオルで拭き取ります。だから、私はちょうど自分自身を数えて、合計400万個の細胞を持ってそれらをスポーンしました。そして今、私はトランスセクトを開始する準備ができました。
そこで、まず、それらが入っているメディアを削除します。だから、ここにセルパレットがあるんだけど、それが入っていたメディアを吸い取るんだ。そして、トランスフェクション培地にタンパク質などが含まれないように、できるだけ多くの培地を取り除こうとしています。なぜなら、トランスフェクションのプロトコルに影響を与える可能性があるためです。
そこで、ほとんどの培地を取り除いたので、今度はこの細胞パレットを、この特別に配合されたマウス神経幹細胞核因子溶液の100マイクロリットルに再懸濁します。MXAは、マウス神経幹細胞をトランスセクトするためのトランスフェクションソリューションを製造しており、ヒト神経幹細胞用のトランスフェクションソリューションはありませんが、マウス細胞用のトランスフェクションソリューションを使用すると非常にうまく機能することがわかりました。そこで、このマウス神経幹細胞核エフェクター溶液を100マイクロリットルに注ぎます。
そして、細胞の塊が残らないように、細胞細胞パレットを非常によく吊り下げます。つまり、私は均質な細胞懸濁液を持っているということです。だから、10回くらいパイプを上下に動かします。
だから、私は今、かなり均質な混合物を持っていると思う、そして私は今、それを1.5ミルのオープンドルフチューブに移すつもりです。そこで、私はP 1000ピペットを使用しており、このソリューションをすべて確実に入手できるようにしています。そこで、400万個の細胞reusをマウスに懸濁させた新しいマウストランスフェクションソリューション、そして今度は5マイクロリットルのベクターを追加します。
だから、今までずっと氷の上に置いておいてきました。そこで、まず5マイクロリットルをクワッドします。そこで、今度はそれを細胞懸濁液に加えます。
次に、約50マイクロリットルに設定されたP 200を使用し、細胞とベクターを非常によく混合します。だから、10回上下にパイプでつなぐつもりです。さて、これで準備ができました。
そして、私は、トランスフェクションする準備ができています。ということで、新しいエッテを開けてみます。また、amaxaが提供する特別なピペットも手に入れるつもりです。
だからキャップを外して、このミックスをそっと引き上げます。そして、ピペットを獣医に完全に挿入し、溶液をそっと絞り出します。そこで、最大核係数をオンにし、これを 33 0 3 3 に設定して Enter キーを押します。
次に、獣医を獣医ホルダーに入れ、ホイールを回転させて、トランスフェクションの準備が整いました。しかし、その前に、トランスフェクションした細胞にすぐに追加できる温かい培地を用意しておくつもりです。これは、トランスフェクションの直後に温かい培地を獣医に加えると、細胞の生存率を高めるのに役立ちます。
そこで、P1000を用意します。そして、今インキュベーターに座っているメディアで再生して、細胞をすぐにメディアに移すことができるようにします。だから今、私は、今、私はもう一度Enterキーを押して、それで完了です。
そして、トランスフェクションが成功したとは、ご覧の通り、トランスフェクションが成功したことを示す非常に厚い泡の層がここにあります。そこで、500マイクロリットルの温めた培地を獣医に加えます。そこで、細胞が切実に欲しがっている培地をさらに追加し、同じMXピペットを使用して細胞を獣医から取り出すつもりです。
だから、彼らは今、本当にストレスを感じているのです。だから、私は彼らを直接暖かいメディア、もっと暖かいメディアに入れるつもりです。そして最後に、最後のステップとして、Q veteをさらに温めた培地ですすいで、これらの細胞をすべて取り出し、これを同じウェルLに入れ、プレートをすぐにインキュベーターに入れます。
この画像では、アクセス核因子がトランスフェクションされ、格子状のカバースリップにメッキされたヒト神経前駆細胞が見られます。そのため、トランスフェクション後2日後でも、GFP発現で観察できるトランスフェクション効率は約50%です。今日は、Xis核因子を使用してヒト神経前駆細胞をトランスフェクションする方法を紹介しました。
トランスフェクションの成功を祈ります。
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概要
このプロトコルは、Nucleofector 電気穿孔装置を使用してヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）をトランスフェクトする効率的な方法を概説しています。このプロセスは、in vivo で遺伝子機能を研究するために重要です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝子機能分析
背景
- トランスフェクションは遺伝子研究の重要な技術です。
- ヒト神経前駆細胞は神経科学研究に不可欠です。
- Nucleofector 技術はトランスフェクション効率を向上させます。
- 遺伝子機能の理解は神経生物学への洞察につながる可能性があります。
研究の目的
- hNSPCs に目的の遺伝子を導入すること。
- 神経的文脈における遺伝子の機能を解明すること。
- 研究者のための信頼できるプロトコルを提供すること。
使用された方法
- バッファーを使用した細胞解離。
- 高密度を確保するための細胞カウント。
- 電気穿孔のための Nucleofector 装置の使用。
- ヒト神経前駆細胞のトランスフェクション。
主要な結果
- hNSPCs の成功的なトランスフェクション。
- 効果的なトランスフェクションには高細胞密度が重要です。
- プロトコルは結果の再現性を示しています。
- 遺伝子機能に関するさらなる研究を促進します。
結論
- このプロトコルは hNSPCs の遺伝子トランスフェクションに効果的です。
- 将来の神経科学研究の基礎を提供します。
- 神経発達における遺伝子役割の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Transfecting human neural stem/precursor cells (hNSPCs) remains a bottleneck in neuroscience target validation due to low efficiency and viability with conventional methods. The Nucleofector electroporation protocol described enables reliable gene delivery with ~35% initial and ~70% stable transfection efficiency, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach improves predictive confidence for pathway interrogation and functional target validation in neurodegenerative disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets in a physiologically relevant human neural system.
- Operational Value: Achieves high transfection efficiency without viral vector production timelines or biosafety concerns.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking gene modulation to neural phenotypes in a scalable format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs (e.g., GFP expression) for dose-response and phenotypic screening.
- Operational Value: Uses standardized electroporation parameters and optimized buffer for reproducible results across experiments.
- Assay Readiness: Produces stably transfected cells suitable for long-term assay development and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses primary human neural cells, enhancing relevance to human disease mechanisms over immortalized lines.
- Preclinical Modeling: Enables creation of isogenic neural models for target validation and mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates early assessment of target modulation effects before committing to in vivo models.
Pipeline & Workflow Integration
The Nucleofector transfection method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through to lead identification by enabling reliable gene modulation in disease-relevant human neural cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via efficient gene overexpression or knockdown in hNSPCs.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable transfection metrics for compound screening and target validation.
- Analytics: Enables fluorescence-based readouts (e.g., GFP) to quantify transfection efficiency and correlate with phenotypic outcomes.
- Translational Research: Uses primary human cells to improve translational fidelity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable transfection platform for multiple targets and programs in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through efficient, reproducible gene delivery in primary human neural cells.
- Operational Value: Eliminates need for viral vector production, reducing timelines and biosafety overhead.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional assessment of targets in a human-relevant system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing biological ambiguity in target mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and electroporation optimization.
- Depends on access to Nucleofector device and cell-type-specific transfection solutions.
- Necessitates standardization of cell density and DNA concentration across users and labs.
- Involves adaptation considerations when extending to other primary neural or non-neural cell types.
- Limited by the need for high cell input and immediate post-transfection handling to maintain viability.
