Name: 繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: 学ぶ 繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激法。カスタムバイオリアクターとマイクロパターン基板を使用し、細胞分化や組織工学への応用を探索する実験プロトコルです。

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0日目 - 実験の日前に滅菌<ol><li>プラスチック浴槽に材料を入れ、2時間、70％アルコールで消毒。 <ul><li>チェンバース</li><li>蓋</li><li>フレーム（全3枚） </li><li>ネジ</li><li>ゴム製のガスケット</li><li>鉗子</li><li>はさみ</li><li>六角レンチ</li></ul></li><li> Aquet石鹸と蒸留水でメンブレンをクリーニング。 </li><li> 10分間70％アルコールで膜を超音波処理してください。 </li><li>プラスチック製の四角い皿にきれいな膜を置きます。パターニングされた膜を使用している場合、パターン化された側は表向き（スプレー溝を下に実行するために液体の膜と時計の片面にアルコール）であることを確認してください。 </li><li> 2時間70％アルコールで覆われた膜を残す。 </li><li>明日の朝オートクレーブ用アルミ箔へのパッケージの手袋。 </li><li>明日のオートクレーブ用蒸留水で2％（重量/体積）ゼラチン溶液（2g/100mL）を作る。 </li><li> 70％アルコールで2時間滅菌した後、一晩UV用フードにすべての高分子材料と膜（非オートクレーブ材）に置きます： <ul><li>チェンバース</li><li>蓋</li><li>フレーム（全3枚） </li><li>メンブレン</li></ul></li><li>オートクレーブ可能な袋に残りの材料をパック。 <ul><li>ネジ</li><li>ゴム製のガスケット</li><li>鉗子</li><li>はさみ</li><li>六角レンチ</li></ul></li></ol> 1日目 - ストレッチチャンバーの組立<ol><li>オートクレーブ鉗子、はさみ、20分、合計で240 ° Fで小さなオートクレーブを使用して六角レンチ、ネジ、ガスケット、手袋、およびゼラチン</li><li> UVからメンブレンを取り出して、約1分間O 2プラズマ（上にパターン側）で扱います。 </li><li> TCのフードでは、ゼラチンとプラズマ処理膜のパターン化された領域をカバー。 UV下分間コート30。 </li><li> PBS 2Xで各メンブレンを洗浄する。第二洗浄した後、チャンバーに簡単に組み立てのために、それらが滑りやすい保つために膜にいくつかのPBSを残す。 （も簡単に組立用ガスケットの潤滑にこのPBSを使用する必要があります）。 </li><li>チャンバー内に膜をアセンブル（組み立て時のオートクレーブ手袋を着用） <ol><li> 1本のネジを使用してフレームの2つの主要部分を接続します。 </li><li>フレームを裏返し、フレームに向かってゼラチンでコーティングされた側面が（パターン化された領域が中心になるはず）ように上に膜を置きます。 </li><li>各側のガスケットを使用してフレームに膜を固定します。 </li><li>そのような膜をリッピングすることはなく、穏やかな、均等に力を使って、でガスケットを押してください。 </li></ol></li><li> T -バーに組み立てフレームを取り付けます。 </li><li>逆さまにチャンバー内にフレームと場所を反転します。 30分間フレームと膜のUV背面側</li><li>再びフレームを反転し、チャンバーにネジ（制御室用の変更なし、しかしストレッチチャンバー用、チャンバーの下部にフレームのエンドピースを接続する2本のネジを使用する必要が、となる1本のネジを削除する必要があります。 ）一緒にフレームの2つの部分を保持する。 30分間UV正面側。膜は、次の手順に進む前に、完全に乾いてから、または他の細胞溶液は種まき時にオフに滑りができることを確認してください。 </li><li>種子の細胞。 3膜の1枚=エリアの面積は、その膜ごとコンフルエントプレートの1 / 3を使用してください。膜セルあたりの溶液1 mLを使用してください。 1.5mlのか以上は解決策を続けることは困難になります。のみパターン化された領域に細胞溶液を入れ、そして周りのソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。チャンバーをカバーし、細胞がフードで30分をRTに接続することができます。 </li><li>インキュベーターにチャンバーを移動し、細胞が1以上の時間のために添付してみましょう。細胞溶液をオフスリップさせることを避けるためにチャンバーを移動するには十分注意してください！解決策は、この時点で落ちる場合、そのチャンバー内の細胞が台無しにされます。 </li><li>フードにチャンバーを戻すと20 mLのメディアを追加。 </li><li>アルミ箔（また、アルコールをスプレー）で覆われてアルコール洗浄浴槽の場所室。インキュベーター（10％CO 2）を延長するためにチャンバーを移動します。 </li><li>ストレッチマシンにチャンバーを固定します。細胞はさらに一晩接続し、次の日にストレッチを始めましょう。 （ 注 ：ストレッチマシンに室を置くとき、チャンバーを配置する前に&quot;ゼロ&quot;の位置にマシンをロックしてから、ギアまわりのラバーバンドを締めるために覚えてマシンを起動する前にギアのロックを解除することを忘れないでください。）。 </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

