癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

がんの浸潤と進行には、腫瘍微小環境内の成長因子、サイトカイン、および細胞外マトリックス成分による複雑な調節下にある、特定の細胞表現型が関与しています。ヒアルロン酸（HA）は、細胞表面受容体であるCD 44との相互作用を通じて、浸潤、増殖、および血管新生を促進し、腫瘍の進行を促進することが知られている間質細胞外マトリックス成分の一つです。CD 44は、腫瘍細胞の増殖、生存、および遊走を促進するシグナル伝達事象を誘導し、それによって転移の広がりを増加させます。本研究では、外来性HA上でのがん細胞の接着、遊走、および増殖について検討します。

標準的なフォトリソグラフィーを用いてマイクロパターンエラストマースタンプを作製し、それを用いてガラス基板上にアミノシラン分子のパターン化アレイを作成します。次に、カルボジイミド化学を用いて、マイクロパターン化されたアミノシランにHAを共有結合させます。これによりHAのマイクロパターンが形成されます。培養したがん細胞をこのHAマイクロパターン上に播種することで、外来性ヒアルロン酸とがん細胞との相互作用を、光学顕微鏡や走査電子顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡などの高解像度イメージング技術を用いて視覚化することができます。

本ビデオ記事で紹介するマイクロパターンHA表面の作製方法は、がんの進行における外因性ヒアルロン酸の役割をさらに解明するなど、がん研究分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。まず、ガラススライドにHAをインプリントするために使用する、マイクロパターンポリメチルシルセスキオキサン（PMSE）またはPDMSスタンプを作製します。まず、ピンセットで新しいシリコンウェハーを取り上げます。

次に、ラボのシンクの上で作業します。洗浄ボトルを用いてウェハをエタノールで洗浄し、エアストリームで乾燥させます。室内の照明を消します。

次に、ピンセットを使用してウェハーをスピンコーターに移します。転写ピペットを用いてウェハー表面の少なくとも80%をSU 2025ネガフォトレジストで覆い、600 RPMで10秒間スピンコートします。続いて3000 RPMで30秒間コートし、フォトレジストを塗布したウェハーをホットプレートに移して、95°Cで3分間ソフトベークします。その後、ホットプレートから取り出し、1分間冷却させます。

所望のパターンが形成されたプリフェブリケートマスクをフォトレジスト塗布済みのウェハの上に配置し、20秒間UV照射します。次に、ウェハをホットプレートに移し、110°Cで6分間ハードベイクします。

照明をつけ、ホットプレートからウェハーを取り出します。この時点で、転写ピペットを用いて明確なパターンが確認できるはずです。ウェハーを現像液で3回すすいだ後、SU-8フォトレジスト現像液で慎重に洗浄し、エタノールでリンスします。

白い残留物が残っている場合は、フォトレジスト現像液で洗浄を繰り返すか、単にウェハを現像液に2分間浸し、再びエタノールで洗浄し、水で洗い流した後、大型のウェハボートに入れてエアフローで乾燥させます。ここに示すウェハの場合、PDMSエラストマー溶液と硬化剤を10:1の重量比で混合し、22gあれば十分です。遠心チューブに注ぎ、900 RPMで5分間遠心分離します。

気泡を除去するため、パターン形成済みウェハーを適切なサイズのペトリ皿に入れます。ウェハーが完全に覆われるように、厚さが約1/4インチになるまでPDMS溶液を注ぎます。ウェハーの表面に気泡がある場合は、気泡が消失するまで真空デシケーターに入れます。

室温で一晩硬化させ、相補的なエラストマー stamps を作製します。12時間後にも PDMS が完全に硬化していない場合は、ウェハーを60 °Cのオーブンに30分間入れます。ウェハーから PDMS を慎重に剥がします。

次に、カミソリを使用して、スタンプを希望のサイズに切り出します。スタンプをエタノールとともにガラス製ビーカーに入れ（できればプラスチックホルダーを使用してください）、15分間超音波処理します。ウェハーは繰り返し使用できるため、ガラス表面の規定のパッチにhaを共有結合で固定化するための新しいエラストマースタンプを作成することが可能です。

まず、付属テキストの指示に従い、使用するすべてのスライドをプラズマクリーナーで洗浄します。ガラススライドの洗浄後、ピンセットを使用してプラズマクリーナーから取り出します。スライドをプラスチック製のペトリ皿に入れ、後で使用するまで置いておきます。

次に、HAを結合させるためにガラススライドにスタンプするためのアミノシラン溶液を、15 mLのポリスチレン製遠心チューブで調製します。95% v/v エタノールを用いて、3% v/v の3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）溶液を合計5 mL調製し、室温で5分間反応させます。

