Name: 腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス体外で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスの作製と操作方法。ソフトリソグラフィー技術を用いて腫瘍微小環境を体外で再現し、抗がん剤の拡散評価や細胞死の定量化を行う。がん研究と創薬開発に有用です。

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この作品は、厚生助成金総合研究所＃1R01CA120825-01A1、マサチューセッツ大学アマースト校での共同医学研究（CBR）のプログラム、BhushanをJ. Toley用アイゼン奨学金によってサポートされていました。私たちは感謝してジェームズ·シェーファー、ビデオ撮影、ナレーター、そしてこのビデオの編集者の貴重な貢献を承諾します。

1。デバイス製造エラストマー材料のマイクロ流体の特徴のレプリケーションがダフィーらの方法に基づいていた。1 <ol><li>ミックスエラストマー（ポリジメチルシロキサン、PDMS）および9:1の重量比でシリコーンエラストマーキット（ ダウコーニング 、ミッドランド、ミシガン州）から硬化剤と4ミリメートル厚い層を形成するために、マスターの上に注ぐ。ドガは、5時間60℃で気泡を除去し、混合物を硬化させた。ピールエラストマー上の流れの特徴のスタンプを取得するための金型からPDMSを硬化させた。 </li><li> 1.5ミリメートル生検パンチ（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を用いて、入口と出口のためのパンチ穴はドリルプレスに搭載された。ごみを取り出し。 </li><li>スタンプの機能側と酸素プラズマエッチャーで8分間酸素プラズマにきれいなガラススライドを施す。それらの間の結合を形成するためにすぐに接触して処理された表面を持参してください。少なくとも5時間ウォーマースライド上60°Cでアセンブリを維持の結合を強化するために、S。 </li><li>有刺鉄線メスルアーロックコネクタ（Qosina、エッジウッド、ニューヨーク州）に取り付けられたオスルアーロックのインターフェースコネクタを使用して入口と出口に0.032 "ID PTFEチューブ（ コールパーマー 、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州）を接続します。 </li><li>シャットオフバルブとYコネクタ（;図1 アップチャーチ·サイエンティフィック 、オークハーバー、ワシントン州）を用いて、フロー· ​​アセンブリーを設定します。顕微鏡へのデバイスをマウントします。 20G 1.5 "針（BDバイオサイエンス 、ロックビル、MD）を用いて、チューブに注射器を取り付けます。 </li></ol> 2。制服スフェロイドの形成スフェロイドはハンギングドロップ法2,3によって形成された。 <ol><li>無菌細胞培養フードの下で細胞をトリプシン処理。 </li><li> 5分間2000rpmでトリプシン処理した細胞を遠心し、6 mlの新鮮な培地中に再懸濁します。所望の最終濃度（表1）に原液を希釈します。 </li><li> 48ウェルプレートのカバーを取り外して、ステレオに逆さに置きrilizedフード。各ウェルに対応する円形領域は、表紙に明らかである。湿度を維持するために、滅菌水1mlでプレートの各ウェルを埋める。マイクロピペットを用いて、各円形領域における希薄な細胞溶液の20μl滴を入れてください。慎重にカバーを反転させ、滴が井戸の縁に手を触れないことを確実に、ウェルプレート上に置きます。 </li><li>指定した日数（表1）37℃でウェルプレートをインキュベートする。回転楕円体は、各ハンギングドロップで形成されます。 </li></ol> 3。デバイスにスフェロイドの導入このセクションの1、表、図2を参照してください。 <ol><li>流入口を介して導入を70％エタノールで洗浄して、デバイスを滅菌する。その後、PBSで洗浄し、細胞培養培地をHEPES緩衝続く。チューブに接続されている培地シリンジS Fのままにしておきます。 </li><li>注射器S Pに2から3スフェロイドを描き、気泡を除去するために注射器をタップし、装置のパッキングインレットに接続します。 </li><li>オープンインレットバルブV ピンと近いVのフィン 。オープン出口弁V Poutと近いV Fout を 。下向きの針で垂直パッキングシリンジを保持;スフェロイドが針のルアーロックコネクターにシリンジの底に沈むように見守る。パッキングシリンジにプランジャーを押し込み、スフェロイドがデバイスにチューブとフローを入力見守る。唯一のパッキング出口弁が開いているため、回転楕円体は、装置のチャンバーに入り、戻って（図2）で投稿することによって保持される。 </li><li>インレットバルブV ピンと出口弁V Pout を閉じます。シリンジポンプのシリンジS Fをマウントします 。オープンバルブV フィンとバルブV Foutを 。 3μL/ minでデバイスに流れ媒体。 </li></ol> 4。アポトーシス検出剤の紹介（CaspGLOW） スフェロイドとチャンバーを梱包した後に、uの平衡を許可検出アポトーシスまたは治療剤を導入する前に、栄養勾配および微小環境を確立するために、24時間に電話。