繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

こんにちは、Song Liです。カリフォルニア大学バークレー校のバイオエンジニアリング学科の准教授を務めています。そして、Kyle Kapinskyです。同じくカリフォルニア大学バークレー校のバイオエンジニアリング学科の博士候補生です。

本日、周期的な単軸ひずみを用いた幹細胞の機械的刺激プロトコルについて紹介します。当研究室では、細胞および組織工学、特に心血管系に焦点を当てた研究を行っています。いくつかの潜在的な応用例があるため、私たちは幹細胞のメカノバイオロジーに関心を持っています。

第一に、機械的要因が、例えば胚発生などの発達に及ぼす影響を理解したいと考えています。第二に、in vitroまたは生体内で幹細胞分化を制御することに関心があります。そして第三に、移植後など、生体内で幹細胞が心血管系の機械的要因にどのように反応するかに関心があります。

これらすべてを調査するために、私たちはカスタム設計のバイオリアクターを使用しています。この装置では、弾性膜上に細胞を播種し、定義された時間、歪み、および歪み速度で膜を軸方向に伸展させることができます。それでは、このプロトコルをセットアップするために必要なすべてのプロセスを順に説明します。まず、研究室用石鹸（任意の洗剤で構いません）を使用して、膜の両面に石鹸をつけ、十分に洗浄してください。これにより、膜上の破片などの不純物を取り除きます。細胞に干渉する可能性のあるものはすべて除去してください。

これを手作業で行います。その後、両面が十分に洗浄されたと感じたら、もう一度水で洗い流します。そこから、完全に滅菌し、微細な粒子をすべて取り除きたいと考えます。

このメンブレンを取り出し、70% alcoholを入れたビーカーに入れます。完全に浸かるようにしてください。その後、ビーカーごとソニケーターに入れ、10分間超音波処理を行います。

マイクロパターン膜をスクエアディッシュにセットしましたので、パターンのある面が正しく上を向いているか確認します。アルコールを入れたスプレーボトルで、膜の表面にスプレーします。液体が流れ落ち、溝が見えることが確認できます。

これで、パターン面が上を向いており、正しい方向にあることが確認できました。一晩のUV照射工程が完了し、すべてのチャンバー、チャンバー用のフレーム、およびメンブレン自体がフード内にあり、一晩中UV照射されていた状態です。これが最終的な滅菌工程となります。

次に、すべてのメンブレンにプラズマ処理を行います。メンブレンを1、2枚ずつ取り出し、滅菌ディッシュに入れたままプラズマ処理装置まで運びます。真空圧が解除されたので、チャンバーを取り出すことができます。なお、ここは完全に滅菌された状態ではありませんが、後で再度滅菌処理を行います。

血漿が保持されるよう比較的迅速に作業し、ピンセットを使用してください。ここでも非常に重要な点として、メンブレンを落としたり、向きを変えたりしないように十分注意してください。

現在、上面のみがプラズマ処理された状態ですので、プラズマ処理面を上に向けたまま、比較的滅菌状態にあるディッシュに戻し、蓋をしてからフードまで運搬します。メンブレンのプラズマ処理が完了しましたので、これをフードに戻し、2% gelatin（重量対容量パーセント）で処理します。

溶液がパターンに沿って流れていることがわかります。また、プラズマ処理を施しているため、非常に親水性となっています。そのため、溶液は盛り上がるのではなく広がります。もし誤ってメンブレンを裏返してしまった場合は、溶液が盛り上がるため、違う面を使用していることがわかります。

溶液が均一に広がるようにしてください。すべてのメンブレンに対してこの操作を行った後、フードを閉じてUV照射を30分間行います。これで、表面にゼラチンを塗布した状態でメンブレンを30分間UV照射したことになり、ゼラチンが表面に吸収されるのに十分な時間が経過します。

ここで、メンブレンを滅菌PBSで2回洗浄します。通常は、スクエアディッシュに約10 mLのPBSを入れ、手で軽く揺らして洗浄します。その際、メンブレンの表面に触れないように注意し、その後PBSを吸引して除きます。これをもう一度行い、2回目の洗浄後、メンブレンをPBSに浸したままにします。これによりメンブレンが潤滑され、チャンバーへの組み込みが容易になります。メンブレンが乾燥していると、破れたり破損したりする可能性が高くなります。

これが2回目の洗浄です。ここでもう一度吸引し、メンブレンからゼラチンが完全に取り除かれていることを確認します。その後、メンブレンを約10 millilitersの滅菌PBSに浸したままにします。

