Name: 癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶマイクロパターン表面を用いたヒアルロン酸と癌細胞の相互作用の可視化手法。カルボジイミド化学と微細接触印刷により、腫瘍微小環境における細胞接着・遊走・増殖を詳細に解析し、がん治療戦略の開発に貢献する。

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著者らは、国立科学財団を通じて、材料研究科学工学センターの一部として資金を供給ジョンズホプキンス、少なくとも表面分析実験室の使用を認めます。 LEDはIGERT研修生と国立科学財団大学院のフェローです。この研究は、部分的にNIHの助成金U54CA143868によってサポートされていました。

1。マイクロパターンスタンプ作製のための標準的なフォトリソグラフィー<ol><li>エタノールで新しいシリコンウエハをリンスし、空気の流れで水分を拭き取ります。ウェハを処理し、全体のプロセスの間に表面欠陥を防止するために鉗子を使用してください。 </li><li> SU - 2025ネガ型フォトレジストを塗布し、カバーウエハの表面を回転させるウエハを転送する。フォトレジストとウェーハの少なくとも80％をカバーしています。 3000rpmの時に30秒間続いて600rpmで10秒間スピンコート、。フォトレジストの感光性のために、前方にこの点から、部屋の照明をオフにしてください。 </li><li> 3分間95℃で"ソフトベーク"のためにホットプレートにコーティングされたシリコンウェハをフォトレジスト転送する。ホットプレートから外し、1分を冷却することができます。 </li><li>フォトレジストで覆われたシリコンウェハの上に所望のパターンを持つプレハブマスクを置き、20秒間紫外線（UV）照射（350〜450 nm）にさらす。 </li><li> 110"ハードベーク"のためのホットプレートに転送シリコンウエハ℃で6分間。 </li><li>ライトの電源を入れ、ホットプレートからウェハを取り外す。明確なパターンは、この時点で表示されるはずです。 </li><li>慎重にSU - 8フォトレジストの現像液でシリコンウエハをリンス。現像液の3洗浄した後、エタノールですすいでください。いずれかの白い残留物が存在する場合は、フォトレジスト現像液でリンス繰り返す、または単に水没ウエハを現像液で2分間とすすぎエタノールを進めます。水と空気乾燥で洗浄する。 </li><li>午前10時01分重量比で混合ポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液と硬化剤。気泡を除去するために5分間900rpmで遠心する。 </li><li>場所は、ペトリ皿の中でウェーハをパターニングしてシリコンウエハ上にPDMSを注ぐ。泡が消えるまで泡がカップル分間desicatorと真空の場所は、現在がある場合。 </li><li>補完的なエラストマーのスタンプを形成するために室温（RT）で一晩硬化する。 PDMSは、完全に30分間60℃のオーブンで行われる12時間、後硬化されていない場合。 </li><li>慎重にシリコンウエハからPDMSを削除します。希望のサイズにスタンプをカットするためにかみそりのエッジを使用してください。 15分間エタノールで超音波洗浄します。ウェーハは、新しいエラストマーのスタンプを作成するために複数回利用することができます。 </li></ol> 2。 HAのマイクロパターニング<ol><li> 5分間のプラズマ清浄なガラススライド。 5分間チャンバーと真空中にすべてのスライドを置きます。その後、酸素の低流量でチャンバーを入力することができます。 5分間のプラズマクリーナーを入れます。鉗子を用いてシャーレにプラズマクリーナーと場所から削除します。 </li><li>プラズマ洗浄の間に、15分間エタノールでPDMSスタンプを超音波で分解する。 </li><li> 15 mLの遠心管の95％v / vエタノールで3 - アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）の新鮮な3パーセントv / v溶液を準備します。シラノールを形成するために室温で5分間反応することができます。 </li><li>パターンアップスピンコーターチャックとカバーの上に置いてPDMSスタンプは、APTMS液で表面をパターン化。 30秒間3500rpmでSpincoat。 PDMSスタンプの唯一の側面は、切手の表面に触れないでください。 </li><li>パターン化された側の一方の端に下向きにセットのスタンプを、それが1分間、ガラス表面に接触して完全になるように静かにPDMSを押すと、GLIDE：プラズマへ転送APTMSソリューションは、ガラス面を掃除した。 </li><li> PDMSは優しくスタンプと削除、およびパターン化されたスライドガラスは、30分間室温でインキュベートすることができます。エタノールと空気乾燥でパターン化表面を洗浄します。過剰APTMSを削除するには、15分間PDMSスタンプを超音波処理してください。 </li><li> 115℃で1時間オーブンでまたはホットプレート上に熱表面℃のエタノールでリンスし、空気で乾燥させます。 </li><li>トルエンの[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン - 新鮮なポリエチレングリコール（PEG） - シラン20パーセントV / V 2の溶液を調製します。