チャンバ内の組織が上部と下部から入り込めない壁に接触しているので、組織の厚さに沿った栄養勾配（0.15ミリメートル）がありません。 24時間のインキュベーション後、組織の厚さに沿ってすべての細胞層は、したがって等価であり、唯一の異質性が離れて流路からの方向である。 <ol><li> Vのフィンをシャットオフし 、シリンジポンプを停止し、ポンプから注射器S Fを削除して、0.25μL/ CaspGLOW赤活性型カスパーゼ3マーカー（赤-DEVD-FMKのアンピシリンを含む培地を有するシリンジと交換し、 バイオビジョン 、マウンテンビュー、カリフォルニア州）。 </li><li>手動で古い媒体の変位を確実にするためにデバイスを介して、この溶液0.7mlのをフラッシュします。 、ポンプのシリンジをマウントする流れを再起動して、開いているVのフィン 。 5-8時間の期間にわたって、アポトーシスは、tに薬剤が拡散を検出彼は組織およびアポトーシスの地域で明るい蛍光を発する。この濃度でアポトーシスを検出したエージェントは、デバイスへのすべての後続フローソリューションで維持されます。 </li></ol>注意： <ol class="lroman"><li>組織の不均一性は、第6章で説明したように蛍光の直線強度プロファイルを取得することによって確認することができます。プロファイルには、組織は、細胞生存率に関して不均質であることが確認され、アポトーシスに空間的な勾配を示すべきである。 </li><li> CaspGLOWグリーン活性型カスパーゼ3マーカー（フルオレセイン-DEVD-FMK、バイオビジョン）もアポトーシスを検出するために用いることができる。このマーカーは、代わりに赤の蛍光色素ローダミンの緑色蛍光色素フルオレセインを含んでいます。 </li></ol> 5。治療薬の導入<ol><li>アポトーシス検出剤を含む、10μMのドキソルビシン塩酸塩（Sigma-Aldrich社、 セントルイス 、ミズーリ州のDox）を導入するための手順4.1から4.2の手順に従ってください。 </li><li> therapeの流れを継続する一定期間utic剤溶液。バルブV フィンを切り、シリンジポンプをオフにします。エージェントを検出し、アポトーシスを含む新鮮な培地の注射器を用いた治療用の注射器を交換してください。連続して顕微鏡下で組織を監視しながら、24 -36時間のための新鮮な媒体の流れを許可します。 </li></ol> 6。薬物拡散係数のタイムラプス顕微鏡と推定きれいな蛍光データを得るためには、組織の下層に顕微鏡の焦点を合わせることによって、すべての画像を取得する。垂直方向には栄養素勾配が（セクション4を見てください）​​が存在しないため、セルの底層は、上記のすべての他の層の良好な代表である。 <ol><li>全体の取得処理はIPLabでカスタマイズされたスクリプト（BD Bioscience社 、ロックビル、MD）を用いて、自動化されました。 10倍の倍率で満員スフェロイド30分毎（図3A）の透過光と蛍光画像を取得する。 Acquir前Doxの導入にバックグラウンド蛍光の電子画像。チャンバーの大サイズ（1000ミクロン×300ミクロン）に対処するために、隣接する二つの画像と一緒にタイル4を獲得。 </li><li>薬物の拡散係数の数学的な推定のために、最初のステップは、ImageJを使ってDoxの蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。チャンバー内の組織を包含する関心の矩形領域（ROI）を選択します。流路からの距離の関数としての平均的な強度のプロファイルを生成するためにプロットprofileコマンドを使用します。最大3つの異なる時点のに対して、この手順を繰り返します。 </li><li>組織からの自家蛍光を測定するためにDoxを導入する前に、バックグラウンド蛍光画像を得る。得られた強度プロファイルから平均バックグラウンド蛍光強度を減算し、取得するために対応する最大強度で各プロファイルを正常化する<img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="C言語"> （x、t）は （図3B）。 </li><li>次のステップでは、腫瘍組織内Doxの有効拡散係数Dを評価することである。 Doxの拡散は、以下の式（5）で表すことができる。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）"> ERFCは相補誤差関数であり、xはチャネルから組織への距離、tは Doxの導入（図3を参照）の後の時間です。と考え、各時点で、次の反復スキームを使用します。 <ul><li> Dの値を推測</li><li>各場所xでの式の右辺を計算する</li><li>両国間の二乗誤差（残差）の合計を計算する</li><li>残差を最小化するためにDを変更する</li></ul></li><li>平均組織中のDoxの平均実効拡散係数を推定するために、各時点で得られたDの最適値。 </li></ol> 7。代表的な結果： &lt;Pクラス= "jove_content"&gt;マイクロ流体デバイスは、3次元の腫瘍組織の成長のために1ミリメートル×0.3 X 0.15ミリメートル光学的にアクセス可能な培養チャンバーを提供した。