腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス体外で

この手順の全体的な目標は、in vitro で腫瘍微小環境を再現し、化学療法薬の試験に使用できるマイクロ流体デバイスの製造と操作を実証することです。これがマイクロ流体デバイスです。この装置は、以下の分野で有用であり、in vitroでの化学療法薬の簡単な試験が可能です。

三次元腫瘍組織を検査するための一貫した正確な結果を提供し、このデバイスは生体内腫瘍の非常に正確な表現を提供します。微小環境 腫瘍は3D微小環境に存在し、1D微小環境でテストする能力は重要です。手順の最初のステップは、ソフトリソグラフィーを使用してマイクロ流体チップを製造し、入口と出口に穴を開け、スライドガラスに接着し、フロー入口と出口のチューブを接続することを含むデバイスを組み立てることです。

次に、均一な多細胞腫瘍ステロイドを生成して、吊り下げ法を使用してデバイスで使用できます。次に、スフェロイドをデバイスに導入され、続いてアポトーシス、検出剤、化学療法薬が導入されます。最後に、タイムラプス顕微鏡検査が行われ、続いて薬物拡散係数の数学的推定が行われ、化学療法剤の浸透能力が定量化されます。

最終的には、デバイスにおける組織増殖、組織内の不均一な微小環境の形成、およびタイムラプス蛍光顕微鏡の使用による組織への薬物拡散を示す結果を得ることができます。固形腫瘍への抗がん剤の浸透が限定的であることが、その失敗の重要な原因です。現在のほとんどの抗がん剤検査モデルは、固形腫瘍の3次元的な性質を模倣していません。

私たちは、連続的に灌流された3次元腫瘍組織からなるマイクロ流体デバイスを開発しました。このモデルは、固形腫瘍への薬物の送達とその全身クリアランスをより正確に表しています。多細胞腫瘍ステロイドは、三次元腫瘍組織の確立されたモデルです。

この手順では、吊り下げ法を使用して、マイクロ流体デバイスで使用するステロイドを作成します。この方法により、短期間で一貫したステロイドを形成することができます。化学療法薬をin vitroで三次元組織で試験すると、細胞の単層と比較して、より効率的に薬物をスクリーニングするのに役立ちます。

PDMSとシリコンエラストマーからの硬化剤を9対1の重量比で混合します。次に、この混合物をマスターに注ぎ、厚さ4ミリメートルのグレアデガを形成します。気泡を取り除くには、摂氏60度で5時間硬化させます。

硬化したPDMSを金型から剥がし、エラストマー上に流動フィーチャーのスタンプを取得します。次に、ドリルに取り付けられた1ミリメートル半の生検パンチを使用して、入口と出口のパンチ穴を押します。破片を引き出します。

スタンプの特徴面ときれいなスライドガラスを酸素プラズマに8分間さらします。酸素プラズマエッチング装置では、処理された表面をすぐに接触させて、それらの間に結合を形成します。アセンブリをスライドウォーマーで摂氏60度に少なくとも5時間維持します。

ボンディングを強化するには、内径0.032インチのPTFEチューブをマイクロ流体デバイスの入口と出口に接続します。とげのあるメスのルアーロックコネクタに取り付けられたオスのルアーロックコネクタのインターフェースを使用して、これらの特定のコネクタは、壊れることなく簡単に通過できるように使用されています。最後に、シャットオフバルブとYコネクタを使用してフローアセンブリをセットアップし、デバイスを顕微鏡に取り付けます デバイスを取り付けた後、チューブを適切な入口と出口に接続してフローセットアップを完了します。

この図に示すように、この構成により、スフェロイドをデバイスに詰めたり、装置内に媒体の流れを作って詰めたりすることが容易で汎用性があります。パッキングインレットバルブVPNとパッキンアウトレットバルブVPを開き、腫瘍をアウトします。その後、OIDは入口を通過して培養チャンバーに流れ込み、このチャンバー内のポストが腫瘍を所定の位置に保持して培地を流します。

パッキンバルブを閉じ、フローインレットバルブVFインとフローアウトレットバルブVFアウトを開いて、均一なPHEの形成を開始します。ハンギングドロップ法を使用して、培養フードの下にトリプシン氷細胞を。得られたトリプシン細胞を遠心分離機から取り出します。

表1を参照して、原液を希望の濃度に希釈します。次に、48ウェルプレートのカバーを取り外し、逆さまに置きます。滅菌したフードに、プレートの各ウェルに1ミリリットルの滅菌水を入れます。

湿度を保つために、カバーの各円形領域に20マイクロリットルの希薄細胞溶液の液滴を置きます。マイクロピペットを使用して、カバーを慎重に裏返してプレートの上に置き、水滴がウェルの端に触れないようにします。プレートを摂氏37度でインキュベートします。

使用される特定の細胞に基づくインキュベーションの期間については表1を参照してください、ステロイドは各吊り下げ液滴で形成されます。まず、フローインレットから70%エタノールでデバイスを洗い流して滅菌します。続いて、PBSをそれぞれフラッシュし、次にH-E-P-E-S緩衝細胞培養培地を洗浄します。

中型シリンジを離れ、チューブに取り付けます。次に、2〜3個のステロイドをシリンジタップシリンジに引き込みます。気泡を取り除くには、シリンジをデバイスのパッキン入口に取り付けます。