これは、パターンを囲む非接着領域として機能します。 </li><li> 75℃で45分間、PEG -シラン溶液中でガラスシャーレのインキュベートに転送パターン化されたスライドガラスをホットプレート上に° C。トルエン、水、および空気と乾燥ですすいでください。 </li><li>生物学的安全キャビネット内の紫外線殺菌照射を使用して1時間滅菌する。無菌性を維持するために前方にこの時点から、生物学的安全キャビネットに進みます。 </li><li>水性滅菌HAソリューションを準備。 1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の10mMの N -ヒドロキシスクシンイミドの5mMの 50μg/ mLのフルオレセイン標識HA </li><li>無菌状態でパターニングされたガラス基板にHAソリューションを適用し、光から保護。パターニングされた基板は、16〜24時間静にする必要があります。 </li><li> HAソリューションをオフ吸引、で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水を（PBS）、及び1時間PBSで（BSA）の1％ウシ血清アルブミンとの表面を覆う。表面は細胞培養の準備ができています。 </li></ol> 3。 HAマイクロパターン表面上における細胞培養<ol><li>製造業者の指示に従って、MDA - MB - 231ヒト乳癌細胞とLS174T大腸癌細胞を展開。 </li><li> 0.4 × 10の間に密度のがん細胞のシード単細胞懸濁液<sup18.75>2ガラスの表面積当たりとHA固定化表面へ&gt; 6癌細胞。 5％CO 2で維持雰囲気で加湿インキュベーター（37℃）でインキュベートする。細胞接着は、24時間以内に発生する必要がありますし、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。 </sup18.75></li><li>細胞培養表面は、標準的なインキュベータの条件で5日間まで維持することができます。一日おきにメディアを変更します。細胞の形態と成長は、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。追加の細胞アッセイは、HAの表面への応答を分析するために適用することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果： 共有結合APTMSパターニングされたガラススライドにHAを固定するために使用されるカルボジイミド化学を図1Aに示されています。 EDCは、アミン反応性中間体を形成するために、HAのカルボキシル基と反応して長さゼロの架橋剤です。この中間体が加水分解を受けやすいとして、NHSは、カルボジイミド反応効率を高めるために追加されます。 HAソリューションはAPTMS微細パターン、HAの中間とATPMSの第一級アミンとの間の安定したアミド結合の形態と相互作用として。 HAパターン表面の例は、HAのパターン化された固定化を示す蛍光顕微鏡とImageJの蛍光強度の解析を用いて可視化（ 図1B - C）が表示されます。 HAマイクロパターン表面はexpgenous HAと癌細胞の相互作用の研究を可能にします。 MDA - MB - 231ヒト乳癌とLS174Tヒト大腸癌細胞株の両方が優先的にHAマイクロパターン領域（ 図2）に従っている。走査型電子顕微鏡を用いた高分解能イメージングは、HA固定化表面（ 図3）による培養細胞の相互作用を分析するために使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 HAマイクロパターン表面のHA機能面の開発を記述する（）回路図、フルオレセインの（B）蛍光画像（緑）で標識されたHAマイクロパターン化表面。離散的なHAのパターンを示すImageJのソフトウェアを使用して（C）3Dピクセルの分布図。スケールバー=100μmの。エルゼビアから許可を得て9日から変更。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> HAマイクロパターン表面上に図2。癌細胞接着。コロン（）と乳房（B）癌が優先的に文化の24時間とHAのパッチに付着両方。エルゼビアから許可を得て9日から変更。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> HAと図3。癌細胞の相互作用。 （A）大腸癌細胞の低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）に示すように、HAの表面上に（）培養の電子顕微鏡像を走査し、乳癌細胞の（B）に示すように、HA表面上で培養低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）。

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
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<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

許可を得て複製したビデオの概略図;著作権ワイリー- VCH出版社＆Co KGaA社。ディッキンソンLE、マラヤS、生体材料を使用して、胚性幹細胞の分化のニッチを再構築Gerecht S.。 Macromol。バイオサイエンス。 2010; 10月21日。 [印刷の前にトップ|]。