複数のメンブレンを使用している場合は、各メンブレンに対してこのプロセスを繰り返します。その後、組み立ての準備が整います。フレームを1つ用意します。これは実際には2つのパーツで構成されていますが、通常はあらかじめ組み立てられています。

1つのパーツがこちらのT字型ピースで、もう1つのパーツは膜自体を固定するためのフレームの一部です。フレームには、このような形状の2つ目のパーツがあります。ここにある溝がご確認いただけます。

ここにガスケットを挿入し、メンブレンを固定します。2つ目の部品には、もう一方のガスケット用の2つ目の溝があり、これによりメンブレンの両側を保持できるようになります。この部品を取り、このようにフレームに配置して、フレームを裏返し、オートクレーブ用ネジの1本を手に取ります。

上部にネジを挿入します。まず手で軽く締め、その後、六角レンチのいずれかを使用して完全に締め付けてください。これでフレームが組み立てられました。メンブレンは、私の手をメンブレンに見立てて、このように下面に取り付けます。つまり、パターン形成済み、またはプラズマ処理およびゼラチン処理が施された面をこちらに向けます。

その面を上にしたいと考えています。誤ってひっくり返してゼラチン側が下になると、実験に大きな支障をきたします。そのため、組み立てる際はパターン側をこのように上にしたいのですが、実際には逆さまに組み立てます。

したがって、メンブレンを取り出す際は、パターン面を下向きにすることを確認してください。1枚のメンブレンを取り出しますが、現時点ではパターン面が上を向いていることを覚えておいてください。これをPBSから取り出し、このようにフレームにまたがるように配置します。

これで、両側がほぼ均等になりました。メンブレンの端に指が触れても構いませんが、反対側には触れないようにしてください。このように裏返したことで、パターン面が下を向いた状態になり、アセンブリが容易になります。2枚のガスケットを取り、PBSの中に入れてください。

通常、私はこれを前後に転がします。ガスケット全体を濡らすことで、PBSでメンブレンを潤滑させたときと同様に、ガスケットを潤滑させます。乾燥したメンブレンに乾燥したガスケットを使用すると、位置がずれる可能性が非常に高くなります。

まず、片側をもう一方よりも少し長めに引き出します。ガスケットを挿入すると、こちら側に挿入した場合にメンブレンがこの方向に引っ張られ、反対側が少し短くなるためです。したがって、こちら側を短めの状態で始めます。ガスケットを1枚取り、両側がほぼ均等になるように配置します。

均等な圧力をかけながら、親指または親指の先で押し下げます。ただし、この時点で爪を使用しないでください。膜を誤って切り裂いてしまう可能性が高いためです。挿入後、私は実際には鉗子の背面を使用して押し下げています。ここでも、強く押しすぎたり、滑って膜に触れたりしないよう注意してください。この段階で誤って膜を切ったり破いたりすると、新しい膜を用意して最初からやり直さなければならなくなるためです。

これで片側が挿入されましたが、もう一方はまだ緩い状態です。そのため、反対側にひっくり返し、もう一つのガスケットを準備し、同様に濡らして上に配置します。その後、通常はピンセットでメンブレンを掴んで少し伸ばします。緩すぎるとメンブレンに弛みができ、細胞の観察が不可能になるためです。

したがって、ピンと張っている必要がありますが、伸びてしまうほど強く張りすぎてはいけません。あらかじめ伸びていると、膜自体にすでに張力がかかっているため、ガスケットを押し下げて固定する際にさらに張力が加わり、膜を破いてしまう可能性があり、実験に影響を及ぼします。現時点では、十分にピンと張っているように見えます。

片側が少し緩んでいるかもしれませんが、すぐに修正します。そして、再び均等に圧力をかけながら、親指の先や指先で押し込んでください。この時点で、片側が十分に張っているのがわかります。

反対側までずっと直線になっています。ちょうどそこにメンブレンにわずかな緩みがあり、少し丸まっています。そこで、前と同様に、この側をゆっくりと均等にガスケット全体にわたって押し込みます。

これでほとんどのたるみが取れたことがわかります。フレームの背面とメンブレンの30分間のUV照射が完了したので、次にすべてのメンブレンを裏返し、表面にもUV照射を行い、完全に滅菌します。また、この時点で、特定のチャンバーをストレッチ群またはコントロール群として指定します。

ご覧の通り、チャンバーにはすでに「control stretch」「control stretch」とラベルを貼っています。ストレッチチャンバーにはネジが1本追加で必要となるため、ストレッチチャンバー用の予備ネジを蓋の裏側のこの位置に配置しました。

フレームを取り出し、裏返します。ストレッチチャンバーを使用する場合は、ネジを数本交換する必要があります。コントロールチャンバーを使用する場合は、すべてそのままにします。

