覚醒ラットにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

この手順の全体的な目的は、意識下で拘束されていないラットのインスリン感受性を評価することです。これは、まず左総頸動脈にカテーテルを留置し、次に最適な結果を得るために右頸静脈にカテーテルを留置することによって達成されます。

術後5日間の回復期間中、開通性を維持するためにカテーテルを毎日フラッシュします。最終的に、高インスリン血症正常血糖クランプ法により、全身のグルコース注入率に関する結果を得ることができます。この手法の主な利点は、高い生理学的インスリン濃度において、全身のグルコース処理率を直接測定できることです。

動脈および静脈カテーテルは、手術 procedure の前に準備しておく必要があります。カテーテルの先端は鈍端とし、ヘパリン生理食塩水で満たし、エタノール滅菌を行います。また、固定用のビーズを、動脈カテーテルの場合は端から 2.7 cm、静脈カテーテルの場合は 3.2 cm の位置にしっかりと取り付けておきます。本手順では、体重約 300 g の成体雄 Sprague-Dawley ラットを使用します。

動物の開始時の体重を記録し、この体重を用いて術後の体重増加をモニタリングします。無菌的な手術区域で作業を行います。ラットを麻酔ボックスに入れ、3% isof fluorineで麻酔をかけます。

動物を術野から移動させ、首と肩の周囲の毛を除去して切開部位を準備します。除毛後、動物をノーズコーンにセットし、約2%のisof fluorineで麻酔を維持します。動物を手術台に固定してください。

足または目の反射を確認し、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。切開部位を70% ethanolで洗浄し、続いてBetadineで擦式消毒を行い、再度70% ethanolで洗浄します。手順の最初のステップとして、胸骨から10 millimeter上方に小さな垂直正中切開を加えます。

曲がったマイクロ解剖用ピンセットを使用して組織を鈍的に剥離し、左胸骨乳突筋を露出させます。この筋肉を翻転させ、左総頸動脈を約1 cm露出させます。頸動脈の下にマイクロ解剖用ピンセットを置いて固定し、結合組織を慎重に除去します。

動脈と神経の両方を損傷させることなく、迷走神経を動脈から分離することが重要です。滅菌済みの4-0シルク縫合糸を使用して頭側端を結紮します。その後、鋸歯状のマイクロ解剖鉗子で血管をクランプします。

結紮した部位を穿刺します。21ゲージの静脈注入マルチサンプルルアーアダプターを使用してください。カテーテルからステンレス製プラグを取り外し、滅菌済みカテーテル導入器を用いて動脈内に誘導します。

鉗子を使用して、カテーテルが固定されていることを確認します。部分的にマイクロ解剖鉗子を離し、動脈をクランプしながら、ビーズの位置までカテーテルを挿入し続けます。この時点で、カテーテルの先端は大動脈弓にあるはずです。

ビーズの下に2箇所、上に1箇所の結紮糸で固定し、10 units/mLのヘパリン生理食塩水でラインをフラッシュします。カテーテルでサンプリングが可能であることを確認するため、カテーテルの外端をステンレス製プラグで再度塞ぎます。次に、組織を鈍的に剥離して右外頸静脈を露出し、静脈を慎重に単離して頭静脈を結紮します。

絹縫合糸で結紮します。21ゲージの針で静脈を穿刺します。マルチサンプルルアーアダプターを装着します。

カテーテルからステンレス製プラグを取り外し、滅菌済みカテーテル導入器を用いてビーズの位置まで挿入します。ビーズの下側に2本の縫合糸を、上側に1本の縫合糸を固定します。その後、10 units/mLのヘパリン生理食塩水（氷冷）でラインをフラッシュします。

カテーテルでサンプリングが可能であることを確認するため、14ゲージの鈍針を用いてカテーテルの外端をステンレス製プラグで再び塞ぎ、皮膚下をトンネル状に通り、肩甲骨の間の背部に切開を加えます。次に、カテーテルを針に通し、ラットの背中から出るようにします。各カテーテルは約4cm見えるようにしてください。

Tigon S 50 HL医療用チューブを0.5 centimetersに切り、外に出した両方のカテーテルの周囲に配置します。静脈側は青色のテープで、動脈側は赤色のテープで固定します。カテーテルの開通性を再確認し、その後、凝血を防ぐために150 units per milliliterのヘパリン生理食塩水でフラッシュおよび充填を行います。

すべての切開部を3-0シルク縫合糸で閉鎖します。あらかじめ温めておいた清潔なケージに、餌を簡単に摂取できる状態でラットを腹臥位で安置します。ラットが完全に歩行能力と覚醒状態を取り戻した後、ホームケージに戻します。

ラットを3〜5日間回復させ、感染、疼痛、および体重の変化を毎日モニタリングします。研究期間を通じてカテーテルの開通性を維持することが重要です。手術後の毎日、1 mLのスリップチップシリンジに150 units/mLのヘパリン生理食塩水を充填し、22ゲージの鈍針でキャップします。