提示HAの微細方法は、外因性HAと細胞の相互作用の研究が可能になります。 HAは、癌の進行1に重要な役割を果たすことが知られているしかし、二次元のHAパターニング表面上での癌細胞の相互作用を調査する限られた研究が行われている。外因性HAの微細パターンで制御可能研究は癌細胞の接着、成長、および移行の高解像度可視化を可能にし、癌のさらなる基礎を解明することができる。 カルボジイミドの化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることにより、我々は癌細胞の相互作用を研究するために、異なるHAパターンで表面を開発しました。このメソッドは、一貫してを含む細胞培養および解析技術と互換性のある表面をパターン化が、免疫蛍光染色、走査型電子顕微鏡、阻害、移行、などに限定されないことができますさらに、フォトリソグラフィ技術は、特定のアプリケーション用のHAの固定化を制御するために、任意のパターンの簡単な微細加工を可能にする。例えば、線形ストライプでPDMSスタンプを製造する線形配列でHAを固定化だし、パターニングされた...

<table><tbody><tr><td>SU-2025フォトレジスト</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8現像液</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリメトキシシラン (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2-[メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシコハク酸イミド (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン標識ヒアルロン酸 (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>10mlの脱イオン水で再構成</td></tr><tr><td>MDA-MB-231乳がん細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t結腸がん細胞</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

癌の浸潤や進行は、腫瘍の微小環境内での増殖因子/サイトカインや細胞外マトリックス（ECM）成分による複雑な規制下にある運動性細胞の表現型を伴います。ヒアルロン酸（HA）は、強化の侵入、増殖、および血管新生1で腫瘍の進行を容易にするために確認されている間質ECMコンポーネントです。その細胞表面の受容体CD44とHAの相互作用は、それによって転移拡散2-3増加、腫瘍細胞の増殖、生存、および移行を促進するシグナル伝達事象を誘導する。 HAは、D -グルクロン酸とDN -アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成される陰イオン性、nonsulfatedグリコサミノグリカンである。 、二糖繰り返し単位のカルボキシル及びヒドロキシル基の存在のためにネイティブHAの大部分は親水性とphotoreative固定化4-5硫酸基を導入する化学修飾の影響を受けやすいです。表面にHAの固定化を含むこれまでの研究では6-7表面上に細胞接着を制御するために、HAのbioresistant挙動とその硫酸化誘導体を利用する。これらの研究では細胞接着には、優先的に非HA模様の領域で発生します。 外因性のHAと細胞間相互作用を分析するために、我々は、制御の研究とHAと癌細胞の相互作用の高解像度可視化を可能にするパターン化された官能化された表面を開発しました。我々は、ガラスの表面にHAの離散パターン領域を定義するためにマイクロコンタクトプリンティング（UCP）を利用。 HAを固定化するカルボジイミドリンク化学を適用する&quot;テザリング&quot;のアプローチは8を使用しました。ガラスの表面は、マイクロコンタクトをアミノシランで印刷し、パターン化された配列にHA固定化を有効にするEDCとNHSの最適比率のHA溶液と反応させた。 MCPを搭載したカルボジイミド化学を組み込むと、in vitroでのアプリケーションに適したサーフェスを作成、定義された領域にHAの固定化を可能にした。両方の結腸癌細胞および乳癌細胞は、暗黙的にHAマイクロパターン表面と相互作用した。癌細胞の接着は、48時間で増殖して24時間以内に起こった。 HAマイクロパターン表面を使用して、我々は癌細胞の接着は、HA受容体CD44を介して起こることを示した。さらに、HA柄の表面は電子顕微鏡（SEM）と癌細胞の接着剤の突起の許容される高解像度の画像をスキャンし、外因性のHA上で癌細胞の運動性を分析するためにHAパターンで拡散との互換性があった。

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。

がんの浸潤および進行には運動能を持つ細胞表現型が関与しており、これは成長因子やサイトカイン、および細胞外マトリックスによる複雑な制御を受けています...