インレットバルブVPNを開き、VFNオープンアウトレットバルブVPアウトを閉じ、VFアウトを閉じます。針を下に向けてパッキンシリンジを垂直に持ちます。.ステロイドが注射器の底に沈殿し、針のルアーロックコネクターに入るのを見てください。

パッキンシリンジのプランジャーを押し、パッキン出口バルブのみが開いているため、PHEがチューブに入り、デバイスに流れ込むのを確認します。ステロイドはデバイスのチャンバーに入り、背面の支柱によって保持されます。チャンバー内に入ると、S回転楕円体はチャンバーの形状に適合し、長方形の形状を獲得します。

インレットバルブVPNを閉じ、アウトレットバルブVPは、フローシリンジSFをシリンジポンプに取り付けます。このポンプは、シリンジポンププロオープンインレットバルブVFNとアウトレットバルブVFアウトを使用してコンピューターによって実行されます。毎分3マイクロリットルでデバイスへの媒体の流れを開始します。

スフェロイドを24時間インキュベーションした後、アポトーシス検出剤を導入します。アポトーシス、検出、または治療薬を導入する前に、スフェロイドを最大24時間平衡させて、栄養勾配と微小環境を確立してください。次に、バルブVFNを停止します。

シリンジポンプを停止します。ポンプからシリンジを取り外し、0.25マイクロリットル/ミルのCASPグローレッドアクティブカスパーゼ3マーカーを含むシリンジと交換します。0.7ミリリットルのデバイスをデバイスを介して手動で洗い流すことにより、デバイスを溶液で洗浄します。

次に、シリンジをポンプに取り付けます。フローを再開し、バルブVFNを開きます。5〜8時間の期間にわたって、カスクグローブの赤いアクティブcphフェーズ3は組織に拡散し、アポトーシス領域でより明るく蛍光を発しますこの濃度でのアポトーシス検出剤は、その後のすべてのフローソリューションで維持されます。

ドキソルビシンは、アポトーシス検出剤の導入後5〜8時間で導入されます。この処理は、フラッシングによってシステムから取り除かれます。化学療法剤を追加するには、アポトーシス検出の手順に従って、10マイクロモルの塩酸ドキソルビシンを導入します。

次に、治療用シリンジを0.7ミリリットルの培地のシリンジと交換します。治療薬の流れを一定時間継続します。次に、バルブVFNを止め、シリンジポンプをオフにします。

シリンジポンプから治療シリンジを取り外し、0.7ミリリットルの媒体とシリンジと交換します。.新鮮な培地を24〜36時間流しながら、顕微鏡下で組織を継続的に監視します。タイムラプス顕微鏡法の全取得プロセスは、IPラボのカスタマイズされたスクリプトを使用して自動化され、PAX Foidの透過光と蛍光画像を30分ごとに10倍倍で取得します 薬物拡散係数の数学的推定のために、最初のステップは、画像J.Selectを使用してドク蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。 またはチャンバー内の組織を包含するROI。

plot profile コマンドを使用して、流路からの距離の関数として平均強度のプロファイルを生成します。最大 3 つの異なる時点について繰り返します。次に、得られた強度プロファイルから平均バックグラウンド蛍光強度を差し引き、対応する最大強度を用いて各プロファイルを正規化して、XおよびTの関数としてCを得る

次のステップは、腫瘍組織ドキュメント内のドキュメントの有効拡散係数を評価することです。拡散は、ERFCが相補誤差関数である次の式で表すことができます。Xはチャネルから組織への距離であり、Tはドキソルビシンの導入後の時間です。

考慮する各時点で、次の反復スキームを使用します。各位置でのD.Calculateの方程式の右辺の値を推測します。X.2つの辺間の二乗誤差の合計を計算し、Dを変更して残差平均を最小化します。

各時点で得られたDの最適値により、組織中のドキソルビシンの平均有効拡散係数を推定します。マイクロ流体デバイスは、3次元腫瘍組織の増殖のために、1ミリメートル×0.3ミリメートル×0.15ミリメートルの光学的にアクセス可能な培養室を提供しました。吊り下げ法により、いくつかの細胞株から一貫したサイズと形状の腫瘍PHEを迅速に形成することができました。

PHEは、デバイス上で最大3日間正常に成長しました。チャンバー内の成長は、微小環境の再現可能な変更と関連していました。phe内では、アポトーシスは流路に近接した細胞で発生しにくく、組織の上位と深部で発生しました。

このデバイスを使用して、ドキソルビシンと腫瘍組織の拡散係数を推定しました。実験的に保持された値は、この手順を試みている間、以前にヒト乳がんで報告された値と一致しました。PHEを装置に流す際には、細胞培養の外部で行う必要があるため、無菌性の維持に特に注意することが重要です。

フードスプレーシリンジとチューブの端には、無菌性を確保するためにエタノールをたっぷりと含ませます。このビデオを見た後、腫瘍への薬物の限られた浸透の役割を理解する必要があります。私たちは、3次元腫瘍組織への薬物の送達と全身クリアランスを模倣し、その浸透を定量化する技術を実証しました。

浸透性の低い薬剤を排除することで、がん治療薬の開発プロセスを大幅に効率化することができます。