この期間に、A-P-T-M-Sは加水分解によりシイノールに変換されます。次に、側面のみを持って、PDMSスタンプをパターン面を上にしてスピンコーターのチャックに配置します。トランスファーピペットを使用して、パターン表面をA-P-T-M-Sで覆います。

次に、スタンプの表面にA-P-T-M-Sを塗布し、3,500 RPMで30秒間スピンコートします。スピンコーターからPDMSスタンプを取り出し、パターン面が下を向くように反転させ、PDMSスタンプの一端をガラススライドの中心に合わせ、スタンプ全体がガラススライドに密着するように1分間軽く押し付けます。続いて、PDMSスタンプをゆっくりと取り除き、A-P-T-M-Sでパターニングされたガラススライドを室温で静置させます。

30分後、パターン表面をエタノールで洗浄し、エアストリームで乾燥させます。過剰なA-P-T-M-Sを除去するために、PDMSスタンプを15分間ソニケーションします。その後、スライドをホットプレートに置き、115 °Cで1時間加熱して表面を加熱し、余分な水分を除去します。

エタノールで洗浄し、ピンセットを用いてエアドライします。パターンを形成したスライドをガラス製ペトリ皿に移します。転送ピペットを使用して、新鮮に調製したポリエチレングリコールまたはPEG-cline溶液でガラススライド全体を完全に覆います。これにより、パターンの周囲に非接着領域が形成されます。

75 °Cで45分間インキュベートした後、過剰なPEG生理食塩水を捨てます。次に、ピンセットでガラススライドを保持しながら、パターン形成済みガラススライドの表面をトルエンで洗浄し、続いて水で洗浄した後、エアストリームで乾燥させます。スライドを湿潤スライドボックスに入れます。

次に、ボックスを生物学的安全キャビネット内に配置し、UVランプを1時間点灯させて殺菌照射を行います。これ以降の操作はすべて生物学的安全キャビネット内で行ってください。フード外での無菌状態を維持するため、10 millimolarの滅菌HA水溶液を1 milliliter調製します。

1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）5 mMおよびN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）50 µg/mLを使用します。滅菌済みのフルオレセイン標識HA用EDCは、HAのカルボキシル基と反応してアミン反応性中間体を形成するゼロレングス架橋剤です。この中間体は加水分解しやすいため、カルボジイミド反応の効率を高めるためにNHSを添加します。

次に、パターン化されたガラスのパターン領域が覆われるまで、滅菌したHA溶液を200 µLずつ分注します。その後、スライドボックスを閉じて、スライドを光から保護します。パターン基板をフード内で16〜24時間静置します。これにより、HA溶液がマイクロパターン化されたA-P-T-M-Sと反応し、HA中間体とA-P-T-M-Sの一次アミンとの間に安定したMI結合が形成されます。

翌日、APAティアピペットを用いてHA溶液を吸引除去します。スライドをPBSで洗浄し、その後、PBSで調製した1% BSA溶液で表面を1時間覆います。これで、表面が細胞培養に適した状態になります。

HAマイクロパターン表面で培養するため、HAマイクロパターン表面を滅菌済みのペトリ皿に配置します。がん細胞の単細胞懸濁液を、ガラス表面18.75 cm²あたり0.4〜1×10⁶個の密度で、1 mLの細胞培地を用いてガラススライドの表面を覆うように播種します。細胞を、37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーターに慎重に配置します。培地が溢れないように注意してください。細胞の接着は24時間以内に起こり、倒立光顕微鏡を用いて観察できます。

細胞培養表面は最大5日間維持することができます。標準的なインキュベーター条件下では、1日おきに培地を交換してください。細胞の形態と増殖は、倒立光顕微鏡を用いて観察することができます。

次に、ここで示した例におけるHA表面への応答を分析するために、さらなる細胞アッセイを適用することができます。蛍光顕微鏡を用いて可視化したHAパターン表面と画像。J 蛍光強度解析は、HAのパターンの脱離を実証しています。

HAマイクロパターン表面を用いることで、外来性HAとがん細胞との相互作用を研究することが可能になります。ここでは、HAマイクロパターン表面におけるがん細胞の接着を示しています。培養24時間後、結腸癌細胞と乳癌細胞の両方が優先的にHAパッチ上に接着しました。走査電子顕微鏡を用いた高解像度イメージングにより、培養細胞とHA固定化表面との相互作用を解析できます。

この走査電子顕微鏡写真では、大腸がん細胞とHAの相互作用が確認でき、右側には高倍率像が示されています。同様に、HA表面で培養された乳がん細胞をここに示し、右側に高倍率像を掲載しています。この解析により、がん細胞のHAマイクロパターン上での広がりを促進する接着性の突起が存在することが明確に示されました。

このビデオを視聴することで、HAマイクロパターンの作製方法と、それを用いてがん細胞の応答を研究する方法について十分に理解することができます。