蚊の中腸から細菌の分離

まず、リン酸塩緩衝食塩水またはPBSの滴に麻酔をかけた成虫蚊を入れたスライドから始めます。

解剖顕微鏡で蚊の脚、翼、頭部を取り除きます。

消化管を傷つけないように腹部の先端を切り落としてください。

胸部と腹部の端を固定し、消化管を優しく引き出して取り出します。

抽出された消化管には消化を担う中腸が含まれ、蚊の生理に影響を与える多様な腸内細菌を保有しています。

高倍率では、周囲の構造物を慎重に取り除き、中腸を隔離してください。

分離した中腸を新しいPBS入りチューブに移します。

中腸を均質化して細菌をPBSに放出します。

希釈したホモジネートを栄養寒天プレートに広げます。

盤を培養して、蚊の腸中部の微生物群を代表する細菌コロニーの成長を促します。

PBSの滴入した滅菌ガラススライドで蚊を別々に解剖します。鉗子を使って蚊の脚、翼、頭を慎重に取り除いてください。

蚊の胸と腹部の最後の部分を鉗子で挟み、消化管を隔離するために引き離してください。

鉗子を使ってクロップとマルピギ管を消化管から取り除きます。砂糖水を摂取した後、作物は中腸の前方に位置し、膨らみを生みます。マルピギ管は、中腸と後腸の接合部にある細長い排泄管の群です。

解剖した中腸を200マイクロリットルの無菌PBSバッファー入りEPチューブに入れ、超クリーンな作業台で滅菌粉砕棒で挽きます。ホモジネートを連続的に3回、各希釈10倍の希釈でLB寒天プレートに、そして広げて薄めます。

プレートを37度で1〜2日間孵化し、単一の群れが見えるまで続けます。