腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス体外で

この手順の目的は、体外（in vitro）で腫瘍微小環境を再現し、化学療法剤の試験に使用可能なマイクロ流体デバイスの作製および動作を実証することです。これがそのマイクロ流体デバイスです。このデバイスは、化学療法剤の簡便なin vitro試験などの分野で有用です。

本デバイスは、三次元腫瘍組織の試験において一貫性と精度の高い結果を提供し、生体内の腫瘍を非常に正確に再現することが可能です。腫瘍は三次元的な微小環境内に存在するため、そのような環境下で試験を行える能力は極めて重要です。本手順の最初のステップはデバイスの組み立てであり、これにはソフトリソグラフィーを用いたマイクロ流体チップの作製、入口および出口への穴あけ、ガラススライドへの接合、および流体入口・出口用チューブの接続が含まれます。

次に、吊り滴法（hanging drop method）を用いて、デバイスで使用するための均一な多細胞腫瘍スフェロイドを作製します。その後、スフェロイドをデバイス内に導入し、続いてアポトーシス検出剤と化学療法剤を添加します。最後に、タイムラプス顕微鏡観察を行い、化学療法剤の浸透能を定量化するために薬剤拡散係数の数学的推定を行います。

最終的に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いることで、デバイス内での組織成長、組織内における不均一な微小環境の形成、および組織への薬剤拡散を示す結果を得ることができます。固形がんへの抗がん剤の浸透が制限されることは、治療失敗の重要な原因となっています。現在の抗がん剤試験モデルの多くは、固形がんの三次元的な性質を再現できていません。

我々は、連続灌流される三次元腫瘍組織で構成されるマイクロ流体デバイスを開発しました。このモデルは、固形腫瘍への薬剤送達およびその全身クリアランスをより正確に再現します。多細胞腫瘍スフェロイドは、三次元腫瘍組織の確立されたモデルです。

本手順では、マイクロ流体デバイスで使用するためのスフェロイドを作製するために、ハンギングドロップ法を用います。この手法により、短期間で均一なスフェロイドを形成させることができます。3次元組織を用いて化学療法剤をin vitroで試験することは、細胞の単層培養と比較して、より効率的な薬剤スクリーニングを可能にします。

シリコンエラストマーのPDMSと硬化剤を9:1の重量比で混合します。次に、この混合液をマスターの上に注ぎ、厚さ4 mmの層を形成して脱気します。気泡を取り除くため、60 °Cで5時間硬化させます。

硬化したPDMSをモールドから剥がし、エラストマー上に流路構造を持つスタンプを作製します。次に、ドリルに取り付けた1.5 mmのバイオプシーパンチを用いて、入口と出口となるパンチ穴を開けます。破片などのゴミを取り除いてください。

スタンプの機能面と清潔なガラススライドを、酸素プラズマで8分間処理します。酸素プラズマエッチャー内で、処理した表面を直ちに接触させ、両者の間に結合を形成させます。このアセンブリをスライドウォーマーを用いて60°Cで、少なくとも5時間維持します。

接合を強化するため、内径 0.032 inches の PTFE チュービングをマイクロ流体デバイスの入口および出口に接続します。オス・ルアーロックコネクタとバーブ付きメス・ルアーロックコネクタを組み合わせたインターフェースを使用することで、破損させることなく容易に挿入することが可能になります。最後に、遮断バルブと Y コネクタを用いてフローアセンブリを構築し、デバイスを顕微鏡に固定します。デバイスの固定後、適切な入口および出口にチューブを接続し、フローセットアップを完了させます。

この図に示すように、この構成により、スフェロイドをデバイス内に容易かつ汎用的にパッキングすること、またはデバイス内に培地の流れを作ってパッキングすることが可能です。パッキング入口バルブVPNとパッキング出口バルブVP outを開きます。その後、腫瘍スフェロイドを入口から通過させ、培養チャンバー内に流し込みます。チャンバー内のポストが腫瘍を固定し、培地を流します。

パッキングバルブを閉じ、流入バルブVF inおよび流出バルブVF outを開いて、均一なPHEの形成を開始します。クリーンベンチ内で、吊り滴法を用いてトリプシン氷細胞を作製します。遠心分離機から得られたトリプシン細胞を取り出します。

表1を参照し、ストック溶液を希望の濃度に希釈します。次に、48ウェルプレートのカバーを取り外し、プレートを逆さまに置きます。滅菌フード内で、プレートの各ウェルに1 mLの滅菌水を満たします。

湿度を維持するため、カバーの各円形領域に希釈した細胞溶液を 20 µL ずつ滴下します。マイクロピペットを用いて、カバーを慎重に反転させてプレートの上に置き、液滴がウェルの端に触れないようにしてください。プレートを 37 °C でインキュベートします。

使用する特定の細胞に基づいたインキュベーション時間は表1を参照してください。各ハンギングドロップ内でステロイドが形成されます。まず、フロー入口から70% ethanolを流してデバイスを滅菌します。続いて、PBS、次にH-E-P-E-S緩衝細胞培養培地をそれぞれ流してください。

培地シリンジを準備し、チューブに接続します。次に、2〜3回のステロイドをシリンジに吸い込みます。気泡を除去するため、シリンジを装置のパッキング入口に取り付けます。