多細胞の腫瘍スフェロイドはこれらの室に流入していた、背面に2フィルタの投稿によって保持された。ハンギングドロップ法は、いくつかの細胞株からの一貫した大きさと形状のスフェロイドの迅速な形成を可能にした。最大3日間までスフェロイドが正常にデバイス上で増殖させた。チャンバ内の成長はスフェロイド内微小環境の再現性の修正と関連していた。アポトーシスは、流路の近傍の細胞が少なく、より高い組織に深く発生しました。デバイスは、腫瘍組織におけるドキソルビシンの拡散係数を推定するために使用されていました。 8.75×10 -7 cm 2 sで-1の得られた値は9.1の値と一致×10 -7 cm 2 sで-1はヒト乳癌に以前に6を報告した 。 <table border="1"><tbody><tr><td> 細胞株 </td><td> 必要な細胞濃度 </td><td> インキュベーション時間 </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300細胞/μL </td><td> 2-3日</td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750細胞/μL </td><td> 3-4日</td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150細胞/μL </td><td> 5-6日</td></tr></tbody></table> 表1。ドロップスフェロイドを吊るすためのパラメータ<table border="1"><tbody><tr><td> 一部 </td><td> 説明 </td></tr><tr><td> S F </td><td>フローシリンジ</td></tr><tr><td> S P </td><td>シリンジの包装</td></tr><tr><td> Vのフィン </td><td>フローインレットバルブ</td></tr><tr><td> V ピン </td><td>インレットバルブのパッキング</td></tr><tr><td> V Foutを </td><td>流れ出口バルブ</td></tr><tr><td> Vのふくれっ面 </td><td>出口バルブのパッキング</td></tr></tbody></table> 表2。フロー設定にシリンジとバルブ<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1のフローセットアップV フィンとV Foutの回路図：フロー入口と出口弁、V ピンとV ふくれっ面 ：パッキング入口と出口弁、S FとS、P：フローおよびパッキングシリンジ。回転楕円体をチャンバ内に流入したときの梱包や包装シリンジ入口と出口弁が使用されています。フローシリンジと流入口及び出口弁は、その後培地を流すために使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。デバイス上室に閉じ込められた回転楕円体の模式図。スフェロイドがデバイス上のチャンバ内に流入され、2つのフィルターposによってブロックされている室の奥のTS。 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。デバイス上の腫瘍組織内ドキソルビシン拡散。 A.は、ドキソルビシンの位置や濃度を（赤）を示す、組織の透過光および赤色蛍光画像を合併。スケールバーは250μmを表しています。ドキソルビシン蛍光からBに正規化された線形強度プロファイルは。

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
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<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
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<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

腫瘍内の血管系は、スパース行列で、病気7,8を開発しました 。血管系9にもかかわらず供給栄養素や薬にアクセスできない血管から遠い位置にある領域（&gt;100μm）にあります。得られた不均一微小環境は、多くの化学療法剤10の限られた有効性に貢献しています。ここで開発したマイクロ流体デバイスは、in vitroで、静止し、アポトーシスまたはネクローシス細胞を増殖によって特徴付けられる異種腫瘍微小環境を再現しています。チャネルの近接性の細胞は生存可能であるが、拡散限界をはるかチャンネルから栄養欠乏地域アポトーシスを引き起こす。流路には血管を表し、回転楕円体は、血管に隣接する腫瘍内の小さな領域を表します。 デバイスにスフェロイドを紹介しながら、任意の障害物が組織の流れにあるため、パンチ入口孔を清潔にし、破片がないことを保証すること室を埋めるために失敗した、または壊れた回​​転楕円体になります。パッキングシリンジがスフェロイドを導入する過程​​で手動で操作される。流量は、チャンバーの背面に支柱を通してス...