ベインズら。最初はセル1に機械的な力を提供する柔軟なエラストマー材を使用してin vitroでの細胞の機械的な刺激のためのシステムを使用することを報告した。この時以来、この設計上の多くのバリエーションが考案され、利用されています。いくつかのラボは、特注の装置を使用しながら、いくつかのメカニカルストレッチシステムでは、名前&quot;Flexercell&quot;（Flexcellインターナショナル株式会社）の下で市販されている。このビデオプロトコルでは、我々の研究室でそのようなデバイスのセットアップと使用方法を記載している。 このプロトコルに示されている特注の&quot;ストレッチマシンは、&quot;異なる細胞型2,3の一軸周期的ひずみの影響を調べるために様々な研究で使用されています。このマシンは、機械的な歪みの様々な研究に使用できるいくつかの調整可能なパラメータを持つ多目的な装置である。架空のセットアップは、文化での付着細胞への一軸循環株を提供するためのユニークかつ堅牢な方法を表します。

メディア上の注意：これらの一軸伸張の実験では、バイオリアクターのセットアップの複雑さに起因する汚染が発生しがちです。これに対抗するために、我々は抗生物質と抗真菌剤のさまざまな組み合わせを試してみました。抗生物質の組み合わせと一緒に通常必要な1％のfungizone、。どちらペン/連鎖球菌の組み合わせを使用し、またはカナマイシンおよびゲンタマイシンの組み合わせを（それが耐性変異株の細菌につながる可能性があるので一緒に3つ以上の抗生物質の組み合わせ/カクテルを使用してしようとしないで、そしてまた、細胞に有害かもしれない）を使用して。

繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

生体組織の開発と保守における機械的な力の役割は、骨リモデリング、筋肥大、および平滑筋細胞の可塑性など、いくつかの機械的に安定化の現象を含め、文書化されています。しかし、関与する力がしばしば監視し、生体内で制御することが非常に複雑で困難です。より良い細胞に対する機械的な力の影響を調べるために、私たちは弾性膜上で培養した接着細胞に一軸周期引っ張り歪みを印加するためのin vitro法で開発している。このメソッドは、所望の力を適用するには電動カムローターシステムによるカスタム設計のバイオリアクターを利用しています。ここでは、歪みの方向に向い細胞へのマイクロパターン形状を持つシリコン膜を、この場合は、を含む、各&quot;ストレッチチャンバー&quot;のさまざまなコンポーネントを、組み立てる方法を示すステップバイステップのビデオのプロトコルを提示する。我々はまた、チャンバを滅菌メンブレン上に細胞を播種、バイオリアクターにチャンバーをラッチし、機械的なパラメータ（つまり、大きさとひずみの速度）を調整するための手順について説明します。この特定のプロトコルで説明した手順は、歪みの方向に対して平行に配向さ10μm幅のチャネルをシリコン膜上にヒト間葉系幹細胞を播種するための固有のものです。しかし、このシステムで提示方法および材料は、このテーマのバリエーションの数を収容するのに十分な柔軟性があります：ひずみ速度、大きさ、持続時間、細胞の種類、膜の地形、膜のコーティングなどはすべて、目的のアプリケーションに合わせることができますか成果。これは、in vitroで細胞に適用される一軸引張ひずみの影響を調査するための堅牢な方法です。