入口バルブVPNを開き、出口バルブVP outとVF outを閉じます。パッキング用シリンジを、針が下を向くように垂直に保持します。ステロイドがシリンジの底にある針のルアーロックコネクタに沈降するまで待ちます。

パッキング用シリンジのプランジャーを押し、PHEがチューブに入りデバイス内へ流れるのを確認します。この際、パッキング用流出口バルブのみが開いている必要があります。ステロイドがデバイスのチャンバーに入り、後方のポストによって保持されます。チャンバー内部に入ると、Sスフェロイドはチャンバーの形状に適合し、矩形の幾何学的形状となります。

入口バルブVPNと出口バルブVP outを閉じ、フローシリンジSFをシリンジポンプに取り付けます。このポンプは、Syringe Pump Proを使用してコンピュータで制御します。入口バルブVFNと出口バルブVF outを開きます。3 µL/minの速度で、デバイスへ培地を流し始めます。

スフェロイドを24時間インキュベーションした後、アポトーシス検出剤を導入します。アポトーシス検出剤または治療剤を導入する前に、栄養勾配と微小環境を確立させるため、最大24時間スフェロイドを平衡化させてください。その後、バルブVFNを閉じます。

シリンジポンプを停止します。ポンプからシリンジを取り外し、0.25 µL/mLのCASP glow red活性化Caspase 3マーカーを含む培地を入れたシリンジに交換します。0.7 mLの溶液を手動でデバイスに流し、デバイス内を洗浄します。

次に、シリンジをポンプに取り付けます。フローを再開し、バルブVFNを開きます。5〜8時間かけて、cask glove red active cph phase threeが組織内に拡散し、アポトーシス領域でより強く蛍光を発します。これ以降のすべてのフロー溶液において、この濃度のapoptosis detecting agentを維持します。

アポトーシス検出剤の導入から5〜8時間後に、ドキソルビシンを導入します。この処理後は、フラッシングによって系内から除去します。化学療法剤を添加するには、アポトーシス検出の手順に従い、10 µMの塩酸ドキソルビシンを導入してください。

次に、治療用シリンジを0.7 mLの培地が入ったシリンジに交換します。治療剤の流動を一定時間継続させます。その後、バルブVFNを閉じ、シリンジポンプの電源を切ります。

治療用シリンジをシリンジポンプから取り外し、0.7 millilitersの培地が入ったシリンジと交換します。顕微鏡下で組織を継続的に観察しながら、新鮮な培地を24から36時間流します。タイムラプス顕微鏡によるすべての画像取得プロセスは、IP labのカスタマイズされたスクリプトを用いて自動化されました。PAX Foidの透過光画像および蛍光画像を、10 xの倍率で30分ごとに取得します。薬物拡散係数を数学的に推定するための最初のステップは、Image Jを用いてdocsの蛍光の平均線形強度プロファイルを生成することです。チャンバー内の組織を囲む矩形の関心領域（ROI）を選択します。

plot profileコマンドを使用して、流路からの距離の関数として平均強度のプロファイルを生成します。最大3つの異なる時点についてこれを繰り返します。次に、得られた強度プロファイルから平均背景蛍光強度を減算し、各プロファイルを対応する最大強度で正規化して、XおよびTの関数としてCを求めます。ここでCはドキソルビシンの正規化濃度であり、Cの値は0から1の間で変化します。

次のステップは、腫瘍組織内におけるドクソルビシンの有効拡散係数を評価することです。拡散は以下の式で表すことができ、ここでERFCは相補誤差関数を指します。Xはチャネルから組織内部への距離であり、Tはドクソルビシン導入後の時間です。

検討する各時間点において、以下の反復スキームを用います。Dの値を推定します。各位置Xにおける方程式の右辺を計算します。両辺の二乗誤差の和を算出し、残差平均を最小にするようにDを修正します。

組織内におけるドキソルビシンの平均有効拡散係数を推定するために、各時点において得られたDの最適値。マイクロ流体デバイスは、三次元腫瘍組織を育成するための、1 mm × 0.3 mm × 0.15 mmの光学的にアクセス可能な培養チャンバーを提供した。ハンギングドロップ法により、複数の細胞株から一定のサイズと形状を持つ腫瘍PHEを迅速に形成することができた。

PHEはデバイス上で最大3日間、正常に培養されました。チャンバー内での増殖は、微小環境の再現可能な修飾を伴っていました。PHEにおいて、アポトーシスはフローチャネルに近い細胞では少なく、組織のより高く深い部位でより多く発生しました。

このデバイスを用いて、ドキソルビシンの拡散係数および腫瘍組織の拡散係数を推定しました。実験で得られた値は、ヒト乳がんに関して以前に報告された値と一致しました。この手順を行う際は、細胞培養外で操作を行う必要があるため、PHEをデバイスに流す際に無菌状態を維持することに細心の注意を払うことが重要です。

滅菌を確実にするため、フード内のスプレー用シリンジとチューブの端をエタノールで十分に的に噴霧します。このビデオを視聴することで、腫瘍への薬剤浸透が制限される役割について理解を深めることができます。本ビデオでは、3次元腫瘍組織における薬剤の送達と全身クリアランスを模倣し、その浸透度を定量化する手法を実演しました。

浸透性の低い薬剤を排除することで、抗がん剤の開発プロセスを大幅に効率化できます。