ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死のライブ画像

まず、蛍光標識マクロファージを発現させたトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を、低融解アガロースにイメージング皿にマウントします。

これらの胚は、筋肉内顕微注射を中脳に施し、蛍光標識された マリウム菌 に感染させ、局所免疫応答を開始します。

麻酔薬を含む胚培地を固化させて麻酔を維持し、色素沈着を抑制する化学的阻害剤を塗り、画像撮影のための光学的鮮明さを確保します。

高解像度共焦点顕微鏡の環境室に皿を置きます。

明視野照明を使って感染部位を特定してください。

蛍光レーザーチャネルを起動し、Zスタックの開始・終了位置を設定し、タイムラプス撮影を開始します。

蛍光菌で満たされた感染したマクロファージが丸く動きなくなる様子をイメージしてください。

これは細胞骨格の崩壊と溶解細胞死の開始を示しています。

時間が経つにつれてマクロファージは膨らみ破裂し、細胞質内容物や内部化された細菌を周囲組織に放出し、炎症性溶解細胞死の特徴となります。

アガロースが完全に固まったら、卵水の層を一層かけます。環境チャンバーを設置した後、35ミリのガラス底皿とゼブラフィッシュを環境チャンバーに入れます。405ダイオード、20%出力のアルゴン、DPSS 561ナノメートルレーザーを開けてください。スペクトル設定で適切なレーザー出力を設定してください。

「XYZ」「シーケンシャルスキャン」取得モードを選択し、画像フォーマットを「512×512ピクセル」に設定します。「ライブデータモード」に切り替え、最初のゼブラフィッシュの位置をターゲットにし、「開始」と「終了」Zの位置をマークしてください。このプロセスを残った胚すべてで繰り返します。プログラムの最後に「一時停止」を追加してください。プログラムのループとサイクルを定義し、ファイルを保存します。