それは広く体内に機械的な力が細胞の分化と増殖に影響を与えることができることが理解される。ここでは、柔軟なマイクロパターン基板上に培養した細胞を食い止めるために一軸周期引っ張り歪みを配信するための特注のバイオリアクターの使用方法を示すビデオプロトコルを提示する。

生物学的組織の発達および維持における機械的な力の役割は、機械的に調節されるいくつかの...を含め、十分に実証されている。

こんにちは、Song Liです。カリフォルニア大学バークレー校のバイオエンジニアリング学科の准教授を務めています。そして、Kyle Kapinskyです。同じくカリフォルニア大学バークレー校のバイオエンジニアリング学科の博士候補生です。本日、周期的な単軸ひずみを用いた幹細胞の機械的刺激プロトコルについて紹介します。当研究室では、細胞および組織工学、特に心血管系に焦点を当てた研究を行っています。いくつかの潜在的な応用例があるため、私たちは幹細胞のメカノバイオロジーに関心を持っています。第一に、機械的要因が、例えば胚発生などの発達に及ぼす影響を理解したいと考えています。第二に、in vitroまたは生体内で幹細胞分化を制御することに関心があります。そして第三に、移植後など、生体内で幹細胞が心血管系の機械的要因にどのように反応するかに関心があります。これらすべてを調査するために、私たちはカスタム設計のバイオリアクターを使用しています。この装置では、弾性膜上に細胞を播種し、定義された時間、歪み、および歪み速度で膜を軸方向に伸展させることができます。それでは、このプロトコルをセットアップするために必要なすべてのプロセスを順に説明します。まず、研究室用石鹸（任意の洗剤で構いません）を使用して、膜の両面に石鹸をつけ、十分に洗浄してください。これにより、膜上の破片などの不純物を取り除きます。細胞に干渉する可能性のあるものはすべて除去してください。これを手作業で行います。その後、両面が十分に洗浄されたと感じたら、もう一度水で洗い流します。そこから、完全に滅菌し、微細な粒子をすべて取り除きたいと考えます。このメンブレンを取り出し、70% alcoholを入れたビーカーに入れます。完全に浸かるようにしてください。その後、ビーカーごとソニケーターに入れ、10分間超音波処理を行います。マイクロパターン膜をスクエアディッシュにセットしましたので、パターンのある面が正しく上を向いているか確認します。アルコールを入れたスプレーボトルで、膜の表面にスプレーします。液体が流れ落ち、溝が見えることが確認できます。これで、パターン面が上を向いており、正しい方向にあることが確認できました。一晩のUV照射工程が完了し、すべてのチャンバー、チャンバー用のフレーム、およびメンブレン自体がフード内にあり、一晩中UV照射されていた状態です。これが最終的な滅菌工程となります。次に、すべてのメンブレンにプラズマ処理を行います。メンブレンを1、2枚ずつ取り出し、滅菌ディッシュに入れたままプラズマ処理装置まで運びます。真空圧が解除されたので、チャンバーを取り出すことができます。なお、ここは完全に滅菌された状態ではありませんが、後で再度滅菌処理を行います。血漿が保持されるよう比較的迅速に作業し、ピンセットを使用してくだ

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Research

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Biology

生物学

軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。...

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

この原稿は、単方向ストレッチを使用して接着細胞または組織に力を適用したり、解放する手法を提示します。...

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。...

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。...

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

ここで心臓の生理学をエミュレートする電気的・機械的刺激を用いたセル人口をトレーニングするためのプロトコルを提案する.この電気刺激は扱われた細胞の cardiomyogenic...

細胞の Cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激

三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。...

腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用

本稿では、レンチウイルスベクターを用いた強膜の過剰発現と2Dバイオリアクター による...

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

ここでは、細胞に対して等方的および一軸のひずみ波形を適用しつつ、基質上で培養を支持し、剛性を調整可能かつタンパク質行列をカスタマイズ可能な新しい装置として紹介します。このシンプルで経済的なプラットフォームにより、研究者は基礎研究から疾患関連の文脈において、機械的な手がかりがどのように細胞機能を調節するかを調査できます。...

in vitro 細胞の伸縮および画像診断のための新しいプラットフォーム

このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。...

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

学ぶ 繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激法。カスタムバイオリアクターとマイクロパターン基板を使用し、細胞分化や組織工学への応用を探索する実験プロトコルです。

繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

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