覚醒ラットにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

本手順の目的は、自由行動下の意識のあるラットにおけるインスリン感受性を評価することです。まず、左総頸動脈にカテーテルを留置します。次に、最適な結果を得るために、右頸静脈にカテーテルを留置します。

術後の5日間の回復期間中、開通性を維持するためにカテーテルを毎日フラッシュします。最終的に、高インスリン血症・正常血糖クランプ法により、全身のグルコース注入率に関する結果を得ることができます。この手法の主な利点は、生理的に高いインスリン濃度において、全身のグルコース消失率を直接測定できることです。

動脈および静脈カテーテルは、手術前に準備しておく必要があります。カテーテルの先端は鈍端とし、ヘパリン生理食塩水で満たし、エタノール滅菌を行います。また、固定用ビーズを、動脈カテーテルの場合は一方の端から2.7 cm、静脈カテーテルの場合は3.2 cmのところにしっかりと取り付けます。本手順では、体重約300 gの成体オスSDラットを使用します。

動物の開始時体重を記録し、この体重を用いて術後の体重増加をモニタリングします。無菌的な手術エリア内で作業を行います。ラットを麻酔ボックスに入れ、3%isof fluorineで麻酔をかけます。

動物を手術エリアに移動させ、首と肩の周囲の毛を刈り取って切開部位を準備します。除毛後、動物をノーズコーンに固定し、約2%のisof fluorineで麻酔を維持します。動物を手術台に固定してください。

足または目の反射を確認し、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。切開部位を70%ethanolで洗浄し、続いてベタジンで洗浄し、再度70%ethanolで洗浄します。手順の最初のステップとして、胸骨から10 millimeter上方に小さな正中縦切開を加えます。

曲がりマイクロ解剖用ピンセットを使用して、組織を鈍的に剥離し、左胸骨乳様筋を露出させます。この筋肉を翻転させ、左総頸動脈を約1 cm露出させます。頸動脈の下にマイクロ解剖用ピンセットを配置して固定し、結締組織を優しく取り除きます。

動脈または神経のいずれにも損傷を与えずに、迷走神経を動脈から分離することが重要です。滅菌済みの4-0シルク縫合糸を使用して、頭側端を結紮します。鋸歯付きマイクロ解剖用ピンセットで血管をクランプします。

結紮部位を穿刺します。21ゲージの静脈穿刺用マルチサンプルルアーアダプターを使用してください。カテーテルからステンレス製プラグを取り外し、滅菌済みカテーテル導入器を用いて動脈内に挿入します。

ピンセットを使用して、カテーテルが固定されていることを確認します。微小解剖用ピンセットを離し、動脈をクランプしながら、ビーズの位置までカテーテルを挿入し続けます。この時点で、カテーテルの先端は大動脈弓にあるはずです。

ビーズの下に2箇所、上に1箇所の結紮を行い、10 units/mLのヘパリン生理食塩水でラインをフラッシュします。カテーテルでサンプリングが可能であることを確認するため、カテーテルの外端をステンレス製プラグで再度塞ぎます。次に、組織を鈍的に剥離して右外頸静脈を露出し、静脈を慎重に単離して頭静脈を結紮します。

絹縫合糸で結紮します。21ゲージの針で静脈を穿刺します。マルチサンプルルアーアダプターを排出します。

カテーテルからステンレス製のプラグを取り外し、滅菌済みのカテーテル導入器を使用して、ビーズの位置まで挿入します。ビーズの下側に2本の縫合糸を、上側に1本の縫合糸を固定します。その後、10 units/mLのヘパリン配合生理食塩水でラインをフラッシュします。

カテーテルでサンプリングが可能であることを確認するため、14ゲージの鈍針を用いてカテーテルの外端をステンレス製プラグで再度塞ぎ、皮膚下にトンネルを作成して、肩甲骨の間の背面に切開を加えます。次に、カテーテルを針に通し、ラットの背面から出します。各カテーテルは約4cm見えるようにしてください。

Tigon S 50 HL 医療用チューブを0.5センチメートルに切り、体外に露出した両方のカテーテルの周囲に配置します。静脈側は青色のテープで、動脈側は赤色のテープで固定します。カテーテルの開通性を再確認し、凝血を防ぐため、150 units/mLのヘパリン加生理食塩水でフラッシュおよび充填を行います。

3-0シルク縫合糸を用いてすべての切開部を閉鎖します。ラットを、餌が容易に摂れるようにした、あらかじめ保温された清潔なケージの中の腹臥位で安置します。ラットが完全に歩行能力と覚醒を取り戻した後、ホームケージに戻します。

ラットを3〜5日間回復させ、感染、疼痛、および体重変化を毎日モニタリングします。研究期間を通じてカテーテルの開通性を維持することが重要です。手術後の毎日に、1 mLのスリップチップシリンジに150 units/mLのヘパリン含有生理食塩水を満たし、22Gの鈍針でキャップします。

鈍針を、他端に23ゲージのステンレス製チューブカプラーを備えた20 cmのPE 50チューブに挿入します。ラインからすべての気泡を完全に取り除いてください。ラットから体外に導出された動脈ラインを、プラグの直下で止血鉗子を用いてクランプします。