がんの浸潤と進行には、腫瘍微小環境内の成長因子、サイトカイン、および細胞外マトリックス成分による複雑な調節下にある、特定の細胞表現型が関与しています。ヒアルロン酸（HA）は、細胞表面受容体であるCD 44との相互作用を通じて、浸潤、増殖、および血管新生を促進し、腫瘍の進行を促進することが知られている間質細胞外マトリックス成分の一つです。CD 44は、腫瘍細胞の増殖、生存、および遊走を促進するシグナル伝達事象を誘導し、それによって転移の広がりを増加させます。本研究では、外来性HA上でのがん細胞の接着、遊走、および増殖について検討します。標準的なフォトリソグラフィーを用いてマイクロパターンエラストマースタンプを作製し、それを用いてガラス基板上にアミノシラン分子のパターン化アレイを作成します。次に、カルボジイミド化学を用いて、マイクロパターン化されたアミノシランにHAを共有結合させます。これによりHAのマイクロパターンが形成されます。培養したがん細胞をこのHAマイクロパターン上に播種することで、外来性ヒアルロン酸とがん細胞との相互作用を、光学顕微鏡や走査電子顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡などの高解像度イメージング技術を用いて視覚化することができます。本ビデオ記事で紹介するマイクロパターンHA表面の作製方法は、がんの進行における外因性ヒアルロン酸の役割をさらに解明するなど、がん研究分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。まず、ガラススライドにHAをインプリントするために使用する、マイクロパターンポリメチルシルセスキオキサン（PMSE）またはPDMSスタンプを作製します。まず、ピンセットで新しいシリコンウェハーを取り上げます。次に、ラボのシンクの上で作業します。洗浄ボトルを用いてウェハをエタノールで洗浄し、エアストリームで乾燥させます。室内の照明を消します。次に、ピンセットを使用してウェハーをスピンコーターに移します。転写ピペットを用いてウェハー表面の少なくとも80%をSU 2025ネガフォトレジストで覆い、600 RPMで10秒間スピンコートします。続いて3000 RPMで30秒間コートし、フォトレジストを塗布したウェハーをホットプレートに移して、95°Cで3分間ソフトベークします。その後、ホットプレートから取り出し、1分間冷却させます。所望のパターンが形成されたプリフェブリケートマスクをフォトレジスト塗布済みのウェハの上に配置し、20秒間UV照射します。次に、ウェハをホットプレートに移し、110°Cで6分間ハードベイクします。照明をつけ、ホットプレートからウェハーを取り出します。この時点で、転写ピペットを用いて明確なパターンが確認できるはずです。ウェハーを現像液で3回すすいだ後、SU-8フォトレジスト現像液で慎重に洗浄し、エタノールでリンスします。白い残留物が残っている場合は、フォトレジスト現像液で洗浄を繰り返すか、単にウェハを現像液に2分間浸し、再びエタノールで洗浄し、水で洗い流した後、大型のウェハボートに入れてエアフローで乾燥させます。ここに示すウェハの場合、PDMSエラストマー溶液と硬化剤を10:1の重量比で混合し、22gあれば十分です。遠心チューブに注ぎ、900 RPMで5分間遠心分離します。気泡を除去するため、パターン形成済みウェハーを適切なサイズのペトリ皿に入れます。ウェハーが完全に覆われるように、厚さが約1/4インチになるまでPDMS溶液を注ぎます。ウェハーの表面に気泡がある場合は、気泡が消失するまで真空デシケーターに入れます。室温で一晩硬化させ、相補的なエラストマー stamps を作製します。12時間後にも PDMS が完全に硬化していない場合は、ウェハーを60 °Cのオーブンに30分間入れます。ウェハーから PDMS を慎重に剥がします。次に、カミソリを使用して、スタンプを希望のサイズに切り出します。スタンプをエタノールとともにガラス製ビーカーに入れ（できればプラスチックホルダーを使用してください）、15分間超音波処理します。ウェハーは繰り返し使用できるため、ガラス表面の規定のパッチにhaを共有結合で固定化するための新しいエラストマースタンプを作成することが可能です。まず、付属テキストの指示に従い、使用するすべてのスライドをプラズマクリーナーで洗浄します。ガラススライドの洗浄後、ピンセットを使用してプラズマクリーナーから取り出します。スライドをプラスチック製のペトリ皿に入れ、後で使用するまで置いておきます。次に、HAを結合させるためにガラススライドにスタンプするためのアミノシラン溶液を、15 mLのポリスチレン製遠心チューブで調製します。95% v/v エタノールを用いて、3% v/v の3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）溶液を合計5 mL調製し、室温で5分間反応させます。この期間に、A-P-T-M-Sは加水分解によりシイノールに変換されます。次に、側面のみを持って、PDMSスタンプをパターン面を上にしてスピンコーターのチャックに配置します。トランスファーピペットを使用して、パターン表面をA-P-T-M-Sで覆います。