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名称</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>エルズワースの接着剤</td><td> 184シルELASTキット</td><td></td></tr><tr><td> Miltex生検パンチ</td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1.5ミリメートル</td></tr><tr><td> PTFEチューブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06417から31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td>オス型ルアーロックコネクタ</td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td>とげの雌型ルアーロックコネクタ</td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td>遮断弁</td><td> IDEX健康科学</td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Yコネクタ</td><td> IDEX健康科学</td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;針</td><td> BD Bioscienc電子</td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOWフルオレセイン</td><td>バイオビジョン</td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW赤</td><td>バイオビジョン</td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸ドキソルビシン</td><td>シグマ</td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td>ヒト結腸癌細胞株</td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td>人間の乳管癌細胞株</td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td>ヒト乳腺腺癌細胞株</td></tr></tbody></table>

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

我々は、in vitroでの異種3次元腫瘍組織への薬物の送達及び全身クリアランスを模倣したマイクロ流体デバイスを開発しました。血管系で配信栄養素は、実行可能な静止および壊死細胞の種類により構成される異種微小環境を生み出して、腫瘍のすべての部分に到達しない。多くの抗がん剤は効果的に細胞のため、この異質のすべてのタイプを貫通し、治療に失敗する。がん細胞の単層は、それが困難なin vitroモデルを適当に抗がん剤をテストすること、この異質性を模倣することはできません。当社のマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィーを用いたPDMSから製造された。ハンギングドロップ法により形成された多細胞腫瘍スフェロイドは、挿入され、拘束装置の長方形のチャンバーに、片面に連続媒体の血流を維持した。デバイス上室の矩形形状は、組織内で線形グラデーションを作成しました。蛍光汚れは目を定量化するために使用された組織内のアポトーシスにおけるe変動。デバイス上の腫瘍が蛍光化学療法薬ドキソルビシンで処理した、タイムラプス顕微鏡組織への拡散を監視するために使用され、有効拡散係数を推定した。ハンギングドロップ法は、いくつかの癌細胞株からの均一なスフェロイドの迅速な形成を可能にした。デバイスは、最大3日間までスフェロイドの成長を可能にしました。媒体を流すの近傍の細胞がアポトーシスを起こしていた最低限、それらの遠い路からそれによって正確に血管に隣接する腫瘍内の領域を模倣し、より多くのアポトーシスであった。ドキソルビシンの拡散係数の推定値は、ヒト乳癌における以前に報告された値と一致していた。固形腫瘍における薬剤の浸透および保持は、その有効性に影響を与えるため、我々は、このデバイスは薬剤の挙動を理解し、新たながん治療薬を開発する上で重要なツールであると信じています。

私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介<em&gt; in vitroで</em&gt;。腫瘍組織内アポトーシスの変動を評価した蛍光染色し、腫瘍組織への化学療法薬ドキソルビシンの有効拡散係数を用いて定量した。

我々は、...における不均一な三次元腫瘍組織への薬物送達および全身クリアランスを模倣するマイクロ流体デバイスを開発しました。

