Name: サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶサポニン透過性心臓繊維の調製法と高分解能呼吸計測による酸化的リン酸化評価。マウス心臓組織を用いてミトコンドリア機能を正確に測定し、心臓バイオエネルギクス研究に応用可能です。

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この研究は、ヘルスリサーチおよびゲノムカナダのカナダの協会によってサポートされていました。 JSは、医学研究、ハートとカナダのストローク財団とカナダ糖尿病協会のためのアルバータヘリテージ財団からの給与支援賞を保持しています。研究室では、サポニン、透過性繊維の技術の取得中にOroborosインスツルメンツの技術支援に感謝したい。

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

サポニン透過性心臓繊維の技術は、in vitroおよびミトコンドリアOXPHOSの酸素消費量の in vivo評価の間のユニークな妥協を提供しています。この手法の利点は、細胞構造が維持されるとして単離ミトコンドリアに比べて増加した生理学的関連性などがあります。原形質膜が劣化している間、ミトコンドリア12を含む細胞内膜構造、14、筋小胞体14は 、フィラメントと細胞骨格1、17はそのまま残ります。また、ミトコンドリアと細胞骨格1、17との間の相互作用も不変です。透過処理繊維のミトコンドリアが増加した安定性を示す。げっ歯類の繊維製剤は、最大24時間18,2のための安定性を示す6Hと人間の繊維試料を氷冷preservationsソリューションに保存することができます。インキュベーション溶液とミトコンドリア経験急速な平衡。これは、追加基質、阻害剤とuncouplers 1、5に対応して電子輸送チェーンのサイト固有の分析を直接制御できます。さ...

<table><tbody><tr><td>100%エタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'&amp;#8242;ADP二カリウム塩二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>必須脂肪酸含有ウシ血清アルブミン&amp;#8211;無料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシンA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&amp;#8242;アデノシン三リン酸二ナトリウム塩水和物 (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>アトラクチロサイド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>カルボニルシアニド p-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>シトクロムc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス-(2-アミノ&amp;#8211;(チレター)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;エチレングリコール-テトラ酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>ケタセット</td></tr><tr><td>ラクトビオン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl₂·6H₂O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6時間&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩 (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>シアン化カリウム</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>濃度 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>ロンプン</td></tr><tr><td>二重蒸留水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15mlポリプロピレン製遠心チューブ</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50mlポリプロピレン製遠心チューブ</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>ストレート・ジュエラーズ鉗子</td><td>ジョージ・ティーマン &amp;社</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>曲型ジュエラーピンセット</td><td>ジョージ・ティーマン &amp;および会社</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>直剪外科手術鋏</td><td>ジョージ・ティーマン &amp;社</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み手術用メス刃</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;シリンジフィルター</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製シャーレ</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルポリスチレン組織培養プレート</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>プレートスターラー</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand マイクロバー</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>電子天秤</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;Hamilton マイクロシリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;ハミルトンマイクロシリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;Hamilton マイクロシリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 洗浄ボトル</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン製計量皿</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

ミトコンドリアはエネルギー代謝、酸化ストレス、アポトーシス、老化、ミトコンドリアencephalomyopathiesおよび薬物毒性に関与しているとして、ミトコンドリアの機能の調査は、心臓生理学の重要なパラメータを表します。これを考えると、心臓のミトコンドリアの機能を測定する技術が求められています。ミトコンドリアの機能を測定するための統合的アプローチを採用して一つの技術は呼吸計測の酸化的リン酸化（OXPHOS）分析です。 呼吸計測OXPHOSアセスメントの原則は、クラーク電極を利用して酸素濃度を測定することを中心としています。透過処理繊維束は、酸素、密閉チャンバーの低下で酸素濃度を消費するように。選択された基質阻害剤 - 脱共役剤の滴定のプロトコルを使用して、電子は、ミトコンドリアの機能の評価を可能にする、電子伝達鎖の特定部位に用意されています。ミトコンドリアの機能の呼吸計測分析に先立ち、機械的および化学的準備のテクニックは、筋線維の筋鞘を透過するために利用されています。化学物質の透過性は、細胞構造を維持しながら選択的に細胞膜に穴をサポニン採用しています。 本論文では、徹底的にミトコンドリアOXPHOSを評価するために酸素消費量測定用のサポニン肌の心臓の繊維を準備するために必要な手順を説明します。また、アドバイスだけでなく、特定の基質のトラブルシューティングを、電子輸送チェーンの特定の部位でミトコンドリアの機能を決定するために使用されることがあります阻害剤とuncouplersが提供されています。重要なのは、記述されているプロトコルは、簡単に様々な動物モデルおよびヒト試料の心臓および骨格組織に適用されることがあります。

呼吸計測の酸化的リン酸化の解析と組み合わせてサポニン透過処理繊維の調製物は、ミトコンドリアの機能の統合的な評価を提供します。生理的および病的状態におけるミトコンドリア呼吸はミトコンドリアの相互作用、形態および生化学を含む様​​々な規制の影響を反映することができます。