次に、スタンプの表面にA-P-T-M-Sを塗布し、3,500 RPMで30秒間スピンコートします。スピンコーターからPDMSスタンプを取り出し、パターン面が下を向くように反転させ、PDMSスタンプの一端をガラススライドの中心に合わせ、スタンプ全体がガラススライドに密着するように1分間軽く押し付けます。続いて、PDMSスタンプをゆっくりと取り除き、A-P-T-M-Sでパターニングされたガラススライドを室温で静置させます。30分後、パターン表面をエタノールで洗浄し、エアストリームで乾燥させます。過剰なA-P-T-M-Sを除去するために、PDMSスタンプを15分間ソニケーションします。その後、スライドをホットプレートに置き、115 °Cで1時間加熱して表面を加熱し、余分な水分を除去します。エタノールで洗浄し、ピンセットを用いてエアドライします。パターンを形成したスライドをガラス製ペトリ皿に移します。転送ピペットを使用して、新鮮に調製したポリエチレングリコールまたはPEG-cline溶液でガラススライド全体を完全に覆います。これにより、パターンの周囲に非接着領域が形成されます。75 °Cで45分間インキュベートした後、過剰なPEG生理食塩水を捨てます。次に、ピンセットでガラススライドを保持しながら、パターン形成済みガラススライドの表面をトルエンで洗浄し、続いて水で洗浄した後、エアストリームで乾燥させます。スライドを湿潤スライドボックスに入れます。次に、ボックスを生物学的安全キャビネット内に配置し、UVランプを1時間点灯させて殺菌照射を行います。これ以降の操作はすべて生物学的安全キャビネット内で行ってください。フード外での無菌状態を維持するため、10 millimolarの滅菌HA水溶液を1 milliliter調製します。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）5 mMおよびN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）50 µg/mLを使用します。滅菌済みのフルオレセイン標識HA用EDCは、HAのカルボキシル基と反応してアミン反応性中間体を形成するゼロレングス架橋剤です。この中間体は加水分解しやすいため、カルボジイミド反応の効率を高めるためにNHSを添加します。次に、パターン化されたガラスのパターン領域が覆われるまで、滅菌したHA溶液を200 µLずつ分注します。その後、スライドボックスを閉じて、スライドを光から保護します。パターン基板をフード内で16〜24時間静置します。これにより、HA溶液がマイクロパターン化されたA-P-T-M-Sと反応し、HA中間体とA-P-T-M-Sの一次アミンとの間に安定したMI結合が形成されます。翌日、APAティアピペットを用いてHA溶液を吸引除去します。スライドをPBSで洗浄し、その後、PBSで調製した1% BSA溶液で表面を1時間覆います。これで、表面が細胞培養に適した状態になります。HAマイクロパターン表面で培養するため、HAマイクロパターン表面を滅菌済みのペトリ皿に配置します。がん細胞の単細胞懸濁液を、ガラス表面18.75 cm²あたり0.4〜1×10⁶個の密度で、1 mLの細胞培地を用いてガラススライドの表面を覆うように播種します。細胞を、37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーターに慎重に配置します。培地が溢れないように注意してください。細胞の接着は24時間以内に起こり、倒立光顕微鏡を用いて観察できます。細胞培養表面は最大5日間維持することができます。標準的なインキュベーター条件下では、1日おきに培地を交換してください。細胞の形態と増殖は、倒立光顕微鏡を用いて観察することができます。次に、ここで示した例におけるHA表面への応答を分析するために、さらなる細胞アッセイを適用することができます。蛍光顕微鏡を用いて可視化したHAパターン表面と画像。J 蛍光強度解析は、HAのパターンの脱離を実証しています。HAマイクロパターン表面を用いることで、外来性HAとがん細胞との相互作用を研究することが可能になります。ここでは、HAマイクロパターン表面におけるがん細胞の接着を示しています。培養24時間後、結腸癌細胞と乳癌細胞の両方が優先的にHAパッチ上に接着しました。走査電子顕微鏡を用いた高解像度イメージングにより、培養細胞とHA固定化表面との相互作用を解析できます。この走査電子顕微鏡写真では、大腸がん細胞とHAの相互作用が確認でき、右側には高倍率像が示されています。同様に、HA表面で培養された乳がん細胞をここに示し、右側に高倍率像を掲載しています。この解析により、がん細胞のHAマイクロパターン上での広がりを促進する接着性の突起が存在することが明確に示されました。このビデオを視聴することで、HAマイクロパターンの作製方法と、それを用いてがん細胞の応答を研究する方法について十分に理解することができます。

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

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