鈍針を、もう一方の端に23ゲージのステンレス製チューブカプラーを備えた20 cmのPE 50チューブに挿入します。ラインからすべての気泡を完全に取り除いてください。ラットから外在化させた動脈ラインを、プラグの直下で止血鉗子を用いてクランプします。

別の止血鉗子を用いて、スチール製のカテーテルプラグを取り除きます。シリンジに接続したチューブカプラーを動脈ラインに挿入し、外在化した動脈カテーテルを遮断していた止血鉗子を解除します。次に、カテーテル内の動脈血をシリンジに吸引します。

カテーテルで容易に吸引できない場合は、先端の詰まりを解消するために、少量の溶液をカテーテルから非常にゆっくりと注入する必要があるかもしれません。これでカテーテルは開通したと考えられます。血液がシリンジクランプに到達したら、1 mLシリンジに近いP 50チューブを閉じ、シリンジを廃棄してください。

新鮮なヘパリン生理食塩水を満たした新しいシリンジに交換します。チューブのクランプを外し、新しいシリンジを垂直に保持したまま、シリンジを軽く叩いて気泡を上方向へ、ラインから遠ざけるように移動させます。カテーテルライン内の血液が消失し、クリアになるまでヘパリン生理食塩水を注入します。

チューブカプラーの直下で動脈ラインをクランプします。動脈カテーテルラインからシリンジコネクターを取り外し、ステンレス製チューブプラグに交換します。外在化した動脈カテーテルを遮断していた止血鉗子を解除します。

この手順を静脈ラインでも繰り返します。静脈圧が低いため、サンプリングが不可能な場合があります。一般的に、ヘパリン生理食塩水を最小限の抵抗で注入できれば、カテーテルは静脈内に適切に留置されていると考えられます。

手順を開始する前に、動物の体重測定、溶液の調製、およびクランプ装置の組み立てを行う必要があります。動物の体重を測定し、カテーテルの開通性を確認した後、動きを制限するが妨げない程度の敷材を入れた小さな容器に動物を入れます。本研究で使用するラットは、少なくとも5時間の絶食を行い、術後の体重増加条件を満たしているものとします。ラットの体重によって、ここで必要となるインスリンの量が決定されます。

4 mU/kg/minを2 µL/minの速度で投与します。50% dextrose溶液を調製し、両方の溶液が約2時間分十分にあることを確認してください。ここでは3 mLシリンジを使用します。これで、クランプ装置を組み立てる準備が整いました。

ここに示すように、ラインと輸液ポンプをセットアップします。グルコースとインスリンのシリンジをシリンジポンプに装着します。ラインをクランプし、実験を開始する前にラットを30分間安静にさせます。

手順を開始するために、ベースラインのインスリンおよびヘマトクリットサンプルを採取します。ヘマトクリットサンプリングは、実験を通じて血流量が維持されていることを確認するために行います。一般的に、ヘマトクリット値は初期値から10%を超えて低下してはいけません。ベースラインのグルコースサンプルを採取し、クランプするグルコースレベルを決定します。

ここでは、血糖値を5 mMにクランプします。血液サンプリングを行うたびに、凝固を防ぐため、10 units/mLのヘパリン生理食塩水を少量流して動脈ラインをフラッシュしてください。クランプする血糖値が決定した後、インスリン溶液の注入を開始します。

5〜10分間隔で血糖値を測定し、定常状態に達するまで必要に応じてグルコース注入速度を調整します。これは一般的に試行錯誤のプロセスであり、30分から2時間以上かかる場合があります。血糖値を維持するために必要なグルコース濃度は、実験プロトコルによって異なります。

クランプ状態とみなされるためには、3回連続の測定値が定義された範囲内に収まる必要があります。約1 mMの範囲内で3回の測定値が得られた場合、血糖値が定常状態に達したことを意味します。30分間血糖値を維持するために必要なグルコース注入速度を記録し、この期間中に少なくとも追加の血液サンプルを採取することができます。

クランプ procedure の完了後、2回目の血漿インスリンおよびヘマトクリット検体を採取してください。動物はさらなる試験に使用するか、あるいは安楽死させて組織を回収し、さらなる分析に用いることができます。適切に実施された場合、動物によってはカテーテルラインを5〜7日間開通させたままにすることが可能です。

クランプ法を用いることで、定常状態のインスリン感受性を測定できます。インスリンおよびグルコース濃度に加え、グルコース注入速度とヘマトクリット値を記録することが不可欠です。30分間の期間において、グルコース濃度が互いに1 mmol/L以内に維持されたときに、定常状態に達したとみなされます。

グルコース注入速度は、血糖値を維持するために必要な外因性グルコースの量を示しており、可能な限り単一の平均時点ではなく、時間経過に伴う速度としてグラフ化する必要があります。空腹時およびクランプ時のインスリンレベルの両方を報告してください。これらの測定により、インスリンが正常に投与されたことが確認でき、治療群間でのインスリン反応の差異を検出することが可能になります。また、ベースライン時および処置後にヘマトクリット値を測定することで、実験期間を通じてレベルがベースラインから5%以上低下していないことを確認します。

全身および組織特異的なグルコース利用能を評価するために、同位体トレーサー投与などの他の手法を用いることができます。