本手順の目的は、in vitroで腫瘍微小環境を再現し、化学療法剤の試験に使用可能なマイクロ流体デバイスの作製と動作を実証することです。こちらがそのマイクロ流体デバイスです。このデバイスは、in vitroでの化学療法剤の簡便な試験などの分野で有用です。本装置は、3次元腫瘍組織の試験において一貫性と精度の高い結果を提供し、生体内腫瘍を非常に正確に再現します。腫瘍は3次元微小環境に存在するため、そのような環境で試験を行える能力は極めて重要です。手順の最初のステップは装置の組み立てであり、これにはソフトリソグラフィを用いたマイクロ流体チップの作製、入口と出口への穴あけ、ガラススライドへの接合、および流体入口と出口のためのチューブの接続が含まれます。次に、ハンギングドロップ法を用いて、デバイスで使用するための均一な多細胞腫瘍スフェロイドを作製します。その後、スフェロイドをデバイスに導入し、続いてアポトーシス検出剤および化学療法剤を添加します。最後に、タイムラプス顕微鏡観察を行い、化学療法剤の浸透能を定量化するために薬剤拡散係数の数学的推定を行います。最終的に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いることで、デバイス内での組織成長、組織内における不均一な微小環境の形成、および組織への薬剤拡散を示す結果を得ることができます。固形がんへの抗がん剤の浸透が制限されることは、治療失敗の重要な原因となっています。現在の多くの抗がん剤試験モデルは、固形がんの三次元的な性質を模倣できていません。我々は、持続的に灌流される三次元腫瘍組織で構成されるマイクロ流体デバイスを開発しました。このモデルは、固形腫瘍への薬剤送達および全身性のクリアランスをより正確に再現します。多細胞腫瘍スフェロイドは、三次元腫瘍組織の確立されたモデルです。本手順では、マイクロ流体デバイスで使用するスフェロイドを作製するために、ハンギングドロップ法を用います。この方法により、短期間で均一なスフェロイドを形成させることが可能です。3次元組織を用いて化学療法剤をin vitroで試験することは、細胞単層での試験と比較して、より効率的な薬剤スクリーニングに寄与します。シリコンエラストマーのPDMSと硬化剤を重量比9:1で混合します。次に、この混合液をマスターの上に注ぎ、厚さ4 mmの層を形成して脱気します。気泡を除去するため、60 °Cで5時間硬化させます。硬化したPDMSをモールドから剥がし、エラストマー上に流路構造を持つスタンプを作成します。次に、ドリルに取り付けた1.5 mmの生検パンチを使用し、入口と出口となるパンチ穴を開けます。破片などはすべて取り除いてください。スタンプの機能面と洗浄済みのガラススライドを、酸素プラズマに8分間さらします。酸素プラズマエッチャー内で、処理した表面同士を直ちに接触させ、接合させます。このアセンブリをスライドウォーマーを用いて60 °Cで少なくとも5時間保持します。接合部を強化するため、内径0.032 inchesのPTFEチューブをマイクロ流体デバイスの入口および出口に接続します。オス用ルアーロックコネクタをバーブ付きメス用ルアーロックコネクタに取り付けたインターフェースを使用することで、破損させることなく容易にチューブを通すことができます。最後に、遮断弁とY字コネクタを用いて流路アセンブリを構築し、デバイスを顕微鏡に設置します。デバイスの設置後、適切な入口および出口にチューブを接続し、流路セットアップを完了させます。この図に示すように、この構成により、スフェロイドをデバイスにパッキングする際の簡便性と汎用性が確保されるか、あるいはデバイス内に培地の流れを作ることでパッキングを行うことができます。パッキング入口バルブVPNとパッキング出口バルブVP outを開きます。これにより、腫瘍スフェロイドが入口を通過して培養チャンバーへと流れ込み、チャンバー内のポストが培地を流す際に腫瘍を所定の位置に固定します。パッキングバルブを閉じ、流入バルブ VF in と流出バルブ VF out を開いて、均一な PHE の形成を開始します。クリーンベンチ内で、吊り滴法を用いてトリプシン処理した細胞を氷上で処理します。遠心分離機から得られたトリプシン処理細胞を回収します。表1を参照し、ストック溶液を目的の濃度まで希釈します。次に、48ウェルプレートの蓋を取り外し、逆さまに置きます。滅菌フード内で、プレートの各ウェルに滅菌水 1 mL を満たします。湿度を維持するため、カバー上の各円形領域に希釈細胞溶液を20 µLずつ滴下します。マイクロピペットを使用して、カバーを慎重に反転させてプレートの上に配置し、液滴がウェルの端に触れないようにしてください。その後、プレートを37 °Cでインキュベートします。使用する特定の細胞に基づいたインキュベーション時間は、表1を参照してください。各ハンギングドロップ内でステロイドが形成されます。まず、フロー入口から70% ethanolを流し、デバイスを滅菌します。続いて、PBS、次いでHEPES緩衝細胞培養培地をそれぞれ流してください。培地シリンジを準備し、チューブに取り付けます。次に、2～3回分量のステロイドをシリンジに吸い込みます。気泡を除去するため、シリンジをデバイスのパッキング入口に取り付けます。入口バルブVPNを開き、出口バルブVP outおよびVF outを閉じます。パッキング用シリンジを、針が下を向くように垂直に保持します。ステロイドがシリンジの底、針のルアーロックコネクタ部分に沈殿するまで待ちます。パッキング用シリンジのプランジャーを押し、PHEがチューブに入りデバイスへと流れるのを確認します。