別の止血鉗子を用いて、スチール製のカテーテルプラグを取り除きます。シリンジに接続されたチューブカプラーを動脈ラインに挿入し、外在化した動脈カテーテルを遮断していた止血鉗子を解除します。次に、カテーテル内の動脈血をシリンジに吸引します。

カテーテルで容易に吸引できない場合は、チップの詰まりを解消するために、少量の溶液をカテーテルから非常にゆっくりと注入する必要があるかもしれません。これでカテーテルの疎通が完了したと考えられます。血液がシリンジクランプに達したら、1 mLシリンジに近いP 50チューブを閉じ、シリンジを廃棄してください。

新鮮なヘパリン生理食塩水を満たした新しいシリンジに交換します。チューブのクランプを解除し、新しいシリンジを直立させた状態で、シリンジを軽く叩いて気泡を上方に追い出し、ラインから遠ざけます。カテーテルライン内から血液が完全に取り除かれ、透明になるまでヘパリン生理食塩水を注入します。

チューブカプラーの直下で動脈ラインをクランプします。動脈カテーテルラインからシリンジコネクタを取り外し、ステンレス製チューブプラグに交換します。外在化した動脈カテーテルを閉塞させていた止血鉗子を解除します。

静脈ラインについてもこの手順を繰り返します。静脈圧が低いため、サンプリングが不可能な場合があります。一般的に、ヘパリン生理食塩水がほとんど抵抗なく注入できれば、カテーテルが静脈内に適切に留置されていると考えられます。

処置を開始する前に、動物の体重測定、溶液の調製、およびクランプ装置の組み立てを行う必要があります。動物の体重を測定し、カテーテルの開通性を確認した後、動きを制限するが妨げない程度の敷材を入れた小型の容器に動物を入れます。本研究で使用するラットは、少なくとも5時間絶食させ、術後の体重増加要件を満たしているものとします。ラットの体重によって、ここで必要となるインスリンの量を決定します。

4 mU/kg/minを2 µL/minの速度で投与します。50%デキストロース溶液を調製し、両方の溶液が約2時間持続する十分な量があることを確認してください。ここでは3 mLシリンジを使用します。これで、クランプ装置を組み立てる準備が整いました。

ここに示すように、ラインと輸液ポンプを設置します。グルコースとインスリンのシリンジをシリンジポンプに装着します。ラインをクランプし、実験を開始する前にラットを30分間安静にさせます。

手順を開始するために、ベースラインのインスリンおよびヘマトクリット試料を採取します。ヘマトクリットのサンプリングは、実験全体を通して血液量が維持されていることを確認するために行います。一般的に、ヘマトクリット値は初期値から10%を超えて低下してはいけません。ベースラインのグルコース試料を採取し、クランプするグルコース値を決定します。

ここでは、血糖値を5 mMにクランプします。凝固を防ぐため、血液サンプルを採取するたびに、10 units/mLのヘパリン生理食塩水を少量流して動脈ラインをフラッシュしてください。クランプする血糖値が決定した後、インスリン溶液の注入を開始します。

5〜10分間隔で血糖値を記録し、定常状態に達するまで必要に応じてブドウ糖注入速度を調整します。これは通常、試行錯誤のプロセスであり、30分から2時間以上かかる場合があります。血糖値を維持するために必要なブドウ糖濃度は、実験プロトコルによって異なります。

クランプ状態とみなされるためには、3回連続の測定値が定義された範囲内に収まる必要があります。約1 millimolarの範囲内で3回の測定値が得られた場合、血糖値が定常状態に達したことを意味します。30分間の血糖値を維持するために必要なグルコース注入速度を算出し、この間に少なくとも追加の血液サンプルを採取することができます。

クランプ処置が完了した後、2回目の血漿インスリンおよびヘマトクリット検体を採取します。動物はさらなる試験に使用するか、あるいは安楽死させて組織を採取し、さらなる分析に用います。正しく実施されていれば、動物のカテーテルラインは5日から7日間開通状態を維持できます。

クランプ法により、定常状態におけるインスリン感受性を測定できます。インスリンおよびグルコース濃度に加えて、グルコース注入速度およびヘマトクリット値を記録することが不可欠です。30分間の期間において、グルコース濃度が互いに1 mM以内に維持されたとき、定常状態に達したとみなされます。

グルコース注入速度は、血糖値を維持するために必要な外因性グルコースのレベルを示します。可能な限り、単一の平均時間点ではなく、時間経過に伴う速度の変化をグラフ化する必要があります。空腹時およびクランプ時のインスリンレベルの両方を報告してください。これらの測定値により、インスリンが正常に投与されたことが確認され、治療群間でのインスリン反応の差を検出できます。ベースライン時および処置後にヘマトクリット値を測定することで、実験過程においてレベルがベースラインから5%を超えて低下していないことを確認します。

全身および組織特異的なグルコース利用を評価するために、同位体トレーサー投与などの他の手法を用いる場合があります。