このバーが前後に動くとき、膜自体は引き伸ばされず、単にバーと共に移動します。膜を引き伸ばしたい場合は、フレームのもう一方の端をチャンバーの底に固定して静止させる必要があります。そうすることで、フレームのこの部分だけがバーと共に前後に動くようになります。

そのため、予備のネジを取り、フレームのこの部分にあるネジ穴に差し込みます。六角レンチを使用してネジを締め付けます。ポリスチレン製のチャンバーは少々壊れやすいため、締めすぎないように注意してください。チャンバーにひびが入らないよう、フレームのその部分が動かない程度の強さで締めてください。

最初のネジを固定したら、フレームの2つのパーツを繋いでいたこのネジを外します。このとき、ネジをメンブレン上に落とさないよう注意してください。メンブレン上に播種したゼラチンの状態を損ねる可能性があります。ネジが十分に緩んだら、六角レンチを取り出し、ピンセットでネジを掴んで2番目のネジ穴に入れます。その後、再び六角レンチを使用して2番目のネジを締め付けます。

フレームのその部品を2本のネジで固定すれば、ストレッチ用のチャンバーが準備できたことになります。ストレッチマシンによってこのバーが前後に動くと、膜自体が実際に伸展するのがわかります。膜に問題がないことを確認するため、この操作を数回繰り返すのが好ましいです。

何らかの理由でひびが入っており、膜が破れた場合、実験開始前にそれに気づくことができるため、別の膜と交換することが可能です。そのため、これを脇に避け、次のものを用意します。今回はコントロールチャンバーとしてラベル付けされています。コントロールチャンバーについては、単に裏返すだけで準備が完了します。

これを装置にセットすると、伸展することなく前後に移動します。あとは、チャンバーとメンブレンの数だけこの工程を繰り返します。それぞれをストレッチャーで制御した後、フードを閉め、メンブレンの上面を30分間UV照射します。

すべてのチャンバー、フレームの上部、およびメンブレンのUV照射を30分間完了しました。これですべてが滅菌され、組み立てが完了したため、細胞を播種する準備が整いました。今回は、10 cmディッシュから間葉系幹細胞を回収して播種します。

したがって、各メンブレンについて、特に今回のようにパターン化されたメンブレンを使用する場合は、パターンがある正方形の領域に播種します。私はこのパターン化された領域のみに播種したいと考えています。パターン化されていないメンブレンを使用する場合でも、液体がエッジに近づきすぎないよう、ほぼ同じ領域に播種してください。

液が端に近すぎると、液が溢れ出し、細胞を十分に播種させる前に死滅してしまう可能性があります。播種する領域には、適切な数の細胞を配置してください。実験を行う際は、その領域が十分にコンフルエントになるようにします。

したがって、10 cmディッシュを使用する場合、その領域の約3分の1がコンフルエントになるようにします。今回の間葉系幹細胞の場合、それは約250,000個の細胞に相当します。この数値は、使用する細胞の種類によって異なります。

細胞をプレートから回収し、適切な量で再懸濁しました。各メンブレンに細胞懸濁液を1 mLずつ分注します。今回のケースでは、溶液1 mLあたり約250,000個の間葉系幹細胞が含まれています。

P 1000を使用します。溶液の状態を確認するため、数回ピペッティングを行い、ピペットに 1 mL を取り込みます。パターニングされた領域にのみ播種するようにするため、ゆっくりと、小さな液滴を形成するようにしてその領域に播種します。

これはパターンであるため、実際には溝を感知してこの方向に小さな楕円形を描いていることがわかります。したがって、完全な円ではなく、この場合はより楕円に近い形状になっています。

その後、この領域全体を確認しますが、まだ端に近づきすぎないようにします。遠くまで行き過ぎて、ピペット内の溶液をすべて出し切ってしまうのを避けるためです。次に、ピペットを使用して、溶液を端の近くまで広げますが、端を越えないように注意しながら行います。

未通過領域に細胞が残らないようにしたいのですが、自分に最も近いエッジ部分は処理しにくいことがあります。そのため、通常は慎重に回転させながら、最後のエッジまで処理します。これで、細胞がかなり均一に分散されるはずです。

これで、細胞はすべて定着しました。細胞をこぼさないように注意してください。手の上の空間を通り過ぎたり、素早く動かしたりしないようにしてください。

そして、これを元の位置に戻します。ここを覆い、細胞を上に播種したいので、この蓋を使用して覆います。この蓋には、実際には2つの異なる穴が開いています。

こちら側には深い穴があり、反対側にはガスを導入するための浅い穴があります。深い方の穴がこちらのT字部分と一致するようにしてください。浅い方の穴を使用すると、きつくなりすぎます。

