マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ
2011年1月30日
アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。
この手順の全体的な目的は、マイクロタイタープレート内でバイオフィルムを形成させ、解析することです。まず、96ウェルプレートに細菌培養液を添加します。次に、使用する微生物に応じて適切な温度と時間で培養し、バイオフィルムを染色します。
細菌が入った各ウェルにクリスタルバイオレットを添加し、その後、細菌を洗浄します。最後に、ウェルを撮影し、細菌を定量します。最終的に、クリスタルバイオレットの測定を通じて、時間経過に伴うバイオフィルムの蓄積と形成を示す結果を得ることができます。
この方法の主な利点は、細菌や真菌におけるバイオフィルム形成を迅速に評価できることです。また、ハイスループットな遺伝学的スクリーニングや、バイオフィルム形成を抑制する新規治療化合物の特定にも活用できます。野生型のpseudomonas、aerogen、または変異株の5 mL overnight培養液を調製します。
LB培地を用いて、10 µLの培養液を、マグネシウム、硫酸塩、グルコース、およびカシノ酸を添加した新鮮なM 63最小培地1 mLに希釈します。次に、ピペットを用いて、希釈した培養液100 µLを96ウェル丸底プレートの各ウェルに分注します。プレートを37 °Cで4〜24時間インキュベートし、バイオフィルムを成長させます。
バイオフィルムが形成されたら、プレートをインキュベーターから取り出し、プレートを逆さまにして振って培養上清を捨てます。次に、プレートを少量の水が入った小さな容器にそっと浸し、背景染色の原因となる未結合の細胞や培地成分を洗い流します。水を振り切り、プレートの水分を吸い取ってから、洗浄を繰り返します。
プレートを洗浄した後、各ウェルに0.1%クリスタルバイオレット溶液を125 µLずつ加えます。細胞を染色するため、プレートを室温で10〜15分間インキュベートします。
その後、前述の手順に従ってプレートを3〜4回洗浄します。最終洗浄後、ペーパータオルの束でプレートを強く吸い取り、余分な液体を除去してから、プレートを逆さまに置いて数時間乾燥させます。プレートが乾燥したら、デジタルカメラでウェルを撮影し、バイオフィルムの質を評価します。
ここに示すように、左側のpseudomonas aerogenや右側のpseudomonas fluorescenceなどの運動性細菌は、バイオフィルムの成長過程において気液界面にバイオフィルムを形成する傾向があります。対照的に、非運動性細菌であるstaphylococcus oraは、ウェルの底にバイオフィルムを形成します。バイオフィルムを定量化するには、まず、酢酸のみを含むブランクウェルを含め、各ウェルに30%酢酸を125 µL加え、室温で10～15分間インキュベートして、バイオフィルムに保持されたクリスタルバイオレットを可溶化させます。
次に、各ウェルから125 µLの溶解済み染色液を、新しい平底96ウェルマイクロタイタープレートに移します。プレートリーダーを用いて、波長550 nmで各ウェルの吸光度を定量します。各ウェルにおけるクリスタルバイオレットの濃度は、バイオフィルム内の細胞数に比例します。
このグラフは、37 °Cでの培養期間中におけるPseudomonas fluorescenceによるバイオフィルムの形成および蓄積の定量結果を示しています。このビデオを視聴することで、顕微鏡観察などの他の手法と併用される96ウェルプレートを用いたバイオフィルムアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手法は、バイオフィルム形成の理解に大きく寄与します。
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概要
本アッセイでは、マイクロタイタープレートを用いて細菌および真菌の初期バイオフィルム形成を測定する迅速な手法について説明します。バイオフィルムはクリスタルバイオレット染色によって可視化され、定性的および定量的な分析の両方が可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- バイオフィルム研究
- アッセイ開発
背景
- バイオフィルムは、表面に付着した微生物の集合体である。
- バイオフィルム形成の研究は、微生物の挙動を理解する上で極めて重要である。
- クリスタルバイオレットは、バイオフィルムを可視化するために一般的に使用される染料である。
- この手法により、バイオフィルムの発達を迅速に評価することが可能となる。
研究目的
- 初期のバイオフィルム形成を評価するための信頼性の高いアッセイを確立すること。
- バイオフィルムの蓄積を時間経過とともに定量化すること。
- バイオフィルム内における微生物間の相互作用の研究を促進すること。
使用した方法
- 細菌培養液を96ウェルマイクロタイタープレートに分注する。
- 適切な温度と時間で培養液をインキュベートする。
- クリスタルバイオレットを添加し、バイオフィルムを染色する。
- ウェルを洗浄し、バイオフィルム形成量を定量するために写真撮影を行う。
主な結果
- 結果は、時間経過に伴うバイオフィルムの蓄積を示しています。
- クリスタルバイオレット測定により、定量的なデータを取得できます。
- このアッセイにより、バイオフィルム形成を明確に可視化できます。
結論
- この手法は、初期のバイオフィルム形成を研究するのに有効です。