ミトコンドリアはエネルギー代謝に関与しているため、ミトコンドリア機能の調査は心臓生理学における重要なパラメータとなります。

この手順の目的は、ポラログラフィック測定用にサポニン処理した心筋線維を調製することである。まず、マウスから心臓を摘出する。次に、最大6〜8本の線維が緩く連結した心筋線維束を機械的に調製する。次に、サポニンを用いて心筋束を化学的に透過処理します。その後、心筋束を洗浄し、サポニンおよび残存する代謝物を除去します。最終的に、ポーラリグラフィック測定を通じて、ミトコンドリアの酸化的にリン酸化に関する知見を得ることができます。こんにちは。カルガリー大学生物化学・分子生物学部、Jane Sheer博士の研究室のCurtis Hueyです。本日は、サポニン透過心筋線維の調製手順について解説します。当研究室では、この手法を用いてin situでのミトコンドリア酸化的リン酸化を評価しています。それでは始めましょう。本手順を開始するために、海洋生物の心臓を取り出し、氷上のRP溶液が入ったペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡を用いて、結合組織や脂肪を慎重に除去してください。心臓を中隔に沿って半分に切断し、左心室の内膜表面から組織を10～25 mg（湿重量）切り出して採取します。心筋への機械的損傷を最小限に抑えるため、切開は繊維の走行方向に沿って行うようにしてください。切り出した組織のサブサンプルを、氷上のRP溶液が入った別のペトリ皿に入れます。心臓を繊維の走行に沿って、直径1〜1.5 mmの縦方向のストリップ状に切断します。鋭利なピンセットを使用し、細心の注意を払って、メスでストリップを2〜4 mmの長さに切り詰めます。その後、機械的に繊維束を分離します。最終的な心筋線維束は、小さな接触部位で連結された最大6〜8本の線維を含み、湿重量で1〜3 mgである必要があります。視覚的には、心臓組織の色が元の赤色から淡いピンク色に変化しているはずです。12ウェルプレートを氷上に置き、心筋線維束の調製を開始します。カルシウムによる汚染を最小限に抑えるため、ウェルをRP溶液で洗浄します。50 µg/mLのサポニンを含む氷冷RP溶液3 mLをウェルの1つに加えます。その後、機械的に調製した繊維束をそのウェルに転移させます。繊維束を氷上で緩やかに撹拌しながら20分間インキュベートします。新しいウェルをmirror five溶液でリンスし、氷冷したmirror five溶液10 millilitersを新しいウェルにピペットで分注します。心筋繊維束をそのウェルに移し、氷上で緩やかに撹拌しながら10分間インキュベートします。インキュベーション後、mirror fiveによる洗浄を5回繰り返します。新鮮なmirror fiveを用いて2〜3回洗浄します。その後、心臓束を氷冷した10 mLのmirror fiveに各回移します。反復的な洗浄ステップは、呼吸分析の直前に、サポニン、A-T-P-A-D-P、および残存する基質を繊維束から確実に除去するためのものです。ピンセットで個々の繊維束を吸収性表面に押し当て、5秒間、またはすべての水分が吸収されるまで保持することで、繊維束の湿重量を測定します。別の吸収性表面を使用して、ピンセットから余分な液体を取り除きます。秤を風袋引きし、質量測定のためプラスチック製ウェルに心筋線維束を置きます。心筋線維束を、氷冷したnear fiveを含む新しいウェルに移します。これで、心筋線維束の酸素消費量測定の準備が整いました。以下のバリデーション滴定は、2チャンバー滴定注入XIグラフを用いて行われます。これらの実験は、呼吸バロメトリー研究の実験的および診断的な目的に応じて、個別のプロトコルとして実施するか、あるいは滴定プロトコルに組み込んで実施することができます。ここで使用するERO GRA 2Kは、酸素濃度を測定することが可能です。装置はDATラボソフトウェアを搭載したコンピュータに接続されており、実験期間中、酸素濃度の変化をリアルタイムの酸素消費量測定値として報告することが可能です。鏡像心筋線維をXIグラフトチャンバーに配置する前に、ポラログラフ式酸素センサー（POS）が収められているチャンバーハウジングにMirror 5を2.1 milliliters加えます。チャンバーを閉じると、XIグラフトチャンバー内には2 millilitersのMirror 5が存在することになります。37 °CでMirror fiveの空気飽和と平衡化に十分な時間をかけます。平衡に達した後、心筋線維サンプルを、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）コーティングされた攪拌子で攪拌されるXI graft chamber内のMirror fiveに配置します。酸素を満たしたシリンジを用いて、GRATチャンバーの酸素濃度を250〜550 µMに上昇させます。10 µLのHamiltonシリンジを使用し、酸素濃度が安定するまで5〜10分間待ちます。その後、最終濃度が10 mMとなるように、2 Mのグルタミン酸を10 µLチャンバーに添加します。次に、別のハミルトンシリンジを使用して、チャンバー内の最終濃度が2 mMとなるように800 mMのマレートを5 µL添加します。この滴定は、複合体Iによる基底呼吸を決定するために行われます。酸素フラックスは滴定後約5分以内に安定し、これによりステート2の酸素消費量（すなわち酸素消費速度）を決定することができます。2～5分間の安定した酸素消費の後、DPが認められない場合は、25 µLのHamiltonマイクロシリンジを用いて500 mM A DPを20 µL添加し、最終飽和濃度を5 mMにします。