このとき、パッキング出口バルブのみが開いています。ステロイドがデバイスのチャンバーに入り、後方のポストによって保持されます。チャンバー内部に入ると、Sスフェロイドはチャンバーの形状に適合し、長方形の形状になります。入口バルブVPNと出口バルブVP outを閉じ、シリンジポンプにフローシリンジSFを装着します。このポンプは、Syringe Pump Proを用いてコンピュータで制御します。入口バルブVFNと出口バルブVF outを開きます。3 µL/minの速度でデバイスへの培地の注入を開始します。スフェロイドを24時間インキュベートした後、アポトーシス検出剤を導入します。アポトーシス検出剤または治療剤を導入する前に、栄養勾配と微小環境を形成させるため、スフェロイドを最大24時間静置して平衡状態にします。その後、バルブVFNを閉じます。シリンジポンプを停止します。ポンプからシリンジを取り外し、0.25 µL/mLのCASPglow Red active Caspase 3マーカーを含む培地を入れたシリンジに交換します。この溶液0.7 mLを手動でデバイスに流し込み、デバイスを洗浄します。その後、シリンジをポンプに取り付けます。フローを再開し、バルブVFNを開きます。5〜8時間かけて、cask glove red active cph phase threeが組織に拡散し、アポトーシス領域でより強く蛍光を発します。以降のすべてのフロー溶液において、この濃度のapoptosis detecting agentを維持します。アポトーシス検出剤を導入した後、5〜8時間後にドキソルビシンを導入します。この処理後は、フラッシングによってシステム内から除去します。化学療法剤を添加するには、アポトーシス検出の手順に従い、10 µMの塩酸ドキソルビシンを導入してください。次に、処置用シリンジを0.7 millilitersの培地が入ったシリンジに交換します。治療薬の注入を一定時間継続します。その後、バルブVFNを閉じてシリンジポンプの電源を切ります。シリンジポンプから処置用のシリンジを取り外し、0.7 milliliters の培地が入ったシリンジに交換します。顕微鏡下で組織を継続的に観察しながら、新鮮な培地を 24 から 36 時間流し続けます。タイムラプス顕微鏡による全取得プロセスは、IP lab のカスタムスクリプトを用いて自動化し、PAX Foid の透過光および蛍光画像を 10 x 倍率で 30 分ごとに取得しました。薬物拡散係数の数学的推定における最初のステップは、Image J を用いて薬物の蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。チャンバー内の組織を包含する長方形の関心領域（ROI）を選択します。plot profileコマンドを使用して、流路からの距離の関数として平均強度のプロファイルを作成します。これを最大3つの異なるタイムポイントで繰り返します。次に、得られた強度プロファイルから平均背景蛍光強度を差し引き、それぞれのプロファイルを対応する最大強度で正規化して、XおよびTの関数としてのCを求めます。ここでCはドキソルビシンの正規化濃度であり、Cの値は0から1の間で変動します。次のステップは、腫瘍組織内におけるdoxorubicinの有効拡散係数を評価することです。拡散は、ERFCを相補誤差関数とする次の方程式で表すことができます。Xはチャネルから組織内部への距離を、Tはdoxorubicin導入後の時間を表します。検討する各タイムポイントにおいて、以下の反復スキームを使用します。Dの値を推定し、各位置における方程式の右辺を算出します。X。両辺の残差平方和を算出し、平均残差を最小化するようにDを修正します。組織内におけるドキシルビシンの平均有効拡散係数を推定するため、各時点で得られたDの最適値を示します。マイクロ流体デバイスは、3次元腫瘍組織を育成するための、1 mm × 0.3 mm × 0.15 mmの光学的にアクセス可能な培養チャンバーを備えていました。ハンギングドロップ法を用いることで、複数の細胞株からサイズと形状が均一な腫瘍PHEを迅速に形成することが可能となりました。PHEをデバイス上で最大3日間正常に培養することができました。チャンバー内での成長は、微小環境の再現性のある改変に関連していました。PHE内では、流路に近い細胞よりも、組織のより高い位置および深部にある細胞においてアポトーシスが多く発生しました。この装置を用いて、ドキシルルビシンおよび腫瘍組織の拡散係数を推定しました。実験的に得られた値は、ヒト乳がんに関して以前に報告された値と一致しました。この手順を行う際は、PHEを装置に流す操作を細胞培養の外で行う必要があるため、無菌状態の維持に細心の注意を払うことが重要です。滅菌状態を確保するため、フード内のスプレーシリンジとチューブの末端にエタノールを十分に噴霧します。このビデオを視聴することで、腫瘍への薬剤浸透の制限が果たす役割について理解を深めることができます。本ビデオでは、3次元腫瘍組織における薬剤の送達と全身クリアランスを模倣し、その浸透度を定量化する手法を実演しました。浸透性の低い薬物を排除することで、がん治療薬の開発プロセスを大幅に効率化できるでしょう。

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