- さまざまな細菌種および真菌種に適用可能です。
- 本アッセイにより、微生物バイオフィルムのダイナミクスへの理解が深まります。
よくある質問
産業界への活用意義
マイクロタイタープレートを用いたバイオフィルム形成アッセイは、バイオフィルム形成の初期段階を迅速かつハイスループットに評価することを可能にし、抗菌薬探索におけるターゲット検証を支援します。クリスタルバイオレット染色によりバイオフィルムの蓄積量を定量化することで、微生物の付着および定着を標的とした治療候補物質のリスク低減に寄与する、再現性のある定量データが得られます。このスケールアップ可能な手法は、細菌および真菌のさまざまな系に適用可能であり、バイオフィルム調節化合物の初期スクリーニングを促進します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期段階の発見およびターゲット検証
- 科学的価値：アドヘシン、ピリ、cyclic-di-GMP経路など、バイオフィルム形成の開始に必要な遺伝子や因子を特定することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：標準化された条件下での微生物株を用いた機能喪失スクリーンにより、機能的なターゲットの検証を可能にする。
- 予測的価値：バイオフィルムの早期形成を抑制する化合物と、効果のない化合物を区別することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングとアッセイ開発
- 科学的価値：再現性のあるバイオフィルム形成指標を確立することにより、後続の化合物スクリーニングに向けた検証済みの微生物システムを準備します。
- 運用の価値：96ウェルプレート形式を用いた標準的なインキュベーション、染色、および定量ステップを通じて、アッセイの標準化を実現します。
- 拡張性：複数の微生物株にわたる遺伝学的スクリーニングや化合物ライブラリへの適用に向けた、スクリーニングへの準備状況およびプラットフォームの再利用性を強調します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな関連性： 初期バイオフィルム形成データと表現型の耐性プロファイルを結びつけることで、抗菌候補物質のメカニズム的なリスク低減を支援します。
- 前臨床の継続性： インビトロでのバイオフィルム抑制と、抗生物質および免疫エフェクターに対する耐性を関連付けることで、リスク調整に基づいた進展決定を可能にします。
- バイオマーカーの整合性： バイオフィルム関連の耐性表現型と相関する定量可能なアウトプットを通じて、トランスレーショナルなバイオマーカーの開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、ターゲットの同定からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特にバイオフィルム介在性耐性を標的とした抗感染症プログラムに有用です。
- 基礎生物学：遺伝的および化学的な摂動を通じて、微生物の接着およびバイオフィルム形成経路の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：標準化されたバイオフィルム形成およびクリスタルバイオレット定量法によるアッセイの準備について記述し、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- 分析：550 nmでの定量的吸光度測定を強調し、異なる条件や菌株間でのバイオフィルムバイオマスの比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：慢性的感染症で観察される耐性メカニズムをモデル化することで、初期のバイオフィルム抑制データを前臨床的な関連性と結びつけます。
- 企業での再利用：本手法を、複数の病原体モデルにわたる抗微生物剤、抗真菌剤、および抗バイオフィルムプログラムのための再利用可能なスクリーニングプラットフォームとして位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：遺伝的または薬理学的介入によるバイオフィルム形成の測定可能な減少を通じて、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：96ウェルフォーマットによる標準化、再現性、および拡張性を確保し、ハイスループットアプリケーションへの適用を可能にする。
- 戦略的価値：直交的なバイオフィルム定量化により偽陽性を減少させ、リード化合物同定におけるGo/No-go判断の精度を高める。
- ポートフォリオへの影響：初期バイオフィルム形成の用量依存的な抑制に基づき、リスク調整済みの化合物優先順位付けを行う。
実施上の考慮事項
- 無菌操作、培養調製、およびバイオフィルムの取り扱いに関する微生物学的な専門知識が必要です。
- 550 nmでの吸光度測定が可能なプレートリーダーおよび標準的な96ウェルマイクロタイタープレートへのアクセスが必要です。
- ウェル間のばらつきを最小限に抑えるため、インキュベーション時間、洗浄ステップ、および染色プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 非モデル生物や、接着特性の異なる真菌に拡張する際の適応上の検討事項が含まれます。
- 出典に記載されている通り、成熟したバイオフィルム構造や流れに依存する表現型のモデル化が不可能であるなどの実用的な制限が含まれます。