この濃度は90%以上の飽和状態に達するために使用され、これにより最大状態の決定が可能になります。3. 複合体Iを介したミトコンドリア呼吸により、さらに2～5分間の安定した酸素消費を維持させます。次に、10 µLのHamiltonマイクロシリンジを用いて、最終濃度が10 µMとなるように4 mMのcytochrome Cを5 µL添加します。この時点での酸素濃度は、ミトコンドリア外膜の完全性の品質管理分析に使用されます。さらに2〜5分間、酸素消費が安定した後、TP synthaseを阻害するために4 mg/mLのACINを1 µL添加します。この滴定ステップは、ミトコンドリア内膜の完全性を検証するために用いられます。レスピロメトリックなoxphos評価の後、乾燥重量またはミトコンドリアマーカーの測定用にサンプルを回収してください。その後、XI Gratのガラスチャンバーからミラー5を取り除きます。蒸留水でチャンバーを少なくとも3回洗浄します。続いて、100% ethanolでさらに少なくとも3回洗浄してください。これは、oligo mycinなどのエタノール可溶性阻害剤を除去するためです。続いて、70% ethanolでさらに2回洗浄します。次に、70% ethanolを加え、XIグラフトチャンバーを30分間浸漬させて滅菌します。最後に、POSを含むチャンバーを二回蒸留水で少なくとも5回洗浄します。適切に調製されたミラーリング心筋線維における酸素消費量は、図に示す品質管理プロトコルによって評価されます。呼吸制御比（RCR）は、透過処理した線維調製物における酸素消費と酸化剤的リン酸化の共役状態を表します。RCRとは、状態2に対する状態3の呼吸速度、あるいは状態4に対する状態3の呼吸速度のことである。良好にカップリングされた心臓調製物と同等の条件では、RCRは3から6の間となる。シトクロムCのタイトレーションは、組織調製が適切に行われたかを確認するための検証として用いられる。シトクロムCは、ミトコンドリア内膜の膜間腔に位置するタンパク質である。ミトコンドリアの外膜が健全な場合、内在性シトクロムCは膜間腔に留まり、外因性シトクロムCの滴定が呼吸に与える影響は無視できます。逆に、ミトコンドリアの外膜が損傷している場合、内在性シトクロムCが膜間腔から放出され、外因性シトクロムCを添加するまで呼吸が抑制されます。これにより、病理学的または実験的なストレス因子がミトコンドリア外膜の健全性に及ぼす影響を評価することが可能です。CINの添加は、DP（リン酸化）に寄与しない酸素消費量であるリーク呼吸の変化を評価するために用いられます。リン酸化コントロールまたは野生型線維は、CINの添加に感受性を持ち、酸素フラックスの著しい減少を示すはずです。RCRが低く、オリゴマイシンに対する感受性の低下により酸素フラックスが相対的に上昇していることは、調製中にミトコンドリア内膜が損傷したことを示しています。ここで見られるように、基質阻害剤およびアンカップラーの滴定に対する反応がない場合は、RPおよびmirror five溶液中でのsasinおよび皮膚を剥離した筋線維束のインキュベーション期間が長すぎた可能性があります。今後の取り組みでは、動物の屠殺から酸素消費量測定までの時間を最小限に抑えるべきです。ここまで、極座標グラフィック測定のための心筋線維束の調製方法について解説しました。この手順を行う際は、心筋線維を機械的に分離するときに細心の注意を払うことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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この研究は、ヒトの骨格筋におけるミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化）能力（OXPHOS）能力を定量化するin vivo phosphorus-31磁気共鳴分光法（31PMRS）技術の実現可能性を示しています。...

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツールインビボミトコンドリア酸化的リン酸化能力

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。...

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

ここでは、心壁全体で吸光度分光法を行うために、心内光カテーテルを通して心臓に注入された心臓に使用する方法を紹介する。得られたデータは、組織の酸素張力に関する堅牢な情報だけでなく、基板利用と膜電位に関する堅牢な情報を、このユビキタスな調製における心臓性能測定と同時に提供します。...

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。...

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。...

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

細胞外フラックスアッセイを用いた全再生ゼブラフィッシュ脳室の代謝活性をエクス ビブ で評価する

学ぶサポニン透過性心臓繊維の調製法と高分解能呼吸計測による酸化的リン酸化評価。マウス心臓組織を用いてミトコンドリア機能を正確に測定し、心臓バイオエネルギクス研究に応用可能です。

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

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