このように配置することで、チャンバー全体を覆うことができます。残りのすべてのチャンバーでもこの操作を繰り返し、細胞が底面に沈降し、メンブレンに付着し始めるまで、フード内で30分間静置します。その後、すべてのチャンバーをテープで密封し、さらに1時間静置してメンブレンに完全に定着させるため、フードからインキュベーターへと移動させます。

細胞をメンブレン上で30分間静置させました。次に、インキュベーター内で37°C、5%CO2の条件下に細胞をさらします。そのため、クリーンベンチからインキュベーターへ移動させる必要があります。

この操作を行う際は、チャンバーをあらゆる方向に傾けないよう細心の注意を払ってください。そうしないと、細胞懸濁液が流れ出てしまい、基本的には最初からやり直すことになります。細胞をチャンバーに入れた状態でインキュベーター内で1時間経過すると、細胞は表面にしっかりと接着します。

ここで、チャンバーをインキュベーターから取り出し、先ほどと同様に非常に慎重にフードの中に戻します。これは、メンブレン上の培地をこぼさないようにするためです。次に、ストレッチチャンバーに20 mLの培地を加えます。

そして今回、この手法はわずかにコンタミネーションが起こりやすいため、汚染を確実に防ぐために特別に組み合わせた培地を使用します。使用するのは、DMに10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、さらに真菌類を防ぐために1% の Fungizone を加えたものです。20 mL の培地をとり、これをストレッチチャンバーに慎重に加えます。

培地がメンブレン自体から脱落せず、チャンバーの末端に加えられていることがわかります。そのため、培地はまずメンブレンの下に入り、その後メンブレンの上へと流れます。細胞を完全に乱さないよう、ゆっくりと行ってください。その後、再び蓋をして、しっかりと固定します。

この段階では、細胞を乱したり、膜から剥がれたりすることを心配する必要はもうありません。そのため、少し慎重さを緩めて扱うことができます。適切な量の菌株を選出してください。

この装置の仕組みは、回転ホイールにアームが取り付けられており、ホイールの中心に挿入する既製の部品によってアームの長さを変更できるというものです。ホイールが回転すると、このアームが前後に動き、それに連動してプラットフォームが前後します。そして、チャンバーがそのプラットフォームに取り付けられています。

その結果、それらも同様に前後に動くことになります。例えば5%の歪みを与えたい場合は、「5」と記載された既製のパーツを使用します。このパーツは、アームが正しい位置に移動するようにあらかじめ計算された特定の長さになっています。これをホイールの中心に挿入してアームを取り付け、しっかりと固定されていることを確認した後、六角レンチで締め付けて最終的な固定を行います。

すべてを所定の位置にセットし、ゼロ点に合わせ、完全に固定しました。これでチャンバーを装着する準備が整いました。こちらが先ほど運んできたチャンバーです。

細胞を上に載せた状態で、慎重に1つの位置に配置し、バーが所定の位置にロックされていることを確認してください。ゼロポジションにロックされるよう、この方向に押し込まれていることを確認する必要があります。最後まで押し込みすぎないでください。膜にプリトレーニング（予備的な負荷）がかかる可能性があります。

次に、このファスナーで固定し、動かないようにします。その後、スイッチを入れます。開始時にわずかに跳ねるのがわかるはずです。

時々そのようなことが起こり、途中で止まることがありますが、その後は通常、かなりスムーズに動き始めます。そして、すべてのバーが前後に動き、秒間60サイクルになります。したがって、こちらには600と表示されます。

実際には60.0にする必要があります。また、必要に応じて周波数を変更することも可能です。システム内で細胞に機械的ストレスを加えた後、通常は約2～5日間行いますが、目的により期間を短くしたり長くしたりすることもできます。

工程が完了し、定義されたエンドポイントに達したら、チャンバーを取り出し、メンブレン上の細胞を用いてさまざまな解析を行うことができます。通常、私たちはマイクロアレイや2次元ゲル電気泳動を含む多様な手法を用います。また、PCRによる遺伝子発現の解析や、ウェスタンブロッティングによるタンパク質発現の解析も行います。

単に細胞を溶解するだけでなく、メンブレン上で直接染色を行い、特定のタンパク質の免疫蛍光などを観察することも可能です。また、メンブレンから細胞を回収して染色し、フローサイトメーターで解析することもできます。このように、実施可能な操作や解析対象は多岐にわたります。さらに、異なる種類のマイクロパターンメンブレンや異なる材質、異なるコーティングを使用したい場合など、装置にさまざまなバリエーションを加えて modifications（修正・変更